N稳定同位素标记的蓝藻及其生物培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种15N稳定同位素标记的蓝藻及其生物培养方法，属于藻类培育领 域。
【背景技术】
[0002] 蓝藻是一类能够进行植物型产氧光合作用的原核生物，其适应性强，兼有植物及 细菌的一些特性，因此又被称为蓝细菌。蓝藻广泛分布在地球上的各类型水体和一些陆生 环境，是水体中最重要的原初生产者。蓝藻除能进行光能自养型生长外，约有一半的蓝藻能 在光照条件下利用外源有机物进行混合营养型生长，少数蓝藻还能在完全无光条件下利用 外源有机物进行化能异养型生长。
[0003] 集胞藻（Synechocystissp.)是一类单细胞非固氮蓝藻，生活在淡水中，能进行植 物性的光合作用[1]。由于其遗传操作系统成熟、遗传背景清晰，因此被作为一种模式系统而 广泛应用于光合作用研究，同时它也是藻类分子生物学研究的重要对象和藻类基因工程中 常用的表达系统。
[0004] 随着稳定同位素示踪技术的飞速发展，越来越多的学者开始利用15n稳定同位素 研究藻类[2_5]。15N稳定同位素技术具有灵敏度高、藻类吸收试验时间短、氮吸收的关键过程 更清楚等优点。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是：提供一种15N稳定同位素标记的蓝藻及其生物培 养方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供了一种15N稳定同位素标记的蓝藻，其体内的氮原子被稳定同位素15N 取代。
[0008] 同时，本发明还提供一种培养15N稳定同位素标记蓝藻的方法，包括下列步骤：
[0009] (1)蓝藻富集培养
[0010] 取蓝藻藻液，以3 200r/min的速度离心5min，去掉上清液后用无氮培养基洗涤， 再次离心去上清液，如此重复2-5次，接种于装有培养液的三角瓶中，
[0011] 培养箱光源为日光灯，光照2OOOlux，光暗周期为12h/12h，温度为25°C，250mL三 角瓶，每瓶培养液的体积为150mL，pH值为7. 0,取对数生长期的藻接种，每天手摇瓶3次；
[0012] (2)15N-蓝藻的培养
[0013] 将富集的蓝藻转接到15N稳定同位素标记的蓝藻培养基中进行混合营养培养，在 培养基中加入5.2g/L葡萄糖，培养在封闭式光生物反应器中进行，反应器中包括三支30W 日光型荧光灯，入射光强度7 000lux，培养温度25°C，搅拌速度400转/分钟，空气流量为 2.OL/min，连续光照，培养1-2周。
[0014] 优选的，步骤（2)中培养时间是10天。
[0015] 本发明所述的蓝藻是集胞藻。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 本发明的培养工艺和配方，适宜15n稳定同位素标记集胞藻生长。得到的藻种产品 丰度高，生产成本低。
【附图说明】
[0018] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0019] 图1培养前，集胞藻稳定同位素质谱m/z28[14N14N]和m/z29[14N15N]质谱图。
[0020] 图2培养后，未调整接收杯电阻前，集胞藻稳定同位素质谱m/z28[14N14N]和m/z 29[14N15N]质谱图。
[0021] 图3培养后，调整接收杯电阻后，集胞藻稳定同位素质谱m/z28[14N14N]和m/z 29[14N15N]质谱图。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1本实施例提供了一种培养15N稳定同位素标记集胞藻的方法，包括下列步 骤：
[0023] (1)集胞藻富集培养
[0024] 取集胞藻藻液，以3 200r/min的速度离心5min，去掉上清液后用无氮培养基洗 涤，再次离心去上清液，如此重复2-5次，接种于装有培养液的三角瓶中。
[0025] 培养箱光源为日光灯，光照2OOOlux，光暗周期为12h/12h，温度为25°C，250mL三 角瓶，每瓶培养液的体积为150mL，pH值为7. 0,取对数生长期的藻接种，每天手摇瓶3次。
[0026] (2)15N-集胞藻的培养
[0027] 将富集的蓝藻转接到15N稳定同位素标记的蓝藻培养基中进行混合营养培养，在 培养基中加入5. 2g/L葡萄糖。培养在封闭式光生物反应器中进行，反应器中包括三支30W 日光型荧光灯，入射光强度7 000lux，培养温度25°C，搅拌速度400转/分钟，空气流量为 2.OL/min，连续光照，培养10天。
[0028] 对上述方法培养的集胞藻进行分析。
[0029] (1)指标测试部分 [0030] 1仪器、试剂与材料
[0031]DELTAV型同位素比质谱仪由美国ThermoFisherScientific公司制造，Flash 2000HT型元素分析仪与主机DELTAV联机，配连续流装置ConFloIV，构成EA-IRMS系统 在线测定固体样品15N、14N同位素组成。
[0032] 所用标准物质为USGS40(S15N= -4. 42+0. 06%。，氮元素含量为9. 52% )。
[0033]2实验理论基础
[0034] 在大气中，15N作为一种较稳定的同位素存在，其丰度是稳定而均匀的，平均丰度 0. 3663%，被认为是15N标准同位素丰度[11]。在自然界中，动植物以及环境中15N原子丰度 与0.3663%的差异非常小，为了放大差异便于比较和研究，通常以样品中的15N的相对比值 (S15N)表示其丰度。其计算公式为：
【主权项】
1. 15N稳定同位素标记的蓝藻，其特征在于，其体内的氮原子被稳定同位素15N取代。 2. 15N稳定同位素标记的蓝藻的培养基，其特征在于，培养基配方如下： UNaN03, 1.5g/L； 2, K2HP〇3 ? 3H20 0. 052g/L； 3, MgS04*7H20 0.075g/L； 4, CaCl2 ? 2H20 0. 036g/L； 5, 朽1 檬酸 6. Omg/L ; 6, EDTANa2 1. Omg/L ； 7, NaC03 0.02g/L； 8, H3B03 2.86mg/L; 9, MnCl2 .4H20 1.86mg/L; 10, ZnS04 ? 7H20 0. 22mg/L； 11, Na2Mo04 ? 2H20 0? 39mg/L ; 12,CuS04 ?5H20 0. 08mg/L； 氮源是NaN03，氮源的氮原子采用15N进行标记。
3. -种培养15N稳定同位素标记蓝藻的方法，其特征在于，包括下列步骤： (1) 蓝藻富集培养 取蓝藻藻液，以3 200 r /min的速度离心5 min，去掉上清液后用无氮培养基洗涤，再 次离心去上清液，如此重复2-5次，接种于装有培养液的三角瓶中； 培养箱光源为日光灯，光照2 000 lux，光暗周期为12 h/ 12h，温度为25°C，250 mL 三角瓶，每瓶培养液的体积为150 mL，pH值为7.0,取对数生长期的藻接种，每天手摇瓶3 次； (2) 15N-蓝藻的培养 将富集的蓝藻转接到15N稳定同位素标记的蓝藻培养基中进行混合营养培养，在培养 基中加入5. 2g/L葡萄糖，培养在封闭式光生物反应器中进行，反应器中包括三支30W日光 型荧光灯，入射光强度7 000 lux，培养温度25°C，搅拌速度400转/分钟，空气流量为 2. OL/min，连续光照，培养1-2周。
4. 根据权利要求3所述的培养15N稳定同位素标记蓝藻的方法，其特征在于，步骤（2) 中培养时间是10天。
5. 权利要求1或2所述的蓝藻是集胞藻。
【专利摘要】本发明公开了一种15N稳定同位素标记的蓝藻及其培养方法，所述蓝藻体内氮原子被稳定同位素15N取代。方法包括下列步骤：（1）蓝藻富集培养；（2）15N-蓝藻的培养。本发明的培养工艺和配方，适宜15N稳定同位素标记集胞藻生长。得到的藻种产品丰度高，生产成本低。
【IPC分类】C12N1-20, C12R1-01
【公开号】CN104531584
【申请号】CN201410851447
【发明人】吴振兴, 贾俊涛, 赵华梅, 吕宁, 静平, 李正义, 唐静
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月31日