抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体制备方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体及其制备方法、效价检测方法和应用，特点是采用弗氏柠檬酸杆菌为抗原免疫蛋鸡，收集高免疫鸡蛋，将免疫鸡蛋卵黄进行分离和纯化得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体，包括制备弗氏柠檬酸杆菌抗原并灭活步骤；将蛋鸡进行1次基础免疫和3～4次加强免疫并收集鸡蛋的步骤；最后通过离心分离、盐析和透析得到产品的步骤；并采用间接酶联免疫吸附试验检测抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的效价，该弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体可用于由弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的预防和治疗上，并可用于开发弗氏柠檬酸杆菌检测试剂盒和免疫学上的免疫反应及诊断，优点是该卵黄抗体纯度较高，且对弗氏柠檬酸杆菌有较强的抑制作用，同时高免卵黄的获取廉价、方便，低成本、便于大批量生，其制备方法简便易行。
【专利说明】
抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物制品制备技术及应用领域，尤其是涉及一种抗弗氏柠檬酸杆菌卵 黄抗体及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 弗氏梓檬酸杆菌（Citrobacter freundii)是一种条件致病菌，广泛分布于自然界 中，为人和动物肠道的正常菌群，和大肠菌群一样，可视作粪便污染的卫生学指标。在一定 的条件下，弗氏柠檬酸杆菌是一种"人-蓄"共患病病原菌，当机体抵抗力下降时，可引起腹 泻、尿路感染、创面感染、关节炎和败血症等；弗氏柠檬酸杆菌也可存在于食物中导致食物 中毒；同时，弗氏柠檬酸杆菌也是一种流行性很广的水产动物病原菌，对海水、淡水动物均 能致病，常年来给养殖户带来了巨大的损失。据报道，弗氏柠檬酸杆菌对中华绒螯蟹，红螯 螯虾，中华鳖，三疣梭子蟹，草鱼，斑马鱼，大鲵，鲫鱼等都有致病性，每年由于弗氏柠檬酸杆 菌引起的水产类疾病给养殖业带来了巨大损失，因此，若能对弗氏柠檬酸杆菌进行及时的 防治，势必能给养殖产业减少损失。
[0003] 目前对于弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的防治手段最要有以下几种：抗生素、中草 药、灭活疫苗、单克隆抗体等。抗生素和化学药物易引起应激反应，对生物有不同程度的毒 性，且反复使用容易产生耐药性，存在药物残留，在倡导绿色农业的今天必将退出历史舞 台；中草药的药效持久，但却很难迅速起效，且各地区中草药药性差别较大，使用不易控制， 多用于疾病预防；疫苗接种是防治细菌性疾病最直接有效的方法，国外已经有多种商品化 疫苗出售，但我国水产疫苗研制起步晚，到目前为止仅有草鱼出血病疫苗获得了商品化生 产批准，疫苗的研发、生产、销售及广泛使用都需要相当长一段时间。
[0004] 鸡卵黄抗体即卵黄中的免疫球蛋白（immunoglobulin of yolk，IgY)，是针对特定 抗原的，具有持续效价的高亲和力抗体，它具有产率高、稳定性好、特异性强等优点，是一种 易于生产、廉价的抗体，免疫1只鸡所收集到的仅1个鸡蛋中含有的特异性IgY的量（约 200mg)远远高于免疫1只兔所收集到的全部血清中的抗体量。IgY具有较强的耐酸、耐碱、 耐热能力。卵黄抗体是一种无副作用无残留对环境和人体温和的蛋白质，高效卵黄抗体可 以通过注射、拌饵投喂、浸泡等方式对水产动物起到保护剂疾病治疗作用，还可用于免疫学 检测等领域。目前，卵黄抗体在畜牧业上已经得到较广泛的关注和应用，但在水产行业的研 究开发还处于基础阶段，目前在水产方面申请公开和授权的专利有抗对虾病毒病、抗贝氏 隐孢子虫病、抗副溶血弧菌病、抗鳗弧菌以及抗嗜水气单胞菌的卵黄抗体，但是，目前还没 有关于抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体及其制备方法和应用的相关研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供提供一种抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体及其制 备方法、效价检测方法和应用，该卵黄抗体纯度较高，且对弗氏柠檬酸杆菌有较强的抑制作 用，同时高免卵黄的获取方便、廉价、低成本，便于大批量生，其制备方法简便易行，可用于 由弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的预防和治疗上及开发弗氏柠檬酸杆菌检测试剂盒和免疫 学上的免疫反应及诊断。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗 体，采用弗氏柠檬酸杆菌为抗原免疫蛋鸡，收集高免疫鸡蛋，将免疫鸡蛋卵黄进行分离和纯 化得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体。
[0007] -种抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0008] (1)制备弗氏柠檬酸杆菌抗原并灭活
[0009] 接种弗氏柠檬酸杆菌于牛肉膏固体琼脂培养基，30°C倒置培24h后，挑取单菌 落接种于牛肉膏液体培养基中，在30°C，200rpm的条件下，摇床振荡培养18h后，调节牛 肉膏液体培养基中的弗氏柠檬酸杆菌菌量为2X10 9CFU/ml，然后离心分离得到含有弗氏 柠檬酸杆菌的沉淀物和上清液，将沉淀物与无菌生理盐水混合得到弗氏柠檬酸杆菌量为 2X10 9CFU/ml的菌悬液，加入甲醛使甲醛体积终浓度达0.5%，然后37°C恒温水浴灭活 24h，即得到灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原，放4°C冰箱备用；
[0010] (2)免疫蛋鸡并收集鸡蛋
[0011] 将初产蛋的母鸡进行1次基础免疫和3~4次加强免疫，所述的基础免疫为在步 骤（1)得到的弗氏柠檬酸杆菌抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注 射免疫，所述的加强免疫为在步骤（1)得到的弗氏柠檬酸杆菌抗原中加入等量的弗氏不完 全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，每次免疫间隔15天，完成免疫后10天，开始收集 鸡蛋，于4°C冰箱保存；
[0012] (3)卵黄抗体分离和纯化
[0013] 将步骤（2)得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，然后在卵黄中加入卵黄 体积9倍的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀后于4°C冰箱静置10h，然后在4°C，10000g条件下离 心20min，得到初提纯液，将初提纯液进行盐析，将盐析得到的沉淀用与卵黄等体积的浓度 为0. 01mol/L的pH为7. 2的PBS缓冲液重悬，最后用截留量为100KD的透析袋透析除盐得 到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体。
[0014] 步骤（3)中所述的盐析过程为：首先向初提纯液中加入终饱和度为40%的饱和 (NH 4)2S04,4°C冰箱静置10h后，4°C，10000g，离心20min得到一次沉淀；然后将一次沉淀用 140g/L的Na 2S0^悬浮，4°C冰箱静置10h后，4°C，10000g，离心20min得到二次沉淀，所述 的二次沉淀即为盐析得到的沉淀。
[0015] -种抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的效价检测方法，采用间接酶联免疫吸附试验检 测抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的效价，具体包括如下步骤：以l〇 9CFU/ml弗氏柠檬酸杆菌包 被酶标板，4°C冰箱静置过夜，次日倾去孔内液体，将孔用PBST洗涤液洗涤3次后加入含1 % BSA的封闭液，室温封闭lh，洗涤3次后加入倍比稀释的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体，每梯 度设1个平行，同时设立空白对照和阴性对照，37°C温浴2h后，洗涤3次，加入辣根过氧化 酶标记的羊抗鸡二抗，37°C温浴lh，洗涤5次后加入0PD显色液显色15min，H 2S0j#止反应 后用酶标仪读取波长492nm吸光值，待测样品与阴性对照吸光值大于2. 1判定为阳性，最大 阳性稀释度为抗体效价。
[0016] PBST洗涤液为吐温-20与PBS缓冲液按体积比1 : 2000的比例混合得到。
[0017] -种抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的应用，该弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体可用于由弗 氏柠檬酸杆菌引起的疾病的预防和治疗上，并可用于开发弗氏柠檬酸杆菌检测试剂盒和免 疫学上的免疫反应及诊断。
[0018] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄 抗体及其制备方法、效价检测方法和应用，该方法制备得到的卵黄抗体纯度较高，且对弗氏 柠檬酸杆菌有较强的抑制作用，同时高免卵黄的获取廉价、方便，低成本、便于大批量生产， 其制备方法简便易行，最终获得的高产、高效、高纯度的卵黄抗体可用于由弗氏柠檬酸杆菌 引起的疾病的预防和治疗上及开发弗氏柠檬酸杆菌检测试剂盒和免疫学上的免疫反应及 诊断，该效价检测方法检测效率高，操作过程简便易行。本发明首次提出了抗弗氏柠檬酸杆 菌卵黄抗体及其制备方法、效价检测方法和应用，填补了抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体相关 研究的空白，并为以后的研究与应用奠定基础。
【附图说明】
[0019] 图1为抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体体细胞吞噬调理作用效果图，左图为抗弗氏柠 檬酸杆菌卵黄抗体、鸡血与菌液混合物长势，右图为普通卵黄液、鸡血与菌液混合物长势。
[0020] 图2为抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体体外抑菌效果图，左为抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄 抗体与菌液混合物长势，右为普通卵黄液与菌液混合物长势。
【具体实施方式】
[0021] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0022] 一、具体实施例
[0023] 本发明一种抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体，通过制备弗氏柠檬酸杆菌灭活抗原免疫 鸡蛋，收集高免疫鸡蛋进行分离和纯化，并进行蛋白浓度测定和SDS-PAGE检测蛋白条带判 断纯度，用间接ELISA检测抗体效价，并进行细胞吞噬调理实验、体外抑菌及体内抑菌实验 来确定效果，最终获得高产、高效、高纯度的卵黄抗体，其制备过程具体如下：
[0024] (1)制备弗氏柠檬酸杆菌抗原并灭活
[0025] 接种弗氏柠檬酸杆菌于牛肉膏固体琼脂培养基，30°C倒置培养24h后，挑取单菌 落接种于牛肉膏液体培养基中，在30°C，200rpm的条件下，摇床振荡培养18h后，调节牛 肉膏液体培养基中的弗氏柠檬酸杆菌菌量为2X10 9CFU/ml，然后离心分离得到含有弗氏 柠檬酸杆菌的沉淀物和上清液，将沉淀物与无菌生理盐水混合得到弗氏柠檬酸杆菌菌量 为2X 109CFU/ml的菌悬液，加入甲醛使甲醛体积终浓度达0. 5%，然后37°C恒温水浴灭活 24h，即得到灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原，放4°C冰箱备用；
[0026] (2)免疫蛋鸡并收集鸡蛋
[0027] 将初产蛋母鸡进行1次基础免疫和3~4次加强免疫，所述的基础免疫为在步骤 (1)得到的弗氏柠檬酸杆菌抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射 免疫，所述的加强免疫为在步骤（1)得到的弗氏柠檬酸杆菌抗原中加入等量的弗氏不完全 佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，每次免疫间隔15天，完成免疫后10天，开始收集鸡 蛋，于4°C冰箱保存；
[0028] (3)卵黄抗体分离和纯化
[0029] 取高免鸡蛋，以75 %酒精擦拭蛋壳，去除蛋清，分离卵黄，吸取卵黄液10mL并按 体积比1 : 9加入pH 5. 0的乙酸-乙酸钠缓冲液，充分混匀后于4°C冰箱静置10h，4°C， lOOOOg条件下离心20min，得到初提纯液进行两次盐析。首先，向初提纯液中加入饱和 (NH4) 2S04-使其终饱和度为40 %，4 °C冰箱静置1 Oh，取出后4 °C，1 OOOOg，离心20min，然 后沉淀用100mL140g/L的似2304重悬浮，4°C冰箱静置10h后lOOOOg离心20min，沉淀用 10mlPBS(0. 01mol/L，pH 7. 2)重悬，最后用截留量100KD透析袋透析除盐得到抗弗氏柠檬 酸杆菌卵黄抗体，透析液为0.0 lmol/L，pH 7. 2的PBS，期间更换透析液3-5次。
[0030] 二、抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的鉴定
[0031] (1)浓度测定和纯度检测
[0032] 透析后蛋白液共计13mL，稀释10倍后，测定260nm和280nm波长下吸光值分 别为2. 554和2. 141，根据公式（1. 45 X 0D2SQ-0. 74 X 0D26。）X稀释倍数计算蛋白浓度为 12. 145mg/mL，总蛋白量约160mg在正常范围内，取蛋白液15 μ L与等量2X loading Buffer 混匀后煮沸l〇min，进行12%还原性SDS-PAGE电泳，重链、轻链分别位于66KD、26KD处条带 较亮，总分子量约180KD，杂带少、弱，纯度较高。
[0033] (2)间接酶联免疫吸附试验（ELISA)检测效价
[0034] 以109CFU/ml弗氏柠檬酸杆菌包被酶标板，每孔100 μ L，4°C冰箱静置过夜，次日倾 去孔内液体，将孔用PBST (PBST为吐温-20与PBS缓冲液按体积比1 : 2000的比例混合） 洗涤液洗涤3次除去未被包被上的抗原杂质后，加入含1 % BSA的封闭液100 μ L，室温封闭 lh，洗 3 次后加入按 1 : 100，1 : 200，1 : 400，1 : 800，1 : 1600，1 : 3200，1 : 6400， 1 : 12800,1 : 25600稀释的IgY 100 yL，每梯度设1个平行，同时设立空白对照和阴性 对照，37°C温浴2h后洗涤3次，加入1 : 10000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鸡二抗 100 yL，37°C温浴lh，洗涤5次后加入0PD显色液显色15min，用50 yL、2M的H2S04终止反 应，酶标仪读取波长492nm吸光值，待测样品与阴性样品吸光值大于2. 1判定为阳性，最大 阳性稀释度为抗体效价。本次制备的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体效价为1 : 12800。
[0035] (3)细胞吞噬调理实验
[0036] 用一次性注射器从鸡体内抽取鸡血，转移至无菌离心管中，加入肝素抗凝，待用。 将纯培养的弗氏柠檬酸杆菌稀释至2 X 104CFU/mL，分别取100 μ L抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗 体和普通卵黄蛋白液，加入100 μ L的新鲜鸡血和100 μ L菌液混匀后置于30°C培养箱结合 15min，取100 μ L混合液涂布牛肉膏琼脂平板，各设1重复，30°C倒置培养24h后拍照计数 观察。如图1所示，实验表明：加入抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的一组能明显抑制弗氏柠檬 酸杆菌的生长，其菌量是加入普通卵黄蛋白液组的1/10,这说明在一定浓度范围内，卵黄抗 体能明显协助细胞对细菌的吞噬调理作用，其细菌吞噬率增加了 90%。
[0037] (4)体外抑菌实验
[0038] 将纯培养的弗氏柠檬酸杆菌稀释至2 X 104CFU/mL，分别取100 μ L抗弗氏柠檬酸杆 菌卵黄抗体和普通卵黄蛋白液，加入等量菌液混匀后置30°C培养箱结合15min，取100 μ L 涂布牛肉膏琼脂平板，各设1重复，30°C倒置培养24h后拍照计数。如图2所示，抑菌实验 表明：加入抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的一组能明显抑制弗氏柠檬酸杆菌的生长，其抑菌 效果有效平均值达到75%。
[0039] 三、抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的应用
[0040] 挑选健壮克氏原螯虾60只随机分成6组，每组10只，按如下分组于螯虾第3腹节 进行注射，每只〇.151111。组1:2\10妙1]/1111弗氏柠檬酸杆菌菌与0.9%无菌生理盐水1:1 混合；组2 :2X 109CFU/ml弗氏柠檬酸杆菌与普通卵黄蛋白液1 : 1混合；组3 :2X 109CFU/ ml弗氏柠檬酸杆菌与抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体1 : 1混合。组4 :2X 109CFU/ml弗氏柠 檬酸杆菌菌与〇.9%无菌生理盐水1:2混合；组5:2\1(^^1]/1111弗氏柠檬酸杆菌与普通 卵黄蛋白液1 : 2混合；组6 :2X 109CFU/ml弗氏柠檬酸杆菌与抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体 1 : 2混合。常规饲养，观察死亡情况。结果表明：注射后7天内组1、组2和组4、组5的螯 虾全部死亡，而组3和组6在7天内分别存活4尾和7尾，保护率分别为40%和70%。这 说明，在一定浓度范围内，增加卵黄抗体的剂量能明显抑制弗氏柠檬酸杆菌增长，理论上应 该能达到100 %的克氏原螯虾存活率。表明按本发明制备的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体，对 受高浓度弗氏柠檬酸杆菌攻击的螯虾有明显的保护作用和延迟死亡的作用，能够运用于水 产动物预防和治疗由弗氏柠檬酸杆菌导致的疾病。
[0041] 表1抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的体内抑菌实验
[0042]
[0044] 当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的 普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体，其特征在于：采用弗氏柠檬酸杆菌为抗原免疫蛋 鸡，收集高免疫鸡蛋，将免疫鸡蛋卵黄进行分离和纯化得到抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体。2. -种根据权利要求1所述的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于包 括以下步骤： (1) 制备弗氏柠檬酸杆菌抗原并灭活 接种弗氏柠檬酸杆菌于牛肉膏固体琼脂培养基，30°C倒置培养24h后，挑取单菌落 接种于牛肉膏液体培养基中，在30 °C，200rpm的条件下，摇床振荡培养18h后，调节牛肉 膏液体培养基中的弗氏柠檬酸杆菌菌量为2X109CFU/ml，然后离心分离得到含有弗氏柠 檬酸杆菌的沉淀物和上清液，将沉淀物与无菌生理盐水混合得到弗氏柠檬酸杆菌菌量为 2X IO9CFUAiI的菌悬液，加入甲醛使甲醛体积终浓度达0.5%，然后37°C恒温水浴灭活 24h，即得到灭活的弗氏柠檬酸杆菌抗原，放4°C冰箱备用； (2) 免疫蛋鸡并收集鸡蛋 将初产蛋母鸡进行1次基础免疫和3~4次加强免疫，所述的基础免疫为在步骤（1)得 到的弗氏柠檬酸杆菌抗原中加入等量的弗氏完全佐剂，充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫， 所述的加强免疫为在步骤（1)得到的弗氏柠檬酸杆菌抗原中加入等量的弗氏不完全佐剂， 充分乳化后对蛋鸡进行注射免疫，每次免疫间隔15天，完成免疫后10天，开始收集鸡蛋，于 4 °C冰箱保存； (3) 卵黄抗体分离和纯化 将步骤（2)得到的免疫鸡蛋用酒精擦拭蛋壳并分离卵黄，然后在卵黄中加入卵黄体积 9倍的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀后于4°C冰箱静置10h，然后在4°C，1000 Og条件下离心 20min，得到初提纯液，将初提纯液进行盐析，将盐析得到的沉淀用与卵黄等体积的浓度为 0.0 lmol/L的pH为7. 2的PBS缓冲液重悬，最后用截留量为100KD的透析袋透析除盐得到 抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体。3. 根据权利要求1所述的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于步骤 ⑶中所述的盐析过程为：首先向初提纯液中加入终饱和度为40%的饱和（NH 4)2S04,4°C冰 箱静置IOh后，4°C，10000g，离心20min得到一次沉淀；然后将一次沉淀用140g/LNa 2S0^ 悬浮，4°C冰箱静置IOh后，4°C，10000g，离心20min得到二次沉淀，所述的二次沉淀即为盐 析得到的沉淀。4. 一种根据权利要求1所述的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的效价检测方法，其特征 在于采用间接酶联免疫吸附试验检测抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的效价，具体包括如下步 骤：以IO 9CFUAiI弗氏柠檬酸杆菌包被酶标板，4°C冰箱静置过夜，次日倾去孔内液体，将孔 用PBST洗涤液洗涤3次后加入含1 % BSA的封闭液，室温封闭lh，洗涤3次后加入倍比稀 释的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体，每梯度设1平行，同时设立空白对照和阴性对照，37°C温 浴2h后，洗涤3次，加入辣根过氧化酶标记的羊抗鸡二抗，37°C温浴lh，洗涤5次后加入OPD 显色液显色15min，H2SOjI止反应后用酶标仪读取波长492nm吸光值，待测样品与阴性对照 吸光值大于2. 1判定为阳性，最大阳性稀释度为抗体效价。5. 根据权利要求1所述的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的效价检测方法，其特征在于： PBST洗涤液为吐温-20与PBS缓冲液按体积比1 : 2000的比例混合得到。6. -种根据权利要求1所述的抗弗氏柠檬酸杆菌卵黄抗体的应用，其特征在于：该弗 氏柠檬酸杆菌卵黄抗体可用于由弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的预防和治疗上，并可用于开 发弗氏柠檬酸杆菌检测试剂盒和免疫学上的免疫反应及诊断。
【文档编号】A61K39/40GK105884890SQ201410653416
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年11月14日
【发明人】李登峰, 章礼平, 刘联国
【申请人】宁波大学