一种调控胰岛素样生长因子igf1分泌的方法
【专利摘要】本发明公开了调控胰岛素样生长因子（IGF1）分泌的方法，通过体内或体外改变蛋白激酶AMPK的表达和活性，来提高和降低细胞IGF1的分泌量，这种对IGF1精准的双向调控对机体生长及能量存储具有重要意义。
【专利说明】
-种调控膜岛素样生长因子IGF1分泌的方法
技术领域
[0001] 本发明属于细胞信号转导领域，具体设及一种调控机体膜岛素样生长因子IGF1分 泌的方法。
【背景技术】
[0002] IGF1是一种分子结构与膜岛素类似的多肤蛋白物质。IGF1的合成与分泌受生长素 (GH)的调控。GH-IGF1运一激素分泌途径对机体线性生长和发育起决定性作用。垂体前叶分 泌的GH通过血液循环的运输到达各个脏器，例如肝，激活JAK2激酶和信号转导及转录活化 因子STAT通路，进而上调IGF1的表达。肝内的IGF1进入到血液循环后，与祀器官上的IGF1受 体结合，从而调控祀器官的生长，憐酸肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(PKB)-mT0RC通路介导 了运一过程。除内分泌外，IGF1在骨和骨骼肌中还存在旁/自分泌功能。IGF1缺乏可导致机 体生长缓慢，但过度分泌也会引起肢端肥大等问题。因此IGF-1的分泌需要受严格调控，W 维持机体正常生理机能。目前增加或降低血液中IGF-1浓度主要是通过调节細分泌来实现 的，运种方式会导致除IGF-1之外的其他GH的效应在机体中被增强或降低，产生其他的副作 用。而且很多IGF-1相关问题的产生，通过调控上游的的浓度是无法得到解决的。
【发明内容】
[0003] 本发明掲示了蛋白激酶AMPK与机体膜岛素样生长因子IGF1分泌之间的调控关系， 通过激活或抑制机体蛋白激酶AMPK的表达水平或活性，能够实现对机体内膜岛素样生长因 子IGF1内分泌和旁分泌的调节和控制，进而控制动物生长速率，调控细胞衰老，对养殖业中 缩短禽畜出栏时间，W及机体IGF1分泌减少或过量的治疗都具有指导意义。
[0004] 本发明具体技术方案如下： 一种调控机体膜岛素样生长因子IGF1分泌的方法，通过激活或抑制机体蛋白激酶AMPK 的活性来调控机体IGF1的分泌。当蛋白激酶AMPK被激活后，机体IGF1的分泌会降低，当蛋白 激酶AMPK的活性在较高水平被抑制后，机体IGF1的分泌会增加。
[0005] AMPK是一种进化上保守的、异源Ξ聚体的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。AMPK包含一个 曰-亚基一一其具有一个N末端的激酶结构域化D)和一个调控的C末端，一个糖原结合β亚基 和一个AMP/ADP/ATP结合丫亚基。α亚基的调控C末端，包含一个自抑制结构域(AID)，夹在KD 和传感器(aRIM)环之间，一个β亚基相互作用域(β-ID)，和一个丝氨酸/苏氨酸丰富的环(ST 环），它通过PI3K/Akt和糖原合成酶激酶3介导憐酸化作用和信号转导。它的激酶活性是由 能量应力激活的，例如ATP和AMP/AW比值下降，从而允许AMPK通过憐酸化大量的细胞祀标， 上调ATP产生途径和抑制能量消耗程序。图1显示了不同动物的AMPK部分α1亚基氨基酸序列 的比较，可W看出AMPK在各类动物中同源性很高，功能上也很保守（图1中框内为苏氨酸，可 W被LKB1憐酸化)。
[0006] 小鼠 AMPK α1亚基氨基酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0007] 上述方法，可W通过使用蛋白激酶AMPK的激动剂或者抑制剂来激活或抑制机体蛋 白激酶AMPK的活性，优选的蛋白激酶AMPK的激动剂选自AMP、二甲双脈、5-氨基咪挫-4-甲酯 胺核糖核巧酸、苯乙双脈、阿卡地新憐酸盐等中的一种或几种，蛋白激酶AMPK的抑制剂选自 Dorsomor曲in(6-[4-[2-(l-赃晚基）乙氧基]苯基]-3-(4-化晚基川比挫并[l，5-a]喀晚，CAS 登录号：866405-64-3，又名Compound C，Sigma，USA)。
[0008] 或者，上述方法，还可W通过改变机体蛋白激酶AMPK憐酸化状态来激活或抑制机 体蛋白激酶AMPK的活性。
[0009] 由于AMPK活性可W通过其上游激酶的激酶活化环憐酸化而大大增强，包括L邸1和 CaMKKf3DAMP与丫-亚基结合，通过刺激LKB1和AMPK与支架蛋白axin的物理相互作用，W及减 少憐酸酶可W得到的激活环，而增加净激活环憐酸化，后者依赖于β-亚基碳水化合物结合 模块(CBM)的存在。
[0010] 本发明的一个优选的方案可W通过激活蛋白激酶LKB1和/或者CaMKKP，引起蛋白 激酶AMPK的憐酸化，从而激活AMPK。小鼠 LKB1氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示。
[0011] 或者，通过改变蛋白激酶AMPK憐酸化位点的氨基酸序列来改变机体蛋白激酶AMPK 被憐酸化能力。
[0012] 例如，通过点突变的方法将蛋白激酶AMPK保守序列中的憐酸化位点苏氨酸突变为 其它不能被激酶憐酸化的氨基酸，使得蛋白激酶AMPK无法被憐酸化而丧失活性，或者通过 点突变的方法将蛋白激酶AMPK保守序列中的苏氨酸突变成可持续模拟憐酸化状态的天冬 氨酸，使其处于持续憐酸化状态，从而保持活性。
[0013] 本发明的一个优选的方案可W通过基因工程技术敲除机体蛋白激酶ΑΜΡΚαΙ亚基 的基因，使蛋白激酶AMPK失活。
[0014] 具体的说，就是利用同源重组结合CRE重组酶的方法将动物基因组中将编码α1亚 基的基因献除掉，动物体内无法表达ΑΜΡΚα 1亚基，进而使蛋白激酶AMPK失活。
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种控制动物生长速率的方法，其特征在于通过激活 或抑制动物体内蛋白激酶AMPK的活性来调控动物体内IGF1的分泌。
[0016] 本发明的另一目的在于提供蛋白激酶AMPK的激动剂或者抑制剂在调控机体IGF1 的分泌药物中的应用。
[0017]优选AMP、二甲双脈、5-氨基咪挫-4-甲酯胺核糖核巧酸、苯乙双脈、阿卡地新和 Dorsomo巧bin等在调控机体，特别是动物体内IGF1的分泌药物中的应用。
[001引本发明优点： 本发明通过改变AMPK激酶的活性变化来调控IGF1的分泌，除了避免传统上通过GH提高 IGF1分泌造成的其他效应外，也能够降低IGF1分泌过多造成的问题，是真正意义上的对 IGF1分泌的精细的双向调控。
【附图说明】
[0019] 图1为蛋白激酶ΑΜΡΚαΙ亚基保守序列氨基酸比对。
[0020] 图2为分别使用Metformin和AICAR处理巧7BL/6野生型小鼠肝脏原代细胞后，细胞 分泌IGF1的结果。
[0021] 图3为分别使用Metformin和AICAR处理巧7BL/6野生型小鼠肝脏原代细胞后， W e S t e r η b 101检测AMPK的17 2位点苏氨酸憐酸化的结果。
[0022]图4为siRNA介导的基因敲降技术将野生型小鼠肝脏原代细胞LKBl基因敲降后， W e S t e r η b 101检测AMPK的17 2位点苏氨酸憐酸化的结果。
[002引图5为SiRNA介导的基因敲降技术将野生型小鼠肝脏原代细胞L邸堪因敲降后，细 胞分泌IGF1的结果。
[0024] 图6为AMPK α 1亚基肝脏特异性敲除的小鼠肝脏原代细胞分泌IGF1的结果。
【具体实施方式】
[0025] W下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
[0026] 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理 解的含义。
[0027] 下面结合具体实施例并参照实验数据进一步详细描述本发明。应理解，运些实施 例只是为了举例说明本发明，而非W任何方式限制本发明的范围。
[0028] 在W下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0029] 下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
[0030] 实施例1考察AMPK活性升高对IGF1分泌的影响 IGF1在肝脏细胞中合成，且临时储存在肝细胞的囊泡中，然后再分泌到血液，因此本发 明利用胶原酶分离的方法从3只巧7BL/6野生型小鼠肝脏中分离出小鼠的肝原代细胞，将运 些肝原代细胞平均分为Ξ组（阴性对照组，Metformin组和AICAR组），每组Ξ个平行样本，肝 细胞W大于90%的细胞活力培养在12孔板中，每孔的细胞数量为1.25X105个。二甲双脈 (Metformin，St丄ouis，Missouri，USA)和5-氨基咪挫-4-甲酯胺核糖核巧酸（AICAR， Toronto,Ontario ,Canada)是两种最常使用的AMPK蛋白激酶的激动剂，可W促进AMPK活性 增加。细胞分离后的第二天，分别使用2mM Metformin和0.5mM AICAR两种化合物处理小鼠 的肝原代细胞，经PBS洗涂后培养在无血清的培养基中4小时后，用IGF化LISA试剂盒化1^1- IGFl-l，RayBiotech 111(3，1]54)检测上述两组给药组培养液中16。1的含量^及阴性对照组 培养液中IGF1的含量，实验操作严格按照试剂盒说明进行，对每组平行样本的检测结果取 平均值。检测结果显示:没有用激动剂处理的细胞（阴性对照组）IGF1平均分泌量为61.6pg/ h/mg，Metformin处理后的细胞IGF1平均分泌量降为38pg/h/mg，AICAR处理后的细胞IGF1平 均分泌量降为13.9pg/h/mg，与没有用激动剂处理的细胞比较具有差异显著（结果如图2所 示)。
[0031] 随后，将阴性对照组，Metformin组和AICAR组细胞经离屯、收集后，用SDS样品缓冲 液直接裂解后，在SDS-PAGE蛋白胶上进行电泳分离，之后将蛋白通过层析法转移至尼龙膜 上，进行Western Blot检测。利用AMPK 172位点苏氨酸特异性憐酸化抗体(Abeam,UK)解育 后可W检测出AMPK上的172位点苏氨酸憐酸化状态的变化，结果显示Metformin组和AICAR 组相对于阴性对照组的AMPK172位点苏氨酸憐酸化增加。同时还用AMPK的抗体(Abeam, UK) 检测了 AMPK的总蛋白量，结果显示阴性对照组、Metformin组和AICAR组的AMPK总蛋白量并 没有明显差异，说明经过AMPK激动剂处理后可W在不影响AMPK总蛋白量的情况下增加 AMPK 憐酸化水平，使AMPK蛋白被激活(见图3)。
[0032] 本实施例说明AMPK蛋白激酶的活性增加可W降低IGF1的分泌。
[0033] 实施例2考察AMPK活性降低对IGF1分泌的影响 LKBl是AMPK上游的蛋白激酶，通过改变LKBl的表达也能够影响AMPK的活性。本发明使 用siRNA介导的基因敲降技术在野生型小鼠肝脏原代细胞(原代肝细胞的分离方法与实施 例1相同）中将LKB1基因敲降（参照如下文献方法，化gy，L.E.，and Park，P.H. (2014)Globular adiponectin inhibits ethanol-induced reactive oxygen species production through modulation of NADPH oxidase in m曰croph曰ges: involvement of liver kinase B1/AMP-activated protein kinase pathway.Mol Pharmacol86,284- 296)，siL邸 1 组的siRNA序列如下5'-CCACCGAGGUAAUCUACCA-3'（SEQ ID No:3)，siNC对照组 序列：5 ' -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 '（沈Q ID No: 4)。通过Lipof ectamine(Lif eTech，USA) 分别将SiRNA转染原代肝细胞中。使用LKBl抗体(Abeam,UK)进行的Western Blot,检测LKBl 基因敲降后小鼠肝脏原代细胞中LKBl的表达量，结果证实了 SiRNA转染后的确可W降低 LKB1的表达量。而当用AMPK 172位点苏氨酸特异性憐酸化抗体(Abcam，UK)进行Western Blot检测时发现在LKBl敲降的情况下AMPK172位点苏氨酸憐酸化降低，如图4所示。实验说 明当LKB1的表达量降低后，AMPK 172位点苏氨酸憐酸化状态也降低。同时使用IGF1ELISA试 剂盒检测SiNC对照组和siLKBl组细胞培养基中IGF1的含量(每组Ξ个平行样本），结果显示 siNC对照组分泌到培养基中的IGF1量平均值为51.1pg/h/mg，而在siL邸1组当L邸1表达量 下降，AMPK活性降低时，细胞培养基中的IGF1分泌量平均值为68.8pg/h/mg，两者具有差异 显著，（结果如图5所示）。
[0034] 本实施例说明AMPK蛋白激酶的活性降低可W增加 IGF1的分泌。
[0035] 各主要基因 ID号:__
[0036] 实施例3考察ΑΜΡΚαΙ亚基敲除对IGF1分泌的影响 为了进一步验证A Μ Ρ Κ对IG F1分泌的调控，本发明参照文献《L k b 1 r e g U1 a t e S C e 11 cycle and energy metabolism in haematopoietic stem cell》（Nakada et al.化化re.468,653-658)公开的技术获得AMPK al亚基肝脏特异性敲除的小鼠，作为实验 材料，按照实施例1描述的原代肝细胞的分离方法分别分离了3只AMPK α1亚基肝脏特异性 敲除小鼠的肝脏原代细胞和3只野生型小鼠的肝脏原代细胞，并利用IGF1ELISA试剂盒 化LM-IGFl-l，RayBiotech 111(3，1]54)检测各组培养基中16。1的分泌量。检测结果显示日1亚 基肝脏特异性敲除的小鼠肝脏原代细胞分泌的IGF1量平均值为56.8pg/h/mg，而野生型小 鼠肝脏原代细胞分泌的IGF1量平均值为32.3pg/h/mg，al亚基肝脏特异性敲除的小鼠肝脏 原代细胞分泌的IGF1量明显高于野生型小鼠，结果如图6所示。
[0037] 本实施例说明当ΑΜΡΚαΙ亚基敲除后，也能影响IGF1的分泌。
[003引本发明展示了通过降低AMPK表达或活性可W增加肝细胞IGF1的分泌，而增加 AMPK 的表达和活性可W降低IGF1的分泌。运一发明对调控动物机体生长速率，改善机体IGF1分 泌短缺或过量具有重要意义。
【主权项】
1. 一种调控机体胰岛素样生长因子IGF1分泌的方法，其特征在于通过激活或抑制机体 蛋白激酶AMPK的活性来调控机体IGF1的分泌。2. 如权利要求1所述的调控机体胰岛素样生长因子IGF1分泌的方法，其特征在于使用 蛋白激酶AMPK的激动剂或者抑制剂来激活或抑制机体蛋白激酶AMPK的活性。3. 如权利要求2所述的调控机体胰岛素样生长因子IGF1分泌的方法，其特征在于所述 蛋白激酶AMPK的激动剂选自AMP、二甲双胍、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸、苯乙双胍、 阿卡地新磷酸盐中的一种或几种，所述蛋白激酶AMPK的抑制剂选自Dorsomorphin。4. 如权利要求1所述的调控机体胰岛素样生长因子IGF1分泌的方法，其特征在于通过 改变机体蛋白激酶AMPK磷酸化状态来激活或抑制机体蛋白激酶AMPK的活性。5. 如权利要求4所述的调控机体胰岛素样生长因子IGF1分泌的方法，其特征在于通过 激活蛋白激酶LKB1和/或CaMKKi3，引起蛋白激酶AMPK的磷酸化，从而激活AMPK。6. 如权利要求4所述的调控机体胰岛素样生长因子IGF1分泌的方法，其特征在于通过 改变蛋白激酶AMPK磷酸化位点上的氨基酸序列来改变机体蛋白激酶AMPK被磷酸化能力。7. 如权利要求1所述的调控机体胰岛素样生长因子IGF1分泌的方法，其特征在于通过 基因工程技术敲除机体蛋白激酶ΑΜΡΚα 1亚基的基因。8. 如权利要求7所述的调控机体胰岛素样生长因子IGF1分泌的方法，其特征在于通过 同源重组结合CRE重组酶的方法建立ΑΜΡΚα 1亚基的敲除。9. 一种控制动物生长速率的方法，其特征在于通过激活或抑制动物体内蛋白激酶AMPK 的活性来调控动物体内IGF1的分泌。10. 蛋白激酶AMPK的激动剂或者抑制剂在制备调控IGF1的分泌药物中的应用。
【文档编号】A61P3/00GK105999270SQ201610345644
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】王宏宇, 陈亮, 陈帅
【申请人】南京大学