用高分辨率质谱法量化胰岛素样生长因子-i和胰岛素样生长因子-ii的制作方法
【专利说明】用高分辨率质谱法量化胰岛素样生长因子-I和胰岛素样 生长因子-M
[0001] 本申请是分案申请，原申请的申请日为2010年11月4日、申请号为 2010800501946 (PCT/US2010/055518)、发明名称为"用高分辨率质谱法量化胰岛素样生长 因子-I和胰岛素样生长因子-II"。
[0002] 相关专利申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2009年11月5日提交的美国临时申请系列号61/258, 560和于2010 年10月29日提交的美国临时申请系列号61/408, 535的优先权，其通过参考以其包括所有 图和表的整体并入本文。 发明领域
[0004] 本发明涉及使用质谱法定量分析大的蛋白质。
【背景技术】
[0005] IGF-I是具有与胰岛素类似的分子结构的激素。它是由肝产生的肽并在具有三个 分子内二硫键的单链中包含70个氨基酸。IGF-I的分子量为约7, 649Da，并且在血清中是 高度蛋白结合的。通过生长激素刺激产生并可由于营养不足、生长激素不敏感性、缺乏生长 激素受体或下游信号传导途径故障而阻止产生。IGF-I在儿童生长中起重要的作用并在成 人中持续具有合成代谢作用。
[0006] 胰岛素样生长因子II(IGF-II)也是具有与胰岛素类似的分子结构的激素。它是 包含67个氨基酸的单链肽。IGF-II分子量为约7, 50?a，并且在血清中是高度蛋白结合 的。IGF-II在与生长激素相关病症的临床评估中用作胰岛素样生长因子I(IGF-I)的辅助 物（adjunct)。IGF-II通过与IGF-I和不同细胞表面受体相互作用并使结合蛋白循环以调 节组织生长，主要在胎儿生长和发育中起作用。由于生长激素缺乏或营养不良，IGF-II在 儿童和成人中的水平降低。在肢端巨大症或IGF-I的外源给药可观察到增加的IGF-II血 清水平。因此，测量循环的IGF-II水平（即血浆/血清中）是控制数种生长激素相关病症 的重要工具。另外，在各种流行病学研究领域和临床试验中测量循环IGF-II也是有价值的 工具。
[0007] 已经证实用"颠倒（bottmomup)"方法（S卩，酶消化和量化一种或多种所得肽） 量化分析IGF-I和IGF-II尤其是有挑战性的。例如，deKock等报道典型的胰蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶和胃蛋白酶消化方法产生低的消化产量和非特异性酶卵裂。deKock等，Rapid Commun.MassSpectrom. ,2001,15:1191-97。deKock等建议，不令人满意的消化结果可能 是因为由IGF-I的三个二硫键造成的蛋白水解酶的空间限制性。Id。
[0008] 已经努力开发分析IGF-I和IGF-II的方法，包括通过各种质谱技术。例如，已经 报道了使用具有单离子监测（S頂）的LC-离子阱MS分析IGF-I。见，例如Id. ;Bobin等， Analyst，2001, 126:1996-2001 ;和Popot等，Chromatographia, 2001，54:737-741(Popot I)。这些参考文献公开了S頂模式中电荷状态范围为4+至9+的完整IGF-I的LC-ESI-离 子阱MS。最近，已经公开了使用多反应监测（MRM)的LC-MS/MS技术。PopotII报道使用 具有S頂的LC-离子阱MS定量分析电荷状态范围为4+至9+的IGF-I，随后用LC-离子阱 MS/MS使用MRM定性确认分析物。Popot等AnalBioanalChem, 2008, 390:1843-52(Popot II)。MRM实验使用所选择的多电荷IGF-I离子（7+和8+)作为裂解实验中的前体离子。 Bredehdft等报道使用轨道阱质谱仪器定性测定IGF-I前体和产物离子的质荷比，并使 用确定的离子使用LC-三重四极杆MS/MS用于随后的IGF-I定量。Bredehdft等Rapid Commun.MassSpectrom.，2008, 22:477-485〇
[0009] 类似地，已经报道了使用酶消化随后质谱分析消化产物来分析 IGF-II。见，例如Smith等，J.Biol.Chem.，1989, 16:9314-9321 ;和Bayne等 P印tideResearch, 1990,6:271-273。已经报道了用于分析完整IGF-II质谱 检测的其他研究。见，例如，Hampton等J.Biol.Chem.，1989,32:19155-19160 ; Hayne等J.Chromatog. 1991，52:391-402;Wadensten等Biotech,andApp. Biochem. ,1991,13:412-421;Jespersen等J.MassSpectrom. ,1996,31:893-900;和 Nelson等J.Proteome, 2004, 3:851-855。这些参考文献报道用等离子体脱附和MALDI-TOF 质谱技术检测完整的IGF-II。Hampton等检测范围从1+至3+的电荷状态。除了Hampton 等之外都检测到1+电荷状态的IGF-II。
【发明内容】
[0010] 本文描述的方法是用高分辨率/高准确度质谱法质谱测定样品中胰岛素样生长 因子I(IGF-I)蛋白和/或胰岛素样生长因子II(IGF-II)蛋白的量。该方法具有简化的预 分析步骤，其仅仅任选地包括蛋白质裂解、消化和/或检测蛋白质片段。优选地，样品收集 后不进行一种或多种完整蛋白的裂解或消化。
[0011] 在本发明的第一方面，通过质谱法测定样品中IGF-I蛋白或其片段的量，所述质 谱法包括使来自样品的IGF-I蛋白或其片段在适合产生质谱法可检测的一种或多种IGF-I 离子的条件下电离；和通过高分辨率/高准确度质谱法测定一种或多种IGF-I离子的量。 所测定的一种或多种IGF-I离子的量与样品中IGF-I蛋白或其片段的量相关。在一些实施 方式中，IGF-I蛋白或其片段源于样品。在一些实施方式中，IGF-I蛋白或其片段是完整的 长R3IGF-I或其片段。在一些实施方式中，IGF-I蛋白是完整的长R3IGF-I。
[0012] 第二方面，通过质谱法测定样品中IGF-II蛋白或其片段的量，所述质谱法包括将 样品中的IGF-II蛋白或其片段在适合产生质谱法可检测的一种或多种IGF-II离子的条件 下电离；和通过高分辨率/高准确度质谱法测定一种或多种IGF-II离子的量。所测定的一 种或多种IGF-II离子的量与样品中IGF-II蛋白或其片段的量相关。优选地，IGF-II蛋白 源于样品并且是完整的。
[0013] 第三方面，IGF-I蛋白或其片段和IGF-II蛋白或其片段的量通过质谱法同时测 定，所述质谱法包括将来自样品的IGF-I蛋白或其片段和IGF-II蛋白或其片段在适合产生 质谱法可检测的一种或多种IGF-I离子和一种或多种IGF-II离子的条件下电离；和通过高 分辨率/高准确度质谱法测定一种或多种IGF-I离子和一种或多种IGF-II离子的量。所 测定的IGF-I和IGF-II离子的量与样品中IGF-I和IGF-II蛋白或其片段的量相关。优选 地，IGF-I和IGF-II蛋白源于样品并且是完整的。
[0014] 在一些实施方式中，样品可在电离之前通过固相提取（SPE)纯化。在一些实施方 式中，样品可在电离之前通过高效液相色谱法（HPLC)纯化。在相关实施方式中，样品可在 电离之前用SPE和HPLC两者纯化，并且纯化可任选地用联机处理进行。
[0015] 在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法用大于或等于约10, 000的分辨本 领（FWHM)进行，如大于或等于约15, 000,如大于或等于约20, 000,如大于或等于约25, 000。 在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法以小于或等于约50ppm的准确度进行，如小 于或等于约20ppm，如小于或等于约lOppm，如小于或等于约5ppm;如小于或等于约3ppm。 在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法以大于或等于约10, 〇〇〇的分辨本领（FWHM) 和小于或等于约50ppm的准确度进行。在一些实施方式中，分辨本领大于约15, 000并且 准确度小于或等于约20ppm。在一些实施方式中，分辨本领大于或等于约20, 000并且准确 度小于或等于约IOppm;优选地分辨本领大于或等于约25, 000并且准确度小于或等于约 5ppm，如小于或等于约3ppm。
[0016] 在一些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法可用轨道阱质谱仪、飞行时间 (TOF)质谱仪或傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（有时候称为傅里叶变换质谱仪）进行。 在一些实施方式中，样品可包括生物学样品；优选血浆或血清。
[0017] 在一些实施方式中，通过质谱法可检测的一种或多种IGF-I离子是选自m/z在 850. 8±2、957. 1±2、1093. 7±2和1275. 8±2范围内的离子的一种或多种离子。这些范围 内的离子分别对应于电荷为9+、8+、7+和6+的IGF-I离子，并主要落在所述的m/z值± 1的 范围内。优选地一种或多种IGF-I离子包括选自m/z在957. 1 ±2和1093. 7±2范围内的 IGF-I离子的一种或多种离子。1093. 7±2范围内IGF-I离子优选地包括选自具有下列m/ z的IGF-I离子的一种或多种IGF-I离子：约 1091. 94±0. 1、1092. 80±0. 1、1092. 94±0. 1、 109 3. 09 + 0.Ul093. 23 + 0.Ul093. 37 + 0.Ul093. 52 + 0.Ul093. 66 + 0.U 109 3. 80 + 0.U1093. 95 + 0.U1094. 09 + 0.U1094. 23 + 0.Ul094. 38 + 0.U 1094. 52±0. 1、1094. 66±0. 1和1095. 37±0. 1。在一些实施方式中，使通过质谱法检测的 一种或多种IGF-I离子的量与样品中IGF-I蛋白的量相关联包括与内标比较；如人IGF-I 蛋白或非人IGF-I蛋白（例如，完整重组小鼠重组小鼠IGF-I)。内标可任选地被同位素标 记。
[0018] 在一些实施方式中，质谱法可检测的一种或多种IGF-II离子是选自具有下列m/ z范围的IGF-II离子的一种或多种IGF-II离子：约 934. 69±2、1068. 07±2、1245. 92±2 和1494. 89±2。这些范围内的离子分别对应于具有电荷8+、7+、6+和5+的IGF-II离子， 并且主要落在所述的m/z值±1的范围内。优选地一种或多种IGF-II离子包括选自具有 下列m/z的IGF-II离子的IGF-II离子：约 1067. 36±0. 1、1067. 51±0. 1、1067. 65±0. 1、 106 7. 80 + 0.Ul067. 94 + 0.Ul068. 08 + 0.Ul068. 23 + 0.Ul068. 37 + 0.U 1068. 51±0. 1、1068. 65±0. 1、1068. 80±0. 1、1068. 94±0. 1 和 1069. 08±0. 1 ;优选地，一 种或多种IGF-II离子选自具有下列m/z的离子：约1067. 94±0. 1和1068. 08±0. 1。在 一些实施方式中，使通过质谱法检测的一种或多种IGF-II离子的量与样品中IGF-II蛋白 的量相关联包括与内标比较；如人IGF-II蛋白或非人IGF-II蛋白（例如，完整重组小鼠 IGF-II)〇
[0019] 在一些实施方式中，样品中天然完整IGF-I和/或IGF-II的量通过质谱法测定， 所述质谱法包括使完整的源于样品并通过固相提取（SPE)和高效液相色谱法（HPLC)纯化 的IGF-I和/或IGF-II，在适合产生质谱法可检测的一种或多种IGF-I和/或IGF-II离子 的条件下电离。如果天然完整IGF-I的量被测定，一种或多种IGF-I离子包括选自具有下 列范围内m/z的IGF-I离子的一种或多种IGF-I离子：约850. 8±2、957. 1±2、1093. 7±2 和1275. 8±2。如果天然完整IGF-II的量被测定，一种或多种IGF-II离子包括选自具有 下列范围内m/z的IGF-II尚子的一种或多种IGF-II尚子：约934. 69±2、1068. 07±2、 1245. 92±2和1494. 89±2。再一次，对于IGF-I和IGF-II，上述范围内的离子主要落在所 述的m/z值± 1的范围内。一种或多种IGF-I和/或IGF-II离子接着通过高分辨率/高 准确度质谱法测定；其中一种或多种IGF-I和/或IGF-II离子的量用于测定样品中天然完 整IGF-I和/或IGF-II的量。在这些实施方式中，高分辨率/高准确度质谱法用轨道阱或 TOF质谱仪进行，并且SPE和HPLC可以以联机方式进行。
[0020] 上面列出的实施方式的特征可以没有限制地在本发明的方法中结合使用。
[0021] 在某些优选的实施方式中，质谱法以阳离子模式进行。可选地，质谱法以阴离子模 式进行。本文描述的方法中使用的优选的电离技术是电喷雾电离（ESI)。电喷雾电离可以 例如用热的电离源进行。
[0022] 在优选的实施方式中，一种或多种分别可检测的内标提供在样品中，其在样品中 的量也被测定。在这些实施方式中，两种关注的分析物和一种或多种内标的所有或部分 被电离以产生多个质谱仪可检测的离子，并且通过质谱法检测从每种物质产生的一种或 多种离子。内标可选自完整的非人IGF-I(例如，同位素标记的或未标记的完整重组小鼠 IGF-I)、同位素标记的完整人IGF-I蛋白、完整的非人IGF-II蛋白（例如，同位素标记的或 未标记的完整重组小鼠IGF-II)和同位素标记的完整人IGF-II蛋白。
[0023] 在其他实施方式中，样品中完整的IGF-I和/或IGF-II蛋白的量可通过与一种或 多种外部参考标准进行比较而被测定。示例性外部参考标准包括用同位素标记的或未标记 的、完整人或非人IGF-I和/或IGF-II蛋白（例如，同位素标记的或未标记的完整重组小 鼠IGF-I和或IGF-II)掺入的空白血浆或血清。
[0024] 在一些实施方式中，包括来自两种或多种分子同位素形式的分析物的质谱峰的同 位素"签字"可用于确认被研究分析物的同一性。在其他实施方式中，来自一种或多种同位 素形式的质谱峰可用于量化关注的分析物。在一些相关实施方式中，来自一种同位素形式 的单个质谱峰可用于量化感兴趣的分析物。在其他相关实施方式中，多个同位素峰可用于 量化分析物。多个峰可经历任何合适的数学处理。数种数学处理是本领域已知的，包括但 不限于对多重峰下面积的求和，或平均多重峰的响应。
[0025] 如本文所使用，除非另外指出，单数形式"一个（a)"、"一个（an)"和"所述"包括 复数指示物。因此，例如，提及"蛋白质"包括多个蛋白质分子。
[0026] 如本文所使用，术语"IGF-I蛋白"指全长IGF-I多肽或其片段，以及全长IGF-I 变体的多肽或其片段。IGF-I变体包括，例如长R3IGF-I，其是IGF-I的83个氨基酸的类似 物，其包括完全的人IGF-I序列--在3位（因此R3)具有Arg(R)对Glu(E)的取代，和在 N末端的13个氨基酸延伸肽（extensionpeptide)。为了提高IGF-I肽的生物活性，已经 生产了IGF-I的该类似物。该类似物的质量为约9111. 4道尔顿，因此多电荷长R3IGF-I离 子可观察到具有的m/z比为约1014. 1±1、1140. 7±1、1303. 5±1和1520. 6±1。本领域技 术人员容易理解其他IGF-I变体多肽，包括例如已经被化学改性的全长IGF-I多肽或其片 段。示例性化学改性可包括