一种基于稳定同位素标记的磷脂分类检测和定量方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及磷脂定量检测方法技术领域，特别是涉及一种基于稳定同位素标记的 磷脂分类检测和定量方法。
【背景技术】
[0002] 磷脂不仅是细胞膜的重要组成成分，也广泛参与调节多种生命活动过程，包括能 量转换、物质运输、信息识别与传递、细胞发育和分化，以及细胞凋亡等。磷脂的异常代谢与 动脉硬化症、糖尿病、肥胖症、Alzheimer病以及肿瘤发生也密切相关。因此，从"组学"的 角度出发，系统性、规模性地研究磷脂分子在不同生理或病理状态下组成及相对量的动态 变化分析，对揭示磷脂代谢与细胞、器官乃至机体的生理、病理过程之间的关系及其分子机 理，进而发掘与疾病发生相关的重要生物标记物，促进疾病的早期诊断和治疗具有重要的 意义。
[0003] 近年来，基于生物质谱的定量分析技术因其高灵敏度、高分辨率、高准确性和高通 量性等特点，已经成为磷脂定量分析的主要工具。然而，目前不同样本磷脂分子的质谱鉴定 和定量通常是分开分析，然后通过内标进行参比或定量，具有一定的局限性。例如，目前商 品化的磷脂内标不仅价格昂贵，种类有限，而且由于磷脂分子含有不饱和双键，容易氧化， 其保存有一定的限制。磷脂分子的电离化效率也容易受到不同时间离子喷雾稳定性、脂肪 酸链长度和不饱和度对离子效率的影响等不同因素的影响，从而可能导致质谱定量的时候 引入一定的误差。另一方面，利用电喷雾离子化-质谱（ESI-MS)进行磷脂类脂质分子分析 和定量时，不同种类的磷脂分子因自身结构（主要是极性头部）及溶液组成的差异具有不 同的离子化倾向，从而导致在利用ESI-MS对生物样本中的磷脂组进行定性和定量分析时 要结合正离子和负离子模式，从而导致分析时间的增长。同时，在负离子模式下，部分磷脂 的检测灵敏度相对较低。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明提供一种基于稳定同位素标记的磷脂分类检测和定量方法，其 通过比较轻、重同位素标记的质谱峰信号的相对强弱，关联于样本中磷脂分子的量，其可以 达到对磷脂进行相对定量的目的。其具有增强的灵敏度，并在较短的时间内完成。
[0005] 为了达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：
[0006] 本发明提供的基于稳定同位素标记的磷脂分类检测和定量方法包括以下步骤：
[0007] 步骤1:从待检测样本中提取待检测磷脂；
[0008] 步骤2 :在甲基叔丁基醚/甲醇/IN盐酸溶液体系中，使三甲基硅重氮甲烷原位生 成重氮甲烷；在甲基叔丁基醚/氘代甲醇/IN氘代盐酸溶液体系中，使三甲基硅重氮甲烷原 位生成氘标记的重氮甲烷；
[0009] 步骤3 :所述重氮甲烷将所述待检测磷脂分子中的磷酸基团或羧酸基团甲酯化， 产生轻同位素标记的磷酸甲酯化衍生物；所述氘标记的重氮甲烷将待检测磷脂分子中的磷 酸基团或羧酸基团甲酯化，产生重同位素标记的磷酸甲酯化衍生物；
[0010] 步骤4 :将所述轻同位素标记的磷脂甲酯化衍生物和重同位素标记的磷脂甲酯化 衍生物混合后，电离样本中分别经过轻同位素甲酯化衍生、重同位素甲酯化衍生的磷脂分 子，产生一对具有质量差异的分子离子峰，所述待检测的离子种类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰 乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、溶血性磷脂酰胆碱、溶血性磷脂 酰乙醇胺、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂酰肌醇；
[0011] 步骤5 :在所述磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酰胆碱、溶 血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂 酰肌醇上，分别选取加合H+的离子；
[0012] 在磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇上，分别选取加合NH4+的离子；
[0013] 根据所述步骤4中不同种类离子的质谱裂解规律，设定不同的中性丢失或前提离 子扫描模式，利用质谱对所述步骤3中离子进行分类检测，得到所述步骤4中不同种类离子 的质谱离子信号的量；
[0014] 步骤6:通过比较所述轻同位素标记的磷酸甲酯化衍生物和重同位素标记的磷酸 甲酯化衍生物的质谱峰信号的相对强弱，关联于样本中待检测磷脂分子的量，得到样本中 不同种类磷脂分子的相对量。
[0015] 本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
[0016] 作为优选，利用质谱对所述步骤4中离子进行分类检测时，选用液相色谱一质谱 联用的方式检测，或者，选用直接进样-质谱检测。
[0017] 作为优选，所述甲基叔丁基醚/甲醇/IN盐酸溶液体系中，甲基叔丁基醚、甲醇、IN 盐酸的体积比为300 :90 :4。
[0018] 作为优选，所述甲基叔丁基醚/氘代甲醇/IN盐酸溶液体系中，甲基叔丁基醚、氘 代甲醇、IN氖代盐酸的体积比为300 :90 :4。
[0019] 作为优选，将所述轻同位素标记的磷酸甲酯化衍生物和重同位素标记的磷酸甲酯 化衍生物混合进行质谱检测时，溶液体系为氯仿/甲醇/醋酸铵溶液体系，所述醋酸铵的浓 度为5mM~10禮，所述氯仿、甲醇的体积比为（1~2) : 1。
[0020] 作为优选，所述磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、 溶血性磷脂酸、溶血性磷脂酰乙醇胺、溶血性磷脂酰甘油、溶血性磷脂酰丝氨酸、溶血性磷 脂酰肌醇利用中性丢失扫描进行检测和定量；所述磷脂酰胆碱、溶血性磷脂酰胆碱利用前 体离子扫描进行检测和定量。
[0021] 作为优选，利用中性丢失扫描对所述磷脂酸进行检测和定量时，轻同位素标 记的磷脂酸，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇利用中性丢失 扫描进行检测，中性丢失分别为 143Da(126Da+NH3)，15?a，203Da(186Da+NH3)，213Da， 291Da(274Da+NH3);磷脂酰胆碱利用前体离子扫描，前体离子的质/荷比为198. 0±0. 5 ;轻 同位素标记的溶血性磷脂酸，溶血性磷脂酰乙醇胺，溶血性磷脂酰甘油，溶血性磷脂酰丝氨 酸和溶血性磷脂酰肌醇利用中性丢失扫描进行检测，中性丢失分别为126Da，15?a，186Da， 213Da，274Da;溶血性磷脂酰胆碱利用前体离子扫描，前体离子为质/荷比为198. 0±0. 5 ;
[0022] 利用中性丢失扫描对溶血性磷脂酸进行检测和定量时，重同位素标记的磷脂酸， 磷脂酰乙醇胺，磷脂酰甘油，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇利用中性丢失扫描进行检测，中性 丢失分别为 147Da(126Da+NH3)，157Da，2〇roa(188Da+NH3)，217Da，293Da(276Da+NH3);磷脂 酰胆碱利用前体离子扫描，前体离子的质/荷比为200. 0±0. 5 ;重同位素标记的溶血性磷 脂酸，溶血性磷脂酰乙醇胺，溶血性磷脂酰甘油，溶血性磷脂酰丝氨酸和溶血性磷脂酰肌醇 利用中性丢失扫描进行检测，中性丢失分别为130Da，157Da，188Da，217Da，276Da;溶血性 磷脂酰胆碱利用前体离子扫描，前体离子为质/荷比为200. 0±0. 5。
[0023] 作为优选，所述待测样本为生物样本。
[0024] 作为优选，所述待测样本中添加有抗氧化剂。
[0025] 作为优选，所述抗氧化剂为二丁基羟基甲苯。
[0026] 作为优选，所述二丁基羟基甲苯的添加量为待测样本（体积）的0? 01~0? 03%。
[0027] 作为优选，向所述待测样本中添加抗氧化剂时，环境温度为4~KTC。
[0028] 作为优选，所述待测样本的保存方式为冷冻保存。
[0029] 作为优选，在所述步骤1和步骤2之间，还包括洗涤的步骤。
[0030] 作为优选，利用质谱对所述步骤2中离子进行分类检测时，选用直接进样质谱，所 述进样装置为注射栗。
[0031] 作为优选，利用质谱对所述步骤2中离子进行分类检测时，选用直接进样质谱，所 述进样装置为自动纳喷离子源直接进样系统。
[0032] 作为优选，在所述步骤4中，通过比较所述轻同位素标记的磷酸甲酯化衍生物和 重同位素标记的磷酸甲酯化衍生物的质谱峰信号的相对强弱，关联于样本中待检测磷脂分 子的量，得到样本中不同种类磷脂分子的相对量，运算方式为：
[0033] C轻标/C18标=I轻标/1重标，
[0034] C轻标和Ca标分别代表样本中轻、重同位素标记的磷脂分子的浓度，而I轻标和Ia标则 分别代表样本中轻、重同位素标记的磷脂分子的质谱峰强度。
[0035] 作为优选，还包括以下步骤：
[0036] 步骤7 :通过与内标比较，将所述步骤4得到的所述步骤3中不同种类离子的质谱 离子信号的量关联于样本中磷脂分