Etn，lysoPtdGro,IysoPtdSer 和IysoPtdIns利用中性丢失扫描进行检测，中性丢失分别为130Da，157Da，188Da，217Da， 276Da;IysoPtdCho利用前体离子扫描，前体离子为质/荷比为200. 0±0. 5 ;
[0078] 实施例
[0079] ①样本和试剂制备
[0080] 试剂：各种分析纯的化学试剂（除非有特殊说明）均购自Sigma-Aldrich公司 (St.Louis，USA);实验所需要的水均采用Mili-Q超纯水制造系统（美国Milipore公司）生 产的Milli-Q水；三甲基娃基重氮甲烧（IUPACname= (diazomethyl)-trimethylsilane， TMS-diazomethane) (2M溶于正己烧）、氖代甲醇（methanol_D4)、氖代盐酸（Deuterium Chloride)和氖代水（Deuteriumoxide)购自于AcrosOrganics公司；色谱级纯度甲基 叔丁基酿（methyltert-butylether,MTBE)、甲醇（methanol)、氯仿（Choloform)、乙酸 (Aceticacid)为J.T.Baker公司（Phillipsburg，PA，USA)产品。
[0081] 内标：可选择可单独检测的同位素标记的磷脂分子或选取样本中不存在或含量极 低的磷脂加入样本作为内标。本实施例选取C17:0/C14:1-PtdCho,C17:0/C14:1-PtdEtn， C17:0/C14:I-PtdGro,C17:0/C14:I-PtdSer,C17:0/C14:1-PtdH,C17:0/C14:l-Ptdlns, C17 : 1-lysoPtdCho,C17 : 1-lysoPtdEtn,C17 : 1-lysoPtdGro,C17:I-IysoPtdSer, C17:1-lysoPtdH和C17:1-lysoPtdIns作为内标。
[0082] 溶液配置：（a)普通衍生化前洗液：甲基叔丁基醚/甲醇/0.OlN盐酸溶液，体积比 例为MTBE:MeOH: 0.0IN盐酸=100:30:25,取下相；（b)衍生化后洗液：甲基叔丁基醚/甲 醇/水溶液，体积比例为MTBE:Me0H:H20 = 100:30:25,取下相。
[0083] ②磷脂提取
[0084]将不同来源生物样本，诸如血浆（IOyL)、细胞（~5XIO5个）及组织（IOmg)等， 放入耐有机溶剂腐蚀的eppordorft管，并掺入（a)中所述的磷脂内标，每一种内标的用量 为0. 4nmol;将I. 3mL甲基叔丁基醚/甲醇（10:3,v/v)溶液，室温震荡Ih;往上述溶液加 入0. 25mL去离子水，充分震荡后，室温放置IOmin;1，OOOg离心10分钟后可见明显的分层， 收集上层溶液（有机相）至新的eppordorft管；下层溶液则与I. 55mL甲基叔丁基醚/甲 醇/水（10:3:2. 5,v/v/v)溶液的上层溶液合并，依上述再萃取一次，收集上层溶液与前述 的上层溶液合并；将收集的该上清进行真空、冷冻浓缩干燥，即为提取的磷脂提取物，在进 一步处理前，-80°C冰箱冷冻收藏。
[0085] ③磷脂的甲酯化衍生
[0086] 衍生化前洗涤：将磷脂提取物重溶于682. 5yL甲基叔丁基醚/甲醇/2N盐酸 (500:150:32. 5,v/v/v)，重稳定同位素标记时，则为甲基叔丁基醚/氘代甲醇/2N氘代盐酸 (500:150:32. 5,v/v/v)，加入250yL0?IN盐酸（重同位素标记时为氘代盐酸），充分震荡 后于4°C离心（6, 500Xg) 10分钟，将上清转移至新的eppendorft管并加入500yL甲基叔 丁基醚/甲醇/0.01N盐酸（100:30:25，v/v/v)溶液的下相（重稳定同位素标记时，则为甲 基叔丁基醚/氘代甲醇/2N氘代盐酸（500:150:32. 5,v/v/v))，依以上步骤再洗涤一次，并 收集上层溶液至新的eppendorft管，S卩为洗涤后的磷脂提取物（~0. 5mL)。
[0087] 将50yL三甲基硅重氮甲烷溶液（2M，溶于正己烷）加入上述洗涤后的磷脂提取物 (可见明显的黄色），室温旋转孵育20分钟；加入3y1乙酸中和甲酯化反应（可见黄色褪 尽）冲和后，将轻、重同位素标记的磷脂和溶血性磷脂衍生物混合，加入500iil甲基叔丁 基醚/甲醇/水（100:30:25,v/v/v)的下相，充分震荡后，l，500Xg离心3分钟，收集上相 并重复上述洗涤步骤一次；将收集的该上清进行真空、冷冻浓缩干燥，即为甲酯化衍生的磷 脂提取物，在质谱分析前，-80 °C冰箱冷冻收藏。
[0088] ④磷脂甲酯化衍生物的质谱分析
[0089] 利用配备有自动纳喷离子源直接进样系统（TriversaNanomate'? ,Advion Biosciences)的TSQVantages(ThermoFisherScientific,Bremen)。纳喷柱的内径为 5. 5ym。软件控制系统为ChipSoftTMSoftware(AdvionBiosciences),参数如下：
[0090] a)正尚子模式，尚子化电压为I. 25kV;
[0091] b)气体背压为0? 5psi;
[0092] c)将预先润洗Tip头和吸取样品后继续吸IyL空气的参数设定为开启，以防止 Tip头中的样品在机械臂移动过程中流出；
[0093] 质谱系统的参数如下：
[0094] a)离子传输管的温度为 190°C，S-Lens的RFAmplitude为 217 ;
[0095] b)中性丢失或前体离子扫描的碰撞能为40eV,dwellingtime为500ms，质谱分辨 率为IDa;
[0096] c)每个中性丢失或前体离子扫描采集3min;
[0097] d)质谱质量范围设定为m/z400-1200。
[0098] ⑤磷脂的相对定量
[0099] 通过比较所述轻同位素标记的磷酸甲酯化衍生物和重同位素标记的磷酸甲酯化 衍生物的质谱峰信号的相对强弱，关联于样本中待检测磷脂分子的量，得到样本中不同种 类磷脂分子的相对量，运算方式为：
[0100] C轻标/Gj8标=I轻标/1重标，
[0101] C轻标和Ca标分别代表样本中轻、重同位素标记的磷脂分子的浓度，而I轻标和Ia标则 分别代表样本中轻、重同位素标记的磷脂分子的质谱峰强度。
[0102] ⑥磷脂的绝对定量
[0103] 生物样本中的磷脂定量主要通过与加入的内标进行参比，计算甲酯化磷脂分子的 量，进而关联与样本中相应磷脂的量。磷脂甲酯化衍生物的定量如下：
[0104] Cu标/Cu标内标-I重标/I重标内标'
[0105] 其中，(:^代表样本中重同位素标记的磷脂分子的浓度，Ig代表样本中重同位素 标记的磷脂分子的质谱峰强度；
[0106] 代表重同位素标记样本中加入的磷脂内标对应的浓度，代表重同位 素标记样本中加入的磷脂内标对应的质谱峰强度；
[0107] C轻标/C轻标内标-I轻标/1轻标内标'
[0108] 其中，Cfag代表样本中轻同位素标记的磷脂分子的浓度，Ifag代表样本中轻同位素 标记的磷脂分子的质谱峰强度；
[0109] 代表轻同位素标记样本中加入的磷脂内标对应的浓度，代表轻同位 素标记待测样本中加入的磷脂内标对应的质谱峰强度。
[0110] ⑦安全注意事项
[0111] 尽管TMS-diazomethane使用之初是作为一种低毒性的重氮甲烷的替代物。但是 吸入过量的TMS-diazomethane也会引起肺和中枢神经系统的损伤。因此，建议在衍生化或 标记过程均在带有防护的通风橱中进行。过量的TMS-diazomethane必须用乙酸中和。乙 酸中和的过程是一个产生氮气的过程，在处理大量样本的时候必须小心操作并注意防护。
[0112] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造 性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优 选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0113] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精 神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围 之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
【主权项】
1. 一种基于稳定同位素标记的磷脂分类检测和定量方法，其特征在于，包括以下步 骤： 步骤1:从待检测样本中提取待检测磷脂； 步骤2 :在甲基叔丁基醚/甲醇/I