一株转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌及其 构建方法与应用。
【背景技术】
[0002] 在淡水水体中，控制或减轻富营养化很大程度有赖于控制磷营养元素的输入。输 入水体的含磷营养物的来源是多方面的，包括自然过程和人类活动，但是真正引起水体内 磷过量而导致水体富营养化的原因主要还是人类活动。在我国含磷污染物主要来源为生活 污染源、农业污染源、畜禽污染源及工业污染源。为解决磷污染所带来的危害，在污水进入 水体前进行有效处理，降低排放污水中的磷浓度十分必要。
[0003]目前污水除磷技术主要分为两种，即化学除磷和生物除磷。在化学除磷技术中，以 化学沉淀法用的最多，其基本思路为在污水处理流程中的不同环节投加价格便宜的化学沉 淀剂，这些沉淀剂一般都有絮凝功能，沉淀剂与污水中的磷酸盐反应凝聚成颗粒状或非溶 解性的絮凝沉淀，从而将溶解性的磷去除。化学除磷具有操作简单、去除率高、运行稳定等 优点，但是对于磷浓度较低的城市污水而言，欲将低浓度的磷酸盐以化学沉淀的形式从水 溶液中分离，投加过量的化学沉淀剂是保障出水水质的基本条件，因此该法存在投药量大、 处理费用高、产生的化学污泥量大且富含有机质等弊端，不利于其在实际污水处理过程中 的应用。生物除磷技术主要来源于50年代末60年代初Srinath等人在生产运行中观察 到的超量吸磷现象，经过多年系统全面的基础研宄、生产性研宄及工程运行总结，形成了几 种主流的除磷工艺，主要包括A/0工艺、Phoredox(Bardenpho)工艺、氧化沟工艺以及序批 式活性污泥法（SBR)等，无论上述何种工艺利用的都是生物超量积累磷的原理。污水中磷 的生物去除主要有两种方式：一是微生物正常生长所需要的磷，随着生物体的排除而去除； 二是通过厌氧和好氧的交替运行使聚磷微生物（Phosphorusaccumulatingorganisms， PAOs)在厌氧条件下分解多聚磷酸盐（Polyphosphate，Polyp)的同时聚集聚0-轻基丁 酸（Poly-|3-hydroxybutyricacid，PHB)，在好氧条件下分解PHB以获得能量用于主动吸 收磷酸盐，并以Polyp的形式储存在体内，随着生物体的排除而去除。目前世界各国大规模 污水处理厂常用的除磷法主要是生物除磷，尤其是生物强化除磷法（Enhancedbiological Phosphorusremoval，EBPR)，因其具有污泥产生量少、不使用化学物质和运行经济等特征。 [0004] Polyp是由3-1000多个不等的正磷酸盐基团通过类似于腺嘌呤核苷三磷酸 (Adenosinetriphosphate，ATP)中的高能磷酸键连接而成的线性多聚体，它广泛存在于 细菌、真菌等低等单细胞生物和高等哺乳动物细胞中。尽管到目前为止，这种充满了高能 磷酸键的化合物的确切生理功能还未被完全认识清楚，但可以肯定的是它与多种生物功能 密切相关，这些功能包括：（1)磷酸盐及高能磷酸键的储藏库；（2)二价阳离子的螯合剂； (3)与核糖体蛋白相互作用促进翻译过程，并可能与错译的纠正有关；（4)促进严谨反应 (Stringentresponse)等；
[0005] 据目前所知，多条代谢通路和Polyp的合成相关，其中最为广泛接受的观点是多 数微生物中Polyp的合成是由其基因组编码的多聚磷酸盐激酶（Polyphosphatekinase，Ppk)来催化完成。Ppk包括两个两个家族，Ppkl和Ppk2,它们各自催化以下两种可逆反应：
【主权项】
1. 一株转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌，其特征在于，它是以弗氏柠檬酸杆菌为宿主，并 导入了宿主自身的多聚磷酸盐激酶Ppkl。
2. 根据权利要求1所述的转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌，其特征在于，所述的弗氏柠 檬酸杆菌的基因组DNA中只有Ppkl-种多聚磷酸盐激酶基因，且该Ppkl基因在基因组上 与外切聚磷酸酶基因Ppx的调控方式为双顺反子共转录。
3. 根据权利要求1所述的转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌，其特征在于，所述的弗氏柠 檬酸杆菌为弗氏柠檬酸杆菌ATCC 8090,所述的多聚磷酸盐激酶Ppkl基因的GenBank号为 ANAV01000007. 1。
4. 权利要求1所述的转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌的构建方法，其特征在于，包括如 下步骤： (1) 提取弗氏柠檬酸杆菌的基因组DNA; (2) 以步骤⑴得到的基因组DNA为模板，PCR扩增得到其自身来源的多聚磷酸盐激酶 Ppkl基因； (3) 用T4连接酶将步骤⑵得到的多聚磷酸盐激酶Ppkl基因连接到T-Vector pMD19 载体上，得到T-Ppkl质粒； ⑷用限制性内切酶双酶切T-Ppkl质粒和广宿主表达质粒pBBRlMCS-2,得到Ppkl基 因片段和线性化的PBBR1MCS-2 ; (5) 用T4连接酶将步骤（4)得到的Ppkl基因片段与线性化的pBBRlMCS-2连接，得到 连接有Ppkl基因的pBBRIMCS-Ppkl质粒； (6) 以弗氏柠檬酸杆菌为受体菌，将步骤（5)得到的pBBRIMCS-Ppkl质粒通过电转化的 方法导入受体菌，得到转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌。
5. 权利要求1所述的转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌在废水除磷中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的废水，其中磷含量为0. 1?20mg/ L〇
7. -种提高菌株在废水中聚磷能力的方法，其特征在于，该方法是以基因组上只有 Ppkl -种多聚磷酸盐激酶基因的菌株为宿主菌，该宿主菌中Ppkl基因在其基因组上与外 切聚磷酸酶基因Ppx的调控方式为双顺反子共转录，通过PCR的方法获得该宿主菌的Ppkl 基因，并构建到表达质粒中，最后将连接有Ppkl基因的表达质粒转化该宿主菌，得到转聚 磷基因的宿主菌，所述的宿主菌为：鲍氏不动杆菌、丙酮丁醇梭菌、盐红螺菌、亚硝化单胞 菌、沙雷氏菌或希瓦氏菌。
【专利摘要】本发明公开了一株转聚磷基因的弗氏柠檬酸杆菌，它是导入了来源于其自身的多聚磷酸盐激酶Ppk1基因的弗氏柠檬酸杆菌。该弗氏柠檬酸杆菌基因组DNA中只有多聚磷酸盐激酶基因Ppk1，并且Ppk1基因和外切聚磷酸酶基因Ppx的调控方式为双顺反共转录。具备以上特征的细菌均可通过以宿主菌自身为受体表达其自身来源的Ppk1基因来提高聚磷能力。本发明还公开了上述转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌的构建方法和在废水除磷中应用。本发明得到的转聚磷基因弗氏柠檬酸杆菌具有去磷能力强的特点。
【IPC分类】C02F3-34, C12N1-21, C12N15-74, C12R1-01
【公开号】CN104531599
【申请号】CN201510008195
【发明人】杨柳燕, 王鑫, 陈旭, 张文, 李丽, 王爱丽, 吴丹
【申请人】南京大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月7日