一种i型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及兽用生物制品技术领域，具体设及一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备 方法。
【背景技术】
[000引鸭病毒性肝炎值uck Virus化patitis，DVH)是由小RNA病毒科肠病毒属的鸭肝 炎病毒值uck ifepatitis Virus, DHV)引起维鸭的一种急性、高度致死性、烈性传染病。其 特征为病鸭疫李、头向背部后仰、呈角弓反张特异姿势。主要病变特点为肝脏肿大，有大小 不等的出血斑、出血点。鸭肝炎病毒有血清型I型、II型和III型，Ξ个型之间没有抗原相关 性。W往在我国流行的主要是I型鸭肝炎病毒，但近几年来，不断有使用I型鸭肝炎弱毒疫 苗或高免卵黄抗体进行预防或治疗无效的鸭群爆发疑似鸭肝炎，怀疑为新型鸭肝炎。本病 在国内维鸭群中频频发生，给养殖户带来了极大的经济损失。
[0003] 卵黄抗体的形成过程是：当机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成 为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体（主要是IgG)在 卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体，IgG移行进入卵细胞是受体作用的结果，因而IgG可在 卵细胞中大量蓄积，浓度高于血液中的IgG。
[0004] 卵黄抗体浓度高于血清IgG,单个卵黄（约15ml)含200mg左右的卵黄抗体，而且 从卵黄中提取抗体较从动物血清中提取抗体简便。除此之外卵黄抗体还有许多重要的理化 特性，卵黄抗体在多种环境中有较高的稳定性，在低于75Γ的条件下，卵黄抗体具有良好的 热稳定性，90°C处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在PH<4时，仅有少量卵黄抗 体失去活性。在pH4~12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，在pH〉12时，卵黄抗体迅 速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗 原结合活性几乎不受影响。在室溫下可保存6个月，4°C保存可达5年W上，活性仅下降5% 左右。
[0005] 对于鸭病毒性肝炎的预防和治疗，目前除了加强消毒和疫苗免疫外，抗体免疫也 在控制该病的流行中发挥着重要作用。由于卵黄抗体成本比较低且比较容易获得，所W已 广泛使用于一些疾病的预防和治疗。但由于卵黄中含有大量的脂质，若在制备环节中去除 不彻底则容易导致使用后发生不良反应，因此卵黄抗体生产工艺中如何除脂成为影响产品 品质和安全性的关键环节，现有技术中常用的纯化方法有聚乙二醇法、硫酸葡聚糖法、有机 溶剂法、水稀释法、辛酸法等，目前实际应用中显示其脂类去除率仍有待提升。此外，上述方 法所纯化得到的卵黄抗体效价不高，在一定程度上制约了疗效。
【发明内容】
[0006]本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方 法，W解决现有技术中相关方法所制备的卵黄抗体中脂类残留量较高的技术问题。
[0007]本发明要解决的另一技术问题是现有技术的相关方法所制备的卵黄抗体效价较 低。
[0008] 为实现W上技术目的，本发明采用W下技术方案：
[000引一种I型鸭肝炎精制卵黄抗体制备方法，包括W下步骤：
[0010] 1)取I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋卵黄，揽拌均匀得到卵黄液；
[0011] 。将步骤1)所述卵黄液与水按1: (0. 5~1.W(v/v)比例混合，揽拌均匀后得到 卵黄稀释液，于60~65°C条件下保溫25~35min;
[0012] 3)向卵黄稀释液中加入所述卵黄液体积2. 5~3. 5倍的醋酸盐缓冲液，揽拌后滤 布过滤收集滤液；
[0013]4)向步骤3)所述滤液中加入辛酸至终浓度3. 5~4. 5% (v/v)，揽拌后于2~8°C 放置4~8小时；
[0014] 5)取步骤4)放置后的溶液过滤至滤液澄清，收集澄清滤液；
[0015]6)取步骤5)所述澄清滤液过滤除菌，而后加入甲醒至终浓度0. 1 % (v/v)，于 35~37°C灭活12~20h。
[0016] 作为优选，步骤1)所述的高免鸡蛋是利用I型鸭肝炎病毒疫苗分4次免疫母鸡后 所产鸡蛋，每次免疫间隔2周；进一步优选的，所述免疫是颈部皮下或肌肉注射I型鸭肝炎 病毒疫苗。
[0017] 作为优选，步骤1)所述I型鸭肝炎病毒高免鸡蛋的卵黄中，I型鸭肝炎病毒抗体 效价不低于1:1024。
[0018] 作为优选，步骤1)中先对所述高免鸡蛋蛋壳消毒，而后再取卵黄；进一步优选的， 所述消毒方法是先W1%的新洁尔灭溶液中浸泡消毒15min，蛋壳干燥后再喷洒75%酒精 至蛋壳表面。
[0019] 作为优选，步骤1)中所述的水是先于80°C保持30min，而后冷却至65°CW下的注 射水。
[0020] 作为优选，步骤2)所述的醋酸盐缓冲液抑是4. 8~5. 2,更优的是5. 0。
[0021] 作为优选，步骤3)所述的揽拌，其持续是30~120min，更优的是90min。
[0022] 作为优选，步骤3)所述的滤布是丙绝750B滤布。
[0023] 作为优选，步骤4)所说的揽拌，其持续时间是30~120min，更优的是90min。
[0024] 作为优选，步骤5)所述的过滤是先W滤布过滤，而后再W滤膜过滤至滤液澄清； 进一步优选的，所述滤布是丙绝750B滤布。
[0025] 作为优选，步骤6)中用于过滤除菌的滤膜孔径为0.22μm。
[0026] 作为优选，步骤6)除菌后的澄清滤液中I型鸭肝炎病毒抗体效价不低于1:512。
[0027] 作为优选，步骤6)中除菌后先进行超滤浓缩，而后再加入甲醒灭活；进一步优选 的，所述超滤浓缩是利用30~50KD的PES中空纤维超滤膜实现的；进一步优选的，所述浓 缩是在2~8Γ条件下进行的。
[0028]在W上技术方案中，收集高免鸡蛋卵黄后先进行初步灭活，而后W醋酸盐缓冲液 进行初步酸化萃提，再W辛酸作为灭活剂和萃提剂进行二次灭活，在此基础上进行过滤澄 清、过滤除菌，最后经超滤浓缩后W甲醒进行Ξ次灭活，最终得到卵黄抗体溶液。W上通过 酸化水-辛酸方法有效降低了产品中脂类的含量，降低了不良反应风险，同时超滤浓缩步 骤有助于保证产品抗体效价，提升保护率；较高的抗体效价在未来使用环节需要较高的稀 释倍数，从而间接降低了杂质含量，进而提升安全性。
[0029] 此外，本发明通过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定工作， 最终筛选得到免疫原性较好的I型鸭肝炎病毒皿-34株，选用该毒株作为抗原制备疫苗再 用于本发明卵黄抗体的制备，所得产品效价高，保护率突出。
【具体实施方式】
[0030] W下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 W下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0031] W下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情 况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准 确数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的 范围内变化，比如，"大约100"表示的可W是90到110之间的任何数值。此外，在"大约第 一数值到第二数值"的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近 似性语言可能与测量仪器的精度有关。
[0032]除有定义外，W下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。
[0033] W下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法；W下实施例中的定量试验，均设置Ξ次重复实验，结果 取平均值；W下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0034] 实施例1
[00巧]一、生产用毒株
[0036] 制苗免疫原用鸭肝炎病毒值uck h巧atitis virus) I型皿-34株，由瑞普（保定） 生物药业有限公司分离、鉴定、保管和供应。
[0037] 二、疫苗（免疫原）的制备
[003引 1.制苗用病毒液的制备
[0039]皿-34株病毒液制备将生产用毒种皿-34株作100倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0. 1ml，36~37°C解育，每日2次照胚检查。接种后48~120小时内死亡的 鸡胚，置2~8°C放置4~12小时后，收取尿囊液、羊水及胚体，胚体去掉头和四肢。用胚液 匀浆后、冻融3次，30(K)r/min离屯、lOmin，取上清混合于无菌容器中，置2~8°C保存。
[0040] 2.浓缩
[0041] 将收获的皿-34株病毒液在2~8°C条件下，用膜包对毒液进行浓缩，按现行《中