一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，在采集软骨细胞的过程中具有打磨软骨表面的步骤，最大限度地排除了后续滑膜细胞的污染；采取过程开创性的采用了活检针切取内部软骨组织，使得采样直接针对目的细胞，不但直接有效，同时巧妙地避免了潜在的细菌和真菌污染；同时，本发明的原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，使用的特殊制备的复合酶消化液，相比传统单一的胶原酶预热消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。
【专利说明】
_种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分禹培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培 养方法。
【背景技术】
[0002] 软骨细胞位于软骨中，主要作用是合成某些胶原蛋白以及非胶原的高分子细胞外 基质，包括：II型胶原蛋白、蛋白多糖、链接蛋白、IX型胶原蛋白和XI型胶原蛋白。调控软骨 细胞的增殖和分化，对于协调脊椎动物的骨骼发育至关重要。软骨细胞可以产生大量的肽 生长因子和细胞因子，并与之发生反应，例如:胰岛素样生长因子一 1和白介素一 1。在研究 软骨的再生和修复、细胞因子和生长因子对软骨的作用、特定基因对关节炎的调控作用及 关节炎的病理生理过程中，软骨细胞的培养是非常重要的体外模型。
[0003] 目前，国内外已经有大量的研究者进行了小鼠/大鼠软骨细胞的培养和药理学特 性方面的研究，既往的研究多采用0.25%胰酶37度水浴消化1个小时，再用II型胶原酶37度 消化5个小时左右。其缺点在于，绝大多数的酶在37度的条件下都会发生剧烈的消化作用， 因此，一方面可以加快消化的速度，但是另一方面，又会对细胞造成极大的伤害，尤其是胰 酶更是如此。从而导致的结果是，消化时间不好掌握，往往消化时间过长，细胞碎片居多，杂 细胞比较多而软骨细胞比较少，并且获得的细胞活力差，随着培养时间的延长及传代，有活 力的软骨细胞越来越少，细胞逐渐死亡。同时，软骨细胞的采集过程中，其他细胞如滑膜细 胞的污染非常常见，加之上述的酶消化过程，很容易造成软骨细胞数量不占优势，而其他耐 受性较高的杂细胞反而分离得到较多。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种高纯度、高活率、高活性同时低 污染的原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法。
[0005] 为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：
[0006] -种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0007] 步骤1:软骨组织的预处理
[0008] 清理离体的半月板，并利用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗，然后打磨半 月板表面，再次使用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗；
[0009] 步骤2:取软骨细胞
[0010] 使用小型活检针刺入步骤1处理后的半月板，切取半月板内部软骨细胞；
[0011] 步骤3:酶消化
[0012] 将步骤2获得的软骨细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质 量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；
[0013] 步骤4:分离培养软骨细胞
[0014]将步骤3消化完毕的软骨细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离 心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到软骨细胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %双 抗的培养基在37 °C 5 % C02的培养箱中进行培养。
[0015]为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
[0016] 优选地，上述步骤2中使用的小型活检针为小型半自动或全自动活检针。
[0017] 优选地，上述步骤3中复合酶消化液中各个酶的初始浓度均为lmg/ml。
[0018] 优选地，上述步骤3中酶消化过程为使用4°C复合酶消化液消化4-20h;或者使用37 °C预热的复合酶消化液消化10min-2h。
[0019]优选地，上述步骤4的培养基还包括5ug/ml的转铁蛋白和10ug/ml的胰岛素。
[0020] 优选地，上述步骤4的培养基选自DMEM培养基、Williams'medium E培养基或DMEM 或F12培养基;更优选为DMEM培养基。
[0021] 优选地，上述双抗为青链霉素。
[0022] 另一方面，本发明还提供一种根据上述的原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方 法所培养的小鼠或大鼠软骨细胞。
[0023] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0024] 首先，本发明在采集软骨细胞的过程中，具有打磨软骨表面的步骤，最大限度地排 除了后续滑膜细胞的污染;其次，采取过程开创性的采用了活检针切取内部软骨组织，使得 采样直接针对目的细胞，不但直接有效，同时巧妙地避免了潜在的细菌和真菌污染；同时， 本发明的原代小鼠/大鼠软骨细胞的分离培养方法，使用的特殊制备的复合酶消化液，复合 酶消化液由I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶组成，并使用4°C条件过夜消 化(4-20h)，相比传统单一的胶原酶预热消化(特殊情况下可用37°C消化），不但避免了对组 织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。综上所 述，本发明的的原代小鼠/大鼠软骨细胞的分离培养方法，能够获得高纯度、高活率、高活性 同时污染风险极低的原代小鼠/大鼠软骨细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，具有较大 的推广意义。
【附图说明】
[0025]图1为本发明的分离培养方法得到的小鼠软骨细胞显微照片（10X);
[0026]图2为本发明的分离培养方法得到的小鼠软骨细胞显微照片(20X)。
【具体实施方式】
[0027] 本发明提供了一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
[0028] -种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0029]步骤1:软骨组织的预处理
[0030] 清理离体的半月板，并利用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗，然后打磨半 月板表面，再次使用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗；
[0031] 步骤2:取软骨细胞
[0032] 使用小型活检针刺入步骤1处理后的半月板，切取半月板内部软骨细胞；
[0033]步骤3:酶消化
[0034]将步骤2获得的软骨细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质 量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；
[0035]步骤4:分离培养软骨细胞
[0036]将步骤3消化完毕的软骨细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离 心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到软骨细胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %双 抗的培养基在37 °C 5 % C02的培养箱中进行培养。
[0037] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明， 但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0038] 实施例1
[0039] 本实施采用SD大鼠，应用本发明的方法采集和培养软骨细胞，具体步骤如下：
[0040] 1.大鼠关节软骨组织的提取
[0041] 首先处死新生SD大鼠（冰冻10分钟或者颈椎脱白），酒精浸泡5分钟。剪取四肢，将 取下的四肢浸泡在含2 %青链霉素的PBS里，放在冰上保存。
[0042] 2.半月板的剥离
[0043]在解剖显微镜下，用眼科剪仔细剥除四肢的皮肤和肌肉，尽量完全去除，最大限度 地避免杂细胞的混入。将关节切开，暴露关节面，可以看到关节腔里的半月板，将其取出收 集。
[0044] 3.软骨组织的预处理
[0045] 清理离体的半月板，并利用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗，然后打磨半 月板表面，再次使用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗;充分清洗去除打磨后的软骨 表面可能误带的滑膜组织。
[0046] 4.酶消化
[0047] 将处理后变白的软骨组织剪碎，加入复合酶消化液(I型胶原酶+11型胶原酶+IV型 胶原酶+Dispase酶=1:1:1:1)，4种酶的初始浓度均为lmg/ml。在4度冰箱过夜，便于酶与组 织充分结合，使组织松散，细胞容易剥离。这样可以避免消化过程中，对细胞的过度消化和 过度吹打，对细胞造成极大的伤害。第2天，将组织从冰箱中取出，稍微吹打几次，放入37度 水浴30分钟，再次轻微吹打不超过10次。根据情况，可再次放入37度水浴30分钟，最后，轻微 吹打不超过10次，过7〇um筛网。
[0048] 5.离心纯化
[0049] 取过筛后的细胞滤液，进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离 得到软骨细胞，然后用〇. 2 %台盼兰计数活细胞数。
[0050] 6.培养基配制
[0051] 由于软骨细胞的特殊性，在配制完全培养基时，需要加入细胞因子，即基础培养基 为含10 %胎牛血清、1 %青链霉素的DMEM培养基，使用前加入5ug/ml的转铁蛋白和10ug/ml 的胰岛素。另外，为了促进细胞的贴壁，在原代、传代以及复苏的第1天，将培养基中的血清 浓度提高到20%，第2天更换为10%。
[0052] 7.二维培养
[0053]将纯化的大鼠软骨细胞用上述培养基重悬，制得软骨细胞重悬液，加入到T25培养 瓶中进行培养，接种密度为0.5*106/瓶。置于37度，5%C02的培养箱中进行培养。每3天更换 新的培养基，每天于显微镜下观察细胞生长情况，至细胞融合度达70%~80%，进行传代培 养。
[0054] 8.传代培养
[0055] 当细胞融合度达70 %~80 %时，每瓶细胞加0.25 %胰酶-EDTA 1ml，在37度培养箱 中孵育消化2分钟。显微镜下观察，当细胞间隙增大时，用含血清的培养基终止消化，并将细 胞吹打下来。400g离心5分钟，获得的细胞再加入含细胞因子且血清浓度为20%的完全培养 基，接种于T25培养瓶中，接种密度为0.5* 106/瓶。置于37度，5 % C02的培养箱中继续扩增培 养。第2天更换培养基为含细胞因子且血清浓度为10%的完全培养基。每3天更换新的培养 基，每天于显微镜下观察细胞生长情况。
[0056] 9.细胞形态观察
[0057]分离得到的软骨细胞经过培养贴壁后，使用显微镜观察细胞形态，如图1和图2所 示，可见细胞饱满充盈、形态健康活力高。
[0058] 10.其他相关指标测定
[0059] 培养期间测定细菌及真菌污染情况、细胞污染(滑膜细胞等)情况、统计细胞活率 等。
[0060] 对比实施例
[0061] 对比实施例采用传统的组织块消化法，分离获得半月板后，剥离去除其他连带组 织，使用含有双抗的PBS冲洗，在无菌操作下剪碎，并使用0.25 %胰酶37 °C消化lh，然后再用 II型胶原酶37°C消化5h，使用缓冲液吹打组织，分散细胞，过筛网，进行离心洗涤，然后进行 重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到小鼠软骨细胞，细胞计数后，加 入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为0.5*10 6/瓶，置于37度，5 %C02的培养箱中进行培养 并观察和测定相关指标。
[0062] 上述的实施例和对比例实验，
【申请人】进行了多次实验，并进行了相关指标的比较 和数据统计。如表1所示：
[0063] 表 1
[0064]
[0065] 同时
【申请人】使用小鼠进行了若干次实验，实验结果同小鼠相同，证明本发明的方 法对大鼠和小鼠的软骨细胞分离培养的良好效果真实有效。
[0066] 综上所述，本发明的原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，采用特制的复合 酶进行长期消化，使得获得细胞总量大，分离度高，活率高；由于采集使用了打磨的方法并 利用了活检针，本发明的方法获得的软骨细胞细菌、真菌和其他细胞的污染概率极低，同时 还能够进行传代培养，为以软骨细胞培养为基础的相关研究提供了良好的细胞培养解决方 案。
[0067] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1:软骨组织的预处理 清理离体的半月板，并利用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗，然后打磨半月板 表面，再次使用含双抗和两性霉素 B的D-hanks溶液冲洗； 步骤2:取软骨细胞 使用小型活检针刺入步骤1处理后的半月板，切取半月板内部软骨细胞； 步骤3:酶消化 将步骤2获得的软骨细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比 为1: 1: 1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶； 步骤4:分离培养软骨细胞 将步骤3消化完毕的软骨细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心， 最后用无血清培养液再次重悬，分离得到软骨细胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %双抗的 培养基在37 °C 5 % CO2的培养箱中进行培养。2. 根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于， 所述步骤2中使用的小型活检针为小型半自动或全自动活检针。3. 根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于， 所述步骤3中复合酶消化液中各个酶的初始浓度均为lmg/ml。4. 根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于， 所述步骤3中酶消化过程为使用4 °C复合酶消化液消化4-20h。5. 根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于， 所述步骤3中酶消化过程为使用37°C预热的复合酶消化液消化10min-2h。6. 根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于， 所述步骤4的培养基还包括5ug/ml的转铁蛋白和10ug/ml的胰岛素。7. 根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于， 所述步骤4的培养基选自DMEM培养基、Wi 11 iams 'medium E培养基或DMEM/F12培养基。8. 根据权利要求7所述的一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于， 所述步骤4的培养基为DMEM培养基。9. 根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法，其特征在于， 所述双抗为青链霉素。10. -种根据权利要求1-9任意一项所述的原代小鼠或大鼠软骨细胞的分离培养方法 所培养的小鼠或大鼠软骨细胞。
【文档编号】C12N5/077GK105907707SQ201610218208
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】王晓冰, 杨国峰
【申请人】王晓冰, 杨国峰