一株香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌bz11的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物，特别涉及降胆固醇、耐氧双歧杆菌。
【背景技术】
[0002] 胆固醇广泛存在于动物组织细胞中，是构成细胞的重要成分之一，在人体中发挥 着重要的生理作用，它在体内转化形成类固醇激素，是合成维生素D以及胆汁酸的前体物 质。体内胆固醇主要有两个来源，一是食物，二是内源合成。有些人由于不合理膳食习惯， 血液胆固醇含量超过正常指标；而体内胆固醇含量过高会造成动脉粥样硬化、冠心病等心 脑血管疾病，严重威胁到人类健康。据报道，全球心脑血管疾病引起人类死亡的人数占总死 亡人数的29%，根据世界卫生组织预测，到2030年，心脑血管疾病仍将是导致人类死亡的 主要原因，而血清中的胆固醇过高是引发冠心病、动脉硬化、脑中风等心脑血管疾病的重要 因素。有研究发现与拥有正常血脂的人相比，高胆固醇血症的人患心脏病的风险是其正常 人的3倍。因此，通过降低血清胆固醇水平来对心脑血管疾病进行防治是一种实效可行的 研究方向，具有潜在的应用价值和广阔是市场空间。
[0003] 欲降低体内胆固醇，除了通过合理饮食以外，运用生物转化法，特别是运用益生菌 对胆固醇进行直接降解已成为研究的趋势。双歧杆菌作为人体肠道内的一类益生菌，其益 生作用有维持肠道内菌群平衡、降低血清胆固醇、抗肿瘤等益生作用。而贵州香猪是贵州省 特色资源，属于小型猪，其遗传稳定，器官结构和功能与人体相似。因此，从香猪中筛选出来 的双歧杆菌易于为人体所接受和利用。
[0004]目前中国专利数据库中，涉及双歧杆菌的专利申请件很多，但涉及耐氧双歧杆菌 的专利申请件仅有浙江大学申请的ZL2009100965117号《一种耐氧性双歧杆菌》和天津科 技大学申请的ZL2011100894937号《一种耐氧耐酸性长双歧杆菌》。这两个双歧杆菌能否降 胆固醇不得而知。迄今为止，尚无涉及降胆固醇、耐氧动物双歧杆菌的申请件。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一株香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌，使之有可能作为益生菌 进一步深度开发利用，添加到发酵乳制品中使其成为功能性食品，以降低人体胆固醇含量， 促进人类健康。
[0006] 发明人提供的香猪源性降胆固醇、耐氧双歧杆菌，该菌株为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.Lactis)，该菌株的纯培养物已于 2014 年 12 月 18 日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，该中心地址是：中国北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101 ;保藏编号 为CGMCCN0. 10224,简称为动物双歧杆菌乳亚种BZ11。该菌株是从贵州特色资源小香猪的 肠道内溶物中筛选与分离纯化得到。
[0007]上述动物双歧杆菌乳亚种BZ11的形态特征及生理生化特征菌均接近于双歧杆 菌属，其16SrRNA基因序列与动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacteriumanimalissubsp. Lactis)的16SrRNA序列同源性为100%，根据《伯杰氏系统细菌学手册》中双歧杆菌 属的分类规定，动物双歧杆菌乳亚种BZ11属于放线菌门（Actinobacteria)、放线菌纲 (Actinobacteria)、放线菌亚纲（Actinobacteridae)、双歧杆菌目（Bifidoacteriales)、 双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae)、双歧杆菌属（Bifidobacterium)，动物双歧杆菌乳亚 种（Bifidobacteriumanimalissubsp.Lactis)〇
[0008] 上述动物双歧杆菌BZ11的安全性如下：该菌株对青霉素G、哌拉西林、阿莫西林/ 棒酸、万古霉素、头孢噻肟、头孢唑啉、阿奇霉素、利福平、呋喃妥因9类抗生素敏感，对环丙 沙星、新霉素、复方新诺明、氧氟沙星、诺氟沙星和多粘菌素B共6类抗生素耐药。青霉素类 药物中，该菌株对氨苄西林敏感；头孢素类药物中，该菌株对头孢哌酮敏感；大环内酯类药 物中，菌株BZ11对乙酰螺旋霉敏感；喹诺酮类药物中，该菌株对林霉素敏感。且通过灌胃小 鼠实验，表明动物双歧杆菌乳亚种BZ11菌株无急性毒性，因此可以初步证实BZ11菌株的安 全性，可以考虑作为益生菌进一步深度开发利用。并通过灌胃小鼠实验进一步验证了其体 内降胆固醇作用。
[0009] 发明人提供的菌株是从贵州特色资源小香猪肠道内溶物中分离并初步筛选出具 有降胆固醇能力的双歧杆菌，并对所得的菌株以降胆固醇率、耐酸耐胆盐受性为指标进行 进一步的复筛，复筛出一株胆固醇去除率高且耐酸受性、耐胆盐受性均良好的双歧杆菌菌 株，然后进行耐氧性能实验、安全性评价实验及灌胃小鼠实验，之后通过对该菌株进行形态 学、生理生化试验鉴定和16SrRNA序列鉴定，最终鉴定出此菌株为动物双歧杆菌乳亚种 (Bifidobacteriumanimalissubsp.Lactis)〇
[0010] 为了验证本发明的菌株，发明人进行了如下实验：
[0011] ⑴样品的采集与分离纯化
[0012] 从贵州省特色资源小香猪的多个部位采样，包括小肠、大肠以及新鲜的小香猪粪 便中，编号并记录，并迅速带回实验室处理。取log的新鲜样品放入装有90mL的无菌生理盐 水中，人工摇匀后，在洁净工作台内用移液枪吸取lOOul混合液涂布于含有Li-Mupirocin 的MRS平板上，置于厌氧培养箱（厌氧环境为N2:C02:H2=90 : 5 : 5)中，37°C培养 48h，然后挑取单菌落接种于含有X-gal的PTYG平板上，放入37°C、20 % 0)2浓度的二氧化碳 培养箱中培养两天，观察菌落颜色、形态并进行革兰氏染色、镜检，记录菌株形态特征。将 疑似双歧杆菌菌株在PTYG平板上纯化传代4次后，甘油保藏于-80°C的超低温冰柜中。
[0013] 上述MRS琼脂培养基成分为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，吐 温 801mL，K2HP042g，醋酸钠 5g，柠檬酸二铵 2g，MgS04 ? 7H20 0? 58g，MnS04 ? 4H20 0? 25g，琼 月旨20g;制法是将各成分加热溶解于lOOOmL蒸馏水中，调pH值至6. 5,121°C灭菌15min，备 用。
[0014] 上述含有Li-Mupirocin的MRS中，lOOmLMRS琼脂培养基含有5mg的莫匹罗星锂盐 (Li-Mupirocin)〇
[0015] 上述PTYG液体培养基成分为：胰蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉10g，葡萄糖 l〇g，吐温801mL，盐溶液40mL;制法是将各成分加热溶解于1000mL蒸馏水中，调pH值至 6. 5,121°C灭菌 15min，备用。
[0016]上述培养基中的盐溶液成分为：无水CaCl20. 2g，K2HP041. 0g，KH2P041. 0g，MgS04 *7H 20 0. 48g，Na2C0310g，NaCl2g;制法是将CaCl#PMgS04 ? 7H20 混合在 300mL蒸馏水中直至 溶解，加入500mL水，搅拌同时缓慢加入其他盐类，直至溶解；再加入200mL蒸馏水，混合后 贮存于4°C，备用。
[0017] 上述PTYG琼脂培养基制法为：在每1000mL的液体培养基中加入20g琼脂粉，加热 煮沸，121°C灭菌15min后倾注平板，备用。
[0018] 上述含有X-gal的PTYG(PTYG-X)培养基制法为：在每1000mL的改良PTYG培养基 中加入X-gal40mg，由于X-gal不耐高温，直接