曼氏血吸虫诊断抗原的筛选与应用

曼氏血吸虫诊断抗原的筛选与应用
【专利摘要】本发明公开了曼氏血吸虫诊断抗原的筛选与应用。具体的，所述的抗原来自曼氏血吸虫，且所述的抗原组合包括两种或两种以上来自下组的抗原：(a)如SEQ ID NO.:1?17所示的多肽；(b)将SEQ ID NO:1?17氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形成的具有免疫原性的衍生多肽；(c)与SEQ ID NO：1?17所示氨基酸序列的同源性≥90％的、具有免疫原性的多肽；或(d)具有免疫原性的多肽(a)－(c)的片段；其中，所述抗原组合中的抗原针对的抗体不相同。曼氏血吸虫病血清学检测表明，用这些阳性抗原检测曼氏血吸虫具有高敏感性和特异性。本发明还提供了相应的诊断和监测曼氏血吸虫病的方法和试剂盒。
【专利说明】
曼氏血吸虫诊断抗原的筛选与应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地，本发明公开了一系列来自于曼氏血吸虫的具 有特异性诊断作用的抗原组合及其应用。
【背景技术】
[0002] 曼氏血吸虫是流行程度最广的血吸虫病，全球有54个国家有曼氏血吸虫流行，包 括了非洲、南美洲以及中亚等广大地区，感染人数超过了 8千万。与日本血吸虫相比，曼氏 血吸虫自然终宿主主要是人等灵长类动物，而日本血吸虫自然终宿主除了人以外，还包括 牛、猪等家畜以及鼠类等四十余种动物。此外，曼氏血吸虫的中间宿主为水生性的双脐螺， 日本血吸虫的中间宿主为水陆两栖性钉螺。日本血吸虫和曼氏血吸虫差异还表现在病人病 情上，前者病情较重，后者较轻。最新的基因组研究表明，尽管曼氏血吸虫和日本血吸虫基 因具有同源性，但同源性并不高，因此同一基因在不同血吸虫中的免疫原性可能是不同的。
[0003] 高效低廉且方便的血吸虫病诊断技术的缺乏是导致血吸虫病防治困难的主要 因素之一。精确的诊断技术不仅可以用于患者确诊，还可用于划分流行区等级、评估 流行态势和考核防控效果等。目前血吸虫病诊断方法主要有三种，一是病原学检测方 法，二是免疫学检测方法，第三种是分子生物学检测方法。病原学检测方法主要包括虫 卵检测法（Kato-Katz Technique)和毛蝴孵化法（Hatching Test);免疫学检测方法 主要有间接红血球凝集试验（Indirect Hemagglutination Assay, IHA)、酶联免疫吸 附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、环卵沉淀试验（Circum Oval Precipitating Test，C0PT)以及斑点免疫金渗滤试验（Dotimmunogoldfiltration Assay, DIGFA);分子生物学方法是通过血吸虫特异的核酸扩增技术来进行诊断。以上方法各有优 缺点。病原学检测结果目前仍然是血吸虫病确诊的金标准，但是病原学检测敏感度低，且费 时费力，同时还有污染环境的危险。免疫学方法中的C0PT和IHA特异性高，但敏感性低， 未能广泛使用。分子生物学方法检测敏感性高，但易出现假阳性，同时该方法对实验条件 要求较高，目前仅停留在实验室研究阶段。相比而言，ELISA技术具有操作简单、敏感度高、 易标准化等优点，并且广泛应用在多种疾病诊断中，因此是血吸虫病诊断优先发展的方向。 ELISA技术的关键是抗原的选择。目前市场上血吸虫抗体诊断ELISA使用的抗原是虫卵可 溶性抗原（SEA)，但SEA是粗抗原，成分复杂，使得SEA-ELISA的特异性较差，容易出现交叉 反应，无法区分现症感染和既往感染。此外，SEA通常要从动物肝脏中的虫卵提取，生产条 件难以控制，这导致SEA成本较高，批次间不稳定。利用基因工程技术生产的重组蛋白具有 产量高、价格低、ELISA交叉反应少等优点，是替代SEA的潜在新型抗原，但重组蛋白ELISA 的关键在于高敏感性、高特异性抗原分子的筛选。
[0004] 为了筛选新的诊疗靶点，1994年，世界卫生组织（WHO)启动了血吸虫基因组计 划。近几年来，血吸虫组学研究取得了巨大进展，曼氏血吸虫和日本血吸虫的基因组草图 已经绘制完成，注释了超过一万条基因。同时EST数据库、蛋白质组数据库也已建立。这 些重要的数据库不仅可以用于在分子水平研究血吸虫的生长发育机制，探讨血吸虫-宿主 相互作用机理，更重要的是可以服务于血吸虫病防治新方法的研究，筛选新型诊断分子、候 选疫苗分子和药物新靶点等。在大量血吸虫基因和蛋白得到鉴定后，人们已经不能满足 于在单个基因水平上研究基因的生物学功能，血吸虫研究已经进入了"组学"时代。但是， 目前还没有办法能直接从血吸虫基因组、蛋白质组或转录组中明确哪些分子是我们所需 要的靶标。因此迫切需要一些新的技术能将组学数据与具体的研究领域结合。免疫组学 (immunomics)就是衔接免疫学和基因组学的交叉学科。它利用免疫学的技术手段从基因 组、蛋白质组和转录组中筛选出与宿主免疫系统相互作用的一组分子，我们把这组分子称 为免疫组（immunome)。免疫组中的分子具有用于疾病免疫学诊断巨大潜在价值，因此免疫 组学研究是血吸虫后基因组时代研究的重要内容，其成果必将会直接指导血吸虫疾病诊断 研发。庞大浩瀚的血吸虫基因组数据，为我们全面深入地研究血吸虫提供了强大的信息平 台。如何从基因组中筛选出可用于血吸虫病尤其是曼氏血吸虫诊断和防治的新靶标，已成 为当前血吸虫研究人员迫切需要解决的问题。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供一类用于曼氏血吸虫的阳性抗原的组合及其用途。
[0006] 本发明第一方面，提供了一种曼氏血吸虫抗原组合，所述的抗原组合包括两种或 两种以上来自下组的抗原：
[0007] (a)如 SEQ ID N0. : 1-17 所示的多肽；
[0008] (b)将SEQ ID N0:1-17氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加 而形成的具有免疫原性的衍生多肽；
[0009] (C)与SEQ ID NO :1-17所示氨基酸序列的同源性> 90%的、具有免疫原性的多 肽；或
[0010] ⑷具有免疫原性的多肽（a) - (c)的片段；
[0011] 其中，所述抗原组合中的抗原针对的抗体不相同。
[0012] 在另一优选例中，所述的抗原组合含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17 种选自 SEQ ID NO. :1-17 的多肽。
[0013] 在另一优选例中，所述的抗原组合中至少含有两种或两种以上选自SEQ ID NO. :1、3、6、8、10、12、13、15、或17所示的多肽。
[0014] 在另一优选例中，所述的抗原组合至少含有两种或两种以上选自SEQ ID N0. : 1、 8、14、15、或17所示的多肽。
[0015] 本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸组合，所述的多核苷酸组合中的多 核苷酸分别编码本发明第一方面所述抗原组合中的抗原。
[0016] 本发明第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的多核苷 酸组合。
[0017] 在另一优选例中，所述的载体还可以含有SEQ ID NO. :1-17中任一所述的抗原。
[0018] 在另一优选例中，所述的组合包括两种或多种所述的多核苷酸。
[0019] 本发明第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发 明第三方面所述的载体或染色体整合有本发明第二方面所述多核苷酸组合中的多核苷酸。
[0020] 本发明第五方面，提供了一种制备曼氏血吸虫抗原组合的方法，所述方法包括步 骤：
[0021] (a)在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞；
[0022] (b)从培养物中分离出曼氏血吸虫阳性蛋白抗原。
[0023] 在另一优选例中，所述的方法还包括将（b)中获得的抗原进行混合，从而制备成 曼氏血吸虫抗原组合。
[0024] 在另一优选例中，所述的抗原组合可以是混合物，或是含有多个独立抗原的组合 形式。
[0025] 本发明第六方面，提供了曼氏血吸虫抗原或本发明第一方面所述抗原组合的用 途，用于制备诊断曼氏血吸虫的试剂或试剂盒，其中，所述的曼氏血吸虫抗原包括一种或多 种选自SEQ ID NO. :1-17所述的多肽。
[0026] 本发明第七方面，提供了一种检测曼氏血吸虫的试剂盒，所述的试剂盒包括：容器 或载体；以及位于所述容器内或载体上的如本发明第一方面所述的抗原组合构成的检测试 剂。
[0027] 在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶结合液、反应底物和任选的说明书，较佳 地，所述的试剂盒还可包括选自下组的组分：反应终止液、样本稀释液、和洗涤液。
[0028] 在另一优选例中，所述的试剂包括固相载体以及包被于所述固相载体上的SEQ ID NO. : 1-17任一所述抗原或其组合，优选地，为本发明第一方面所述的抗原组合。
[0029] 在另一优选例中，所述的试剂盒或试剂用于检测待测样本是否感染曼氏血吸虫。
[0030] 在另一优选例中，所述待测样本来自曼氏血吸虫病流行区人群。
[0031] 在另一优选例中，所述待测样本来自牛或其他哺乳动物，例如，人。
[0032] 在另一优选例中，本发明还提供了一种抗体，所述的抗体能分别和一种或多种选 自SEQ ID NO. :1-17所述的多肽特异性结合。
[0033] 在另一优选例中，所述的抗体分别能与SEQ ID N0. :1、3、6、8、10、12、13、15、或17 所示的多肽特异性结合。
[0034] 本发明第八方面，提供了一种抗原-抗体复合物，所述的复合物包括：
[0035] (i) 一种或多种选自SEQ ID NO. :1-17的多肽；
[0036] (ii)与（ii)中的多肽特异性结合的抗体。
[0037] 本发明第九方面，提供了一种所述抗原-抗体复合物的用途，所述复合物用于：
[0038] (a)制备检测曼氏血吸虫的试剂或试剂盒；和
[0039] (b)用作检测曼氏血吸虫的阳性对照。
[0040] 本发明第十方面，提供了一种诊断性或非诊断性检测样本中是否感染曼氏血吸虫 的方法，包括步骤：
[0041] (1)制备SEQ ID N0. : 1-17中任一所示的曼氏血吸虫抗原或其抗原组合；
[0042] (2)将步骤（1)得到的抗原或其抗原组合与待检测的样本接触；
[0043] (3)检测样本中是否含有本发明第九方面所述的抗原-抗体复合物；
[0044] 其中，若步骤（3)中的样本出现所述的抗原-抗体复合物，则表明所述的样本感染 了曼氏血吸虫。
[0045] 在另一优选例中，所述阳性抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO :1-17所示。
[0046] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【具体实施方式】
[0047] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地在曼氏血吸虫中筛选到17个能被 曼氏血吸虫病人血清识别的阳性抗原，其中5-10个属于强阳性抗原。实验结果证明，这些 抗原对检测曼氏血吸虫具有高敏感性和特异性。基于本发明，可用于制备诊断和检测曼氏 血吸虫病的试剂或试剂盒。在此基础上，完成了本发明。
[0048] 血吸虫及其组学研究
[0049] 血吸虫严重危害人类及其他哺乳动物的健康，其中曼氏血吸虫是六种感染人的血 吸虫中，流行范围最广、感染和受威胁人数最多、伤残调整生命年负担最重的寄生虫。目前 在全世界 54个国家流行。急性血吸虫病的发病机制尚不清楚，对于曼氏血吸虫的治疗也因 受地域和人群的不同而不能取得良好的防治效果。
[0050] 为了筛选新的诊断和治疗靶点，1994年世界卫生组织（WHO)启动了血吸虫基因组 计划，并且在近几年，曼氏血吸虫研究取得了巨大进展，曼氏血吸虫的基因组草图已经绘制 完成，并注释了超过一万条基因，同时EST数据库、蛋白质组数据库也已建立。这些重要的 数据库不仅可以用于在分子水平研究曼氏血吸虫的生长发育机制，探讨曼氏血吸虫-宿主 相互作用机理，更重要的是可以服务于血吸虫病防治新方法的研究、筛选新型诊断分子、候 选疫苗分子和药物新靶点等。但是，目前还没有办法能直接从曼氏血吸虫基因组、蛋白质组 或转录组中明确哪些分子是我们所需要的靶标。因此迫切需要一些新的技术能将组学数据 与具体的研究领域结合。免疫组学（immunomics)就是衔接免疫学和基因组学的交叉学科， 它利用免疫学的技术手段从基因组、蛋白质组和转录组中筛选出与宿主免疫系统相互作用 的一组分子，即免疫组（immunome)。免疫组中的分子具有用于疾病免疫学诊断巨大潜在价 值，是曼氏血吸虫后基因组时代研究的重要内容。如何从免疫组中筛选出可用于曼氏血吸 虫病诊断和防治的新靶标，已成为本领域研究人员迫切需要解决的问题。
[0051] 曼氏血吸虫
[0052] 曼氏血吸虫是六种感染人的血吸虫中，流行范围最广、感染和受威胁人数最多、伤 残调整生命年负担最重的寄生虫。主要流行于非洲（包括埃及、苏丹、埃塞俄比亚、肯尼亚、 坦桑尼亚、莫桑比克、津巴布韦、赞比亚、刚果等），南美洲（巴西、圭亚那、多米尼加、加勒比 海等国），亚洲（阿拉伯半岛）。曼氏血吸虫通常在卫生条件恶劣的发展中国家和贫困国家 流行，含有虫卵的人粪是主要的传染源。易感人群以渔民、农民、小孩为主。流行区居民因 反复感染有部分免疫力。非流行区居民初次感染者可引起急性曼氏血吸虫病。
[0053] 阳性抗原
[0054] 在本发明中，术语"抗原"或"阳性抗原"可互换使用，都指能够与曼氏血吸虫抗体 特异结合的蛋白或多肽。抗原是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应 答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反 应，也就是抗原性。
[0055] 如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化 的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化 的。"分离的阳性抗原"是指所述抗原基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其 它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化阳性抗原。基本上纯的蛋白抗 原在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。抗原的纯度能用氨基酸序列分析。
[0056] 本发明的抗原可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从 原核或真核宿主（例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。根据重组生 产方案所用的宿主，本发明的抗原可以是糖基化的和非糖基化的。本发明的抗原还可包括 或不包括起始的甲硫氨酸残基。
[0057] 本发明还包括抗原的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍生物" 和"类似物"是指基本上保持本发明的天然抗原相同的生物学功能或活性的抗原。本发明 的抗原片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优选 保守性氨基酸残基）被取代的抗原，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传 密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的抗原，或（iii)抗原与另 一个化合物（比如延长抗原半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合所形成的抗原，或（iv) 附加的氨基酸序列融合到此抗原序列而形成。这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练 技术人员公知的范围。
[0058] 在本发明中，术语"抗原"还包括具有相同功能的变异形式。这些变异形式包括 (但并不限于）：一个或多个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10 个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个（通常为 20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相 近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末 端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
[0059] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的抗原的化学衍生形式如乙 酰化、羧基化、糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨 酸，磷酸苏氨酸）的序列。
[0060] 抗原组合
[0061] 术语"抗原组合"指的是将本发明发现的曼氏血吸虫阳性抗原为了诊断或对照目 的，进行所需要的形式组合。例如，将两种或两种以上选自SEQ ID NO. :1-17所述多肽或其 衍生多肽的抗原进行组合，可以提高曼氏血吸虫的诊断特异性和阳性诊断率。
[0062] 通常，可以选择多种阳性抗原进行组合，以提高确诊率，当然，也可以挑选少数个 强阳性抗原进行组合，以最经济的选择进行大范围的筛查。
[0063] 为了制备本发明的抗原组合，可采取常规的基因工程的方法，例如在载体中引入 一个或数个本发明抗原的编码序列，并导入宿主细胞，或在载体中仅引入一个本发明抗原 的编码序列，并构成载体的组合后共同导入宿主细胞，这些方法均为本领域技术人员所熟 知。
[0064] 抗原编码序列
[0065] 编码本发明抗原的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基 因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码 链。术语"编码本发明抗原的多核苷酸"可以是包括编码此抗原的多核苷酸，也可以是还包 括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0066] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的 等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插 入变异体。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少 70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多 核苷酸可杂交的多核苷酸。
[0067] 本发明的核苷酸序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法 获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来 设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为 模板，扩增而得有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序 列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离 得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通 常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。可以完全通过化学合 成来得到编码本发明抗原（或其片段，或其衍生物）的DNA序列。然后可将该DNA序列引 入本领域中已知的各种现有的DNA分子（或如载体）和细胞中。此外，还可通过化学合成 将突变引入本发明抗原序列中。
[0068]应用 PCR 技术扩增 DNA/RNA 的方法（Saiki, et al. Sciencel985 ;230 :1350-1354) 被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适 当地选择，并可用常规方法合成。
[0069] 抗原制备方法
[0070] 本发明抗原的制备方法有以下步骤：
[0071] (1).用编码本发明阳性抗原的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸的重 组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0072] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0073] (3).从培养基或细胞中分离、纯化本发明抗原。
[0074] 本发明中，多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。本领域的技术人员熟知的方 法能用于构建含抗原编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。包含上述适 当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其 能够表达蛋白质。
[0075] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细 菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、C0S、293细胞、或 Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常 规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期 后收获，用CaCl 2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果 需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷 酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0076] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明抗原蛋白。根据所用的宿主细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当 宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导）诱导选择的 启动子，将细胞再培养一段时间。
[0077] 抗原蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其 物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化抗原蛋白。这些方法是本领域技 术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理 (盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交 换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0078] 抗原筛选方法
[0079] 本发明基于谷胱甘肽-S-转移酶（GST)融合蛋白表达的方法进行高通量蛋白抗 原筛选，包括步骤：（1)利用生物信息学的方法预测曼氏血吸虫表达序列标签（EST)数据库 中含有信号肽的蛋白，在本发明的一个优选例中，数据库优选NCBI的蛋白质序列，预测软 SiRnalP3. 0 (http://www. cbs. dtu. dk/services/SiRnalP/) ; (2)扩增各信号肤蛋 白对应的目的基因，将目的基因克隆至表达载体，较佳地表达载体为GST表达载体，转化大 肠杆菌后诱导菌体表达抗体-GST融合蛋白；（3)将融合蛋白置于螯合了 GSH的多孔板的孔 中，捕获GST融合蛋白；(4)将含有曼氏血吸虫抗体的血清置于多孔板的中，进行抗原抗体 检测，筛选形成特异性抗原-抗体复合物的孔，所对应的候选蛋白即为曼氏血吸虫阳性抗 原。在另一优选例中，可以同时将5-100种（较佳地10-80种）GST融合蛋白置于多孔板的 孔中，从而实现高通量筛选。
[0080] 试剂盒
[0081] 本发明还提供了一种检测曼氏血吸虫的试剂盒。一般地，本发明的试剂盒包括以 下组分：容器或载体；以及位于所述容器内或载体上的本发明第一方面所述的阳性抗原。 在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶结合液、反应底物和任选的说明书。较佳地，所述的 试剂盒还可包括选自下组的组分：反应终止液、样本稀释液、和洗涤液。一种优选的可用于 检测曼氏血吸虫的试剂盒包括：容器以及位于容器内的包被液、辣根过氧化物酶标记的鼠 抗人IgG(H+L)抗体、底物液TMB、稀浓硫酸反应终止液和样本稀释液。更佳地，还含有空白 对照、阳性和阴性对照和作以监控检测过程是否符合标准。
[0082] 本发明的主要优点在于：
[0083] 1.抗原灵敏度高，不受检测样本感染度的影响，在EPG < 10的情况下依然能够检 出，敏感度较高。
[0084] 2.高特异性，本发明的抗原检测待测样本，其假阳率远远低于市售的SEA法。
[0085] 3.操作简便，抗原可以使用通用的ELISA法读取荧光强度值。
[0086] 4.结果稳定，重复性高。
[0087] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和分数按 重量计算。
[0088] 实施例1曼氏血吸虫重要抗原的筛选
[0089] 1.预测曼氏血吸虫的分泌蛋白：从NCBI下载曼氏血吸虫EST数据库，以及对应的 蛋白质序列；将蛋白质序列导入信号肽在线预测软件SignalP3. 0(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)进行预测；根据预测结果，按照p值大于0. 1，选定预测为信号肽蛋 白的序列。
[0090] 2.基因克隆：抽提血吸虫的总RNA ;通过RT-PCR扩增目的基因，回收目的片段，酶 切，将目的片段克隆到市售的表达载体PGEX-4T-1 ;转化市售大肠杆菌ToplO,阳性克隆经 测序确认序列正确。
[0091] 3.重组蛋白诱导表达：抽提质粒，将pGEX-4T-l重组质粒转化市售的大肠杆菌 B121 ;挑取单克隆，接种96孔细菌深孔培养板，37°C，250rpm培养过夜后按1 %比例接种96 孔细菌深孔培养板，每孔含有lml2XYT (含100μ g/ml Amp)液体培养基，37°C 250rpm培养 约三小时，至0D6。。= 0. 4-1.0 ;加入IPTG至终浓度lmmol/L，37°C，250rpm诱导目的蛋白表 达；诱导表达6h，停止培养；收集菌体，-80°C冻存备用。
[0092] 4.包涵体的溶解：反复冻融菌体2次；加入300 μ 1 B_PER(另加入DNase、RNase、 PMSF)裂解菌体，吹打混匀，转至EP管中；13, OOOrpm室温离心5min ;移出上清至新的Ep管 中，冷冻保存备用，沉淀即为包涵体；用含1% Triton-XlOO的PBS作为洗涤液，洗涤包涵体 并混匀，13, OOOrpm室温离心，5min，弃上清；重复洗涤步骤，再一次离心弃上清；用包涵体 溶解液溶解包涵体，lml诱导菌液大约能得到0. lg包涵体沉淀，加入lml溶解液，吹打混匀， 室温摇过夜，充分溶解包涵体。
[0093] 5.包涵体复性：将溶解后的溶液以13, OOOrpm室温离心5min，取上清；在96孔深 孔培养板中，每孔加入50 μ 1变性所得溶液和lml复性液；混匀，室温摇过夜；离心收集上 清。
[0094] 6.血清吸附：将pGEX-4T-l质粒转化大肠杆菌B121 (DE3)，按照前面的表达方法制 备GST表达菌液以及B121菌液各100ml，离心收集菌体，用10ml PBS重悬，超声破碎后收集 上清备用；将lml柱体积GSH填料、3ml GST表达上清和9ml PBS混合，室温混lh，lOOOrpm 离心收集沉淀，再用l〇ml PBS洗涤五次，此时填料上结合了 GST蛋白；用10ml PBS重悬 GST/填料，分装1. 9ml每管；加100 μ 1病人血清到分装管中，室温混匀5h，此步骤是吸附血 清中抗GST的抗体；lOOOrpm离心5min，去除填料，收集上清，此时血清稀释度是1 :20 ;将 3mlB121 (DE3)裂解上清加入2ml的GST吸附过的血清中，室温混匀5h，此步骤是吸附抗细 菌蛋白的抗体，此时血清稀释度是1:50 ; 13000rpm离心10min，每管分装500 μ 1，冻存备用。
[0095] 7.血清阳性克隆的筛选：在GSH-微孔板中，每孔加20 μ 1复性蛋白液和 80μ 1PBS，4°C过夜孵育；同时设GST表达菌液作为阴性对照，PBS作为空白对照，在筛选到 阳性蛋白后，以此克隆作为阳性对照。
[0096] ?831'邮3+吐温）洗涤五次；20(^15%奶粉/^31'，室温封闭211刊31'洗涤五次； 吸附过的血清按照1:20用5%奶粉稀释，最终血清的稀释度是1:1000 ; 100 μ 1/孔，37°C结 合lh ;PBST洗涤五次；按照1:20, 000,稀释HRP酶标记的鼠抗人IgG (H+L)抗体，100 μ 1/ 孔，37°C结合lh ;PBST洗涤5次；加100 μ 1市售商品Super Signal ELISA Femto进行检 测，在425nm处读取荧光强度值；计算样本和阴性对照荧光强度的比值R，根据R大小判断 是否为阳性蛋白，若R > 2,则判定为阳性，R的计算公式如下：
[0097]
[0098] 结果筛选到SEQ ID NO :1-17所示的抗原。
[0099] 实施例2强阳性克隆诊断敏感性的比较
[0100] 选强阳性抗原，分别吸附到GSH-微孔板上，同时设GST(谷胱甘肽-s-转移酶） 表达菌液作为阴性对照，PBS作为空白对照；PBST洗涤五次；200 μ 15%奶粉/PBST，室温封 闭2h ;PBST洗涤五次；吸附过的血清按照1 :20用5%奶粉稀释，最终血清的稀释度是1 : 1000 ;100μ 1/孔，37°C结合lh ;PBST洗涤五次；按照1 :20,000,稀释HRP酶标记的鼠抗人 IgG(H+L)抗体，100μ 1/孔，37°C结合 lh ;PBST 洗涤 5 次；加 100μ 1 市售商品 Super Signal ELISA Femto进行检测，在425nm处读取荧光强度值；计算R值。并与样本每克肝卵数目 (EPG)比较，检测抗原的敏感性。
[0101] 结果可见，本发明阳性抗原均具有一定的敏感性。
[0102] 实施例3强阳性抗原的表达和纯化
[0103] 1. pET28 (a)表达载体的构建：从重组pGEX-4T-l上酶切下强阳性抗原基因，将其 连接到PET28 (a)载体上，通过Kan+平板筛选阳性克隆。
[0104] 2.强阳性抗原蛋白的表达：将重组pET28 (a)载体转化B121 (DE3)表达菌株，挑取 阳性克隆制备种子液，按照1%接种到三角烧瓶中，37°C 250rpm摇瓶培养3h ;加 IPTG诱导 表达，IPTG终浓度为ImM，继续37°C 250rpm培养5h。
[0105] 3.细菌细胞裂解：收集细菌，将细菌冻融两次；将冻融两次后的细菌用10ml细菌 蛋白提取试剂B_PER(另加入DNase、RNase、PMSF等）裂解菌体，转移到烧杯中，缓慢搅拌 30min，超声处理10min。
[0106] 4.包涵体的处理：洗涤包涵体：15000rpm离心10min，收集沉淀；将沉淀用100ml 包涵体洗涤液重悬：先打散沉淀，转移到烧杯中，然后超声l_2min，彻底冲散沉淀，缓慢搅 拌 30min (洗涤液配方：0· 5M 尿素，0· 1M NaH2P04,0. 01MTris-HCl，0. 5% Triton-X100，pH = 8· 0) 〇
[0107] 溶解包涵体：将沉淀用100ml包涵体溶解液溶解：超声l-2min，彻底冲散沉淀，缓 慢搅拌30min ; 15000rpm离心10min，收集上清（溶解液配方：8M尿素 ，(λ 1M NaH2P04, (λ 01M Tris-HCl，pH = 8· 0)。
[0108] 5. Ni柱纯化：Ni柱用溶解液平衡；按照1ml柱体积对应10ml蛋白液，将二者混合， 200rpm，室温孵育30min ;将混合液上柱，收集柱后液体；用10倍柱体积洗涤液洗涤，收集洗 涤液（Ni 柱洗涤液配方：8M 尿素，0. 1M NaH2P04,0. 01M Tris-HCl，10mM 咪唑，pH = 8. 0);用 10倍柱体积洗脱液洗脱：收集洗脱液，lml/管（Ni柱洗脱液配方：8M尿素，0. 1M NaH2P04， 0. 01M Tris-HCl，500mM咪唑，pH = 8. 0) ;SDS-PAGE检测每个收集管中的蛋白纯度。
[0109] 6.蛋白复性：将纯化的蛋白溶液按照体积比1:10,在复性液中透析复性，4°C，每 隔5小时换新鲜的复性液，换3次；将经过复性的蛋白按照体积比1:10,在含10%甘油的 PBS中透析，4°C，每隔5小时换新鲜的透析液，换3次；SDS-PAGE检测；浓缩管浓缩蛋白溶液 至lml左右，测定蛋白浓度。
[0110] 由此可获得高纯度的重组强阳性抗原蛋白。
[0111] 实施例4制备曼氏血吸虫病酶联免疫诊断试剂盒
[0112] 1.包被抗原的固相载体：将蛋白抗原包被在聚苯乙烯反应孔中，包被液配方： 1. 5g Na2C03和NaHC03溶解在1000ml蒸馏水中。
[0113] 2.制备酶结合液采用HRP酶标记的鼠抗人IgG(H+L)抗体（Promega)。
[0114] 3.制备酶的底物液：TMB A液（每ml0.005 %醋酸钠-柠檬酸缓冲液中含有 3. 2 μ 11. 5% H202,4°C避光保存）；TMB B 液（TMB0.0 8g，加入 40ml DMS0 溶解后，加 60ml 甲 醇，混匀后加100ml0. 005%醋酸钠-柠檬酸缓冲液，避光振荡1小时，室温放置3小时，4°C 避光保存）；用前，A液和B液等体积混合。
[0115] 4.制备酶反应终止液：于600ml ddH20中缓慢滴加100ml浓硫酸，不断搅拌，定容 至 900ml。
[0116] 5.制备样本稀释液：5%奶粉/PBST。
[0117] 6.制备洗涤液：PBST。
[0118] 实施例5检测方法及操作程序
[0119] 1.样本稀释：用样本稀释液按照1 :100稀释待检血清。
[0120] 2.加样反应：样本检测孔每孔加100 μ 1稀释后的血清样本，每个样本平行检测2 个复孔。同时设阳性、阴性和空白对照个2复孔，取阳性和阴性对照品各100 μ 1加入孔内， 空白对照仅加样本稀释液。37 °C，避光孵育60分钟。
[0121] 3.洗涤：甩干孔内液体，每孔用洗涤液注满，静置2分钟，甩干，重复洗涤4次，最 后一次拍干。
[0122] 4.加酶：每孔加100 μ 1辣根过氧化物酶（HRP酶）标记的鼠抗人IgG(H+L)抗体， 37°C避光孵育1小时，如上洗涤，拍干。
[0123] 5.显色：每孔加100 μ 1酶底物显色液，37°C避光孵育10分钟；加终止液50 μ 1，立 即用酶标仪检测。
[0124] 6.读数及数据处理：用空白对照调零，于波长450nm处读取0D值；待测孔0D值大 于或等于阴性对照2. 1倍者为阳性，当阴性对照0D值低于0. 05时按0. 05计算。
[0125] 实施例6试剂盒特异性
[0126] 收集正常人，评价在正常人群中本试剂盒（阳性抗原-ELISA)的假阳性率，并与常 用的市售试剂盒SEA-ELISA进行比较。正常人群中SEA-ELISA和阳性抗原-ELISA假阳性 率比较结果显示，阳性抗原-ELISA比SEA-ELISA具有更好的特异性。
[0127] 实施例7试剂盒敏感性
[0128] 样品采集：收集确诊曼氏血吸虫的患者血清，并评价市售试剂盒SEA-ELISA和阳 性抗原-ELISA法的敏感性。
[0129] 以往的大量研究表明，SEA-ELISA的敏感度在80-95%左右，本研究结论与此前研 究结论基本一致。阳性抗原-ELISA的敏感度与SEA-ELISA相比一致或更佳。此外，由于SEA 是混合抗原，难以做到精确的质量控制，因此不同批次间往往会有一定的误差，而阳性抗原 蛋白是重组抗原，可以做到精确的质量控制，减少批次间的差异。
[0130] 实施例8抗原组合的特异性和敏感性
[0131] 收集曼氏血吸虫患者血清和正常人血清，比较单一抗原和不同组合抗原的诊断的 特异性和敏感性。结果表明，抗原组合的特异性与单一抗原无差异，但敏感性优于单一抗 原。
[0132] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种曼氏血吸虫抗原组合，其特征在于，所述的抗原组合包括两种或两种以上来自 下组的抗原： (a) 如SEQ ID NO. : 1-17所示的多肽； (b) 将SEQ ID NO: 1-17氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而形 成的具有免疫原性的衍生多肽； (c) 与SEQ ID NO :1-17所示氨基酸序列的同源性彡90%的、具有免疫原性的多肽；或 (d) 具有免疫原性的多肽（a) -（c)的片段； 其中，所述抗原组合中的抗原针对的抗体不相同。2. -种分离的多核苷酸组合，其特征在于，所述的多核苷酸组合中的多核苷酸分别编 码权利要求1所述抗原组合中的抗原。3. -种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所述的多核苷酸组合。4. 一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求3所述的 载体或染色体整合有权利要求2所述多核苷酸组合中的多核苷酸。5. -种制备曼氏血吸虫抗原组合的方法，所述方法包括步骤： (a) 在适合表达的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞； (b) 从培养物中分离出曼氏血吸虫阳性蛋白抗原。6. 曼氏血吸虫抗原或权利要求1所述抗原组合的用途，其特征在于，用于制备诊断 曼氏血吸虫的试剂或试剂盒,其中，所述的曼氏血吸虫抗原包括一种或多种选自SEQ ID NO. :1-17所述的多肽。7. -种检测曼氏血吸虫的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：容器或载体；以及 位于所述容器内或载体上的如权利要求1所述的抗原组合构成的检测试剂。8. -种抗原-抗体复合物，其特征在于，所述的复合物包括： ⑴一种或多种选自SEQ ID NO. : 1-17的多肽； (ii)与（ii)中的多肽特异性结合的抗体。9. 权利要求8所述抗原-抗体复合物的用途，其特征在于，所述复合物用于： (a) 制备检测曼氏血吸虫的试剂或试剂盒；和 (b) 用作检测曼氏血吸虫的阳性对照。10. -种诊断性或非诊断性检测样本中是否感染曼氏血吸虫的方法，包括步骤： (1) 制备SEQ ID NO. :1-17中任一所示的曼氏血吸虫抗原或其抗原组合； (2) 将步骤（1)得到的抗原或其抗原组合与待检测的样本接触； (3) 检测样本中是否含有权利要求9所示的抗原-抗体复合物； 其中，若步骤（3)中的样本出现所述的抗原-抗体复合物，则表明所述的样本感染了曼 氏血吸虫。
【文档编号】C12N1/19GK105884878SQ201410199590
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年5月12日
【发明人】李明, 徐新东, 吴英松
【申请人】广州市达瑞生物技术股份有限公司