专利名称：改进的小鼠拟胚体制作方法
改进的小鼠拟胚体制作方法本发明涉及动物拟胚体制作方法，尤其涉及一种改进的小鼠拟胚体制作方法。 [背景技术]伴随着年龄的增长，特别是在现代的社会中随着社会的进步及脑力劳动的比例增加，人们的体质迅速下降，人类老年退化性疾病呈现多发和高发，如分泌胰岛素的胰腺细胞退化引起的糖尿病、分泌神经递质多巴胺的神经细胞退化引起的帕金森病等。另外，一些家族遗传性疾病，由于遗传信息的突变而引发的家族遗传性疾病，如地中海式贫血、血友病、白化病等。对于这些疾病能够彻底治愈的最有效方法就是利用胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ES细胞)诱导分化技术，小鼠作为一种重要的实验动物模型，小鼠ES细胞的诱导分化研究将会为人类再生医学的成功实施奠定坚实的基础。ES细胞是一种来源于囊胚内细胞团的多能性干细胞群体，具有较强的再生能力和可塑性，在体外培养环境条件下，能够高效地进行外源基因导入、基因敲除或基因改造等遗传修饰操作。在一定的诱导环境条件下ES细胞能够分化形成机体所有类型的组成细胞，包括雌性的卵母细胞和雄性的精子。ES 细胞向卵母细胞和精子的分化将会为转基因动物的生产、新品种培育、野生动物保护及人的生殖健康等奠定重要的基础，具有极强的应用价值和现实意义。经过遗传操作的ES细胞在体外诱导分化成特定细胞，能够有效治疗遗传性疾病，通过对小鼠ES细胞体外诱导分化成特定细胞的研究，为人类再生医学的快速发展和人类疾病的生物疗法奠定坚实的基础。 拟胚体的成功制作是ES细胞向特定细胞高效分化的平台和基础。在细胞消化传代培养中，含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的细胞消化液是常规的商品化试剂，常规拟胚体的制作中使用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的细胞消化液把ES细胞连同饲养层细胞一起消化成单个细胞，把这些混合的细胞群体采用倒挂细胞液悬滴，细胞液悬滴中的混杂细胞共同形成细胞团，这样形成的拟胚体细胞团中包含较多的饲养层细胞，由于饲养层细胞混杂在拟胚体中，极大地降低了拟胚体的质量，会导致下游的分化效率降低和分化质量下降，从而严重影响多能性干细胞向生殖细胞精子或卵子及其他类型细胞的分化效率，削弱ES细胞的临床和生产的应用价值和意义。本发明要解决的技术问题是提供一种改进的小鼠拟胚体制作方法，其制作简单、 效果明显，制作的拟胚体质量可靠。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，改进的小鼠拟胚体制作方法， 包括如下步骤(1)小鼠ES细胞的培养取12. 5d小鼠胎儿成纤维细胞用高糖DMEM培养液进行培养，待细胞铺满培养皿后，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的细胞消化液消化传代培养，取铺满培养皿的胎儿成纤维细胞用10 μ g/ml的丝裂霉素作用2. 5h，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的细胞消化液消化后接种至0. 1 %明胶处理的培养皿上于培养箱中进行培养，取接种后第2d均勻铺满培养皿的细胞用作饲养层；小鼠ES细胞Rl细胞系为商品化细胞系，取第26代小鼠ES 细胞Rl细胞系接种到小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000U/ml LIF的高糖DMEM培养液进行培养；(2)拟胚体的制作取小鼠ES细胞用PBS洗涤，加入含2. 5mg/ml胰酶的细胞消化液放置于培养箱消化3min，用手轻轻震动拍打培养皿，收集脱落的牛iPS细胞集落，离心，PBS洗涤，再离心后用去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培养液重悬，接种细胞至低贴附的细菌培养皿培养箱中
培养；(3)拟胚体的悬浮培养接种培养的第2d，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到新的低贴附的细菌培养皿中，补加去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养；(4)拟胚体的贴壁培养拟胚体在低贴附的细菌培养皿中培养一周后，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到明胶包被的普通细胞培养皿中，补加去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养，一周后即可用于体外三胚层分化能力检测。本发明的有益效果是采用含2. 5mg/ml胰酶的细胞消化液将小鼠ES细胞消化为细胞集落，使得这些细胞集落中细胞完整地聚集在一起，并从饲养层细胞上脱离下来，而饲养层细胞则被消化成单个细胞。因此，采用含2. 5mg/ml胰酶的细胞消化液消化的ES细胞能够直接制作高纯度、 高质量小鼠ES细胞拟胚体。从而为小鼠ES细胞高效诱导分化成机体所需要的其他类型的细胞奠定了基础。下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细的说明。
图1是自然状态下生长在饲养层上小鼠ES细胞的生长形态；图2是悬浮培养小鼠ES细胞形成拟胚体的生长形态；一、材料和方法(1)小鼠ES细胞的培养取12. 5d小鼠胎儿成纤维细胞用高糖DMEM培养液进行培养，待细胞铺满培养皿后，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的细胞消化液消化传代培养，取铺满培养皿的胎儿成纤维细胞用10 μ g/ml的丝裂霉素作用2. 5h，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的细胞消化液消化后接种至0. 1 %明胶处理的培养皿上于培养箱中进行培养，取接种后第2d均勻铺满培养皿的细胞用作饲养层。小鼠ES细胞Rl细胞系为商品化细胞系，取第26代小鼠 ES细胞Rl细胞系接种到小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000U/ml LIF的高糖DMEM培养液进行培养。(2)免疫荧光和碱性磷酸酶染色检测小鼠ES细胞经多聚甲醛室温固定，Triton X-100的PBS溶液通透，BSA的PBS溶液封闭后，一抗为0ct4、NanOg、SSEA-I按1 200稀释后分别添加至细胞上共孵育，PBS洗涤，添加红色荧光标记的二抗按1 200稀释后室温避光共孵育，PBS洗涤，1 μ g/ml的DAPI 细胞核染色，荧光镜下观察。小鼠ES细胞经多聚甲醛固定，添加碱性磷酸酶染液进行染色， 以胞浆着色为红棕色或咖啡色颗粒为阳性。(3)拟胚体的制作取小鼠ES细胞用PBS洗涤，加入含2. 5mg/ml胰酶的细胞消化液放置于培养箱消化3min，用手轻轻震动拍打培养皿，收集脱落的牛iPS细胞集落，离心，PBS洗涤，再离心后用去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培养液重悬，接种细胞于低贴附的细菌培养皿中培养箱
中培养。(4)拟胚体的悬浮培养接种培养的第2d，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到新的低贴附的细菌培养皿中，补加去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养。(5)拟胚体的贴壁培养拟胚体在低贴附的细菌培养皿中培养一周后，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到明胶包被的普通细胞培养皿中，补加去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养，一周后用于体外三胚层分化能力检测。(6)拟胚体的体外分化检测小鼠ES细胞体外分化拟胚体经多聚甲醛室温固定，Triton X-100的PBS溶液 MiS., BSA 白勺 PBS一㈱力 α -actinin (Sarcomeric)、 α —Fetoprotein (AFP)、 Neurofilament 200，一抗按1 200稀释后分别添加至细胞上共孵育，PBS洗涤，红色荧光标记的二抗按1 200稀释后室温避光共孵育，PBS洗涤，1 μ g/mL的DAPI细胞核染色，荧光镜下观察。二、结果(1)小鼠ES细胞的生长状态小鼠ES细胞在12. 5d胎儿成纤维细胞饲养层上，形态较为一致，细胞集落为鸟巢状(图1)，集落向上突起明显，生长速度快，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的细胞消化液消化后在按1 3消化传代的情况下，ES细胞从细胞集落中分离出来，细胞呈单个、体积较小，在饲养层上生长的ES细胞集落2d传代一次。经碱性磷酸酶染液作用后，小鼠ES细胞集落碱性磷酸酶染色呈强阳性，细胞集落呈棕红色或紫红色。小鼠ES细胞高水平表达干细胞标记蛋白0ct4、NanOg及SSEA-I。结果显示小鼠ES细胞保持良好的未分化生长状态。(2)小鼠ES细胞拟胚体的形成小鼠ES细胞经含2. 5mg/ml胰酶的细胞消化液消化后，ES细胞集落保持完整、均为细胞克隆，在低粘附力的培养皿中，细胞克隆直接形成拟胚体，形成的拟胚体形态为圆球形，表面光滑晶亮(图2)。ES细胞集落在低粘附力的细菌培养皿上接种后第ld，从培养皿上消化的饲养层细胞在低粘附力的细菌培养皿上能够贴壁生长，在小鼠ES细胞拟胚体更换新的培养皿时贴壁的饲养层细胞被去除，制作形成的ES细胞拟胚体具有较高的细胞纯度。伴随着ES细胞拟胚体培养时间的延长，拟胚体组成细胞间连接逐步变得较为致密，拟胚体间较易出现相互粘附形成更大的拟胚体集落，拟胚体的颜色逐步由浅变深。(3)小鼠ES细胞拟胚体的三胚层分化小鼠ES细胞拟胚体经过悬浮培养后在明胶包被的普通细胞培养皿中贴壁生长，贴壁的拟胚体呈现自发分化，经过免疫细胞化学检测显示，具有多能性的小鼠ES细胞制作的拟胚体能够高效向机体三个胚层的组成细胞分化，分化形成表达α -actinin (Sarcomeric) 的中胚层心肌细胞、表达α-Fetoprotein(AFP)的内胚层肝细胞、表达Neurof ilament外胚层神经细胞。本实施例通过这种简单的小鼠ES细胞拟胚体制作方法，ES细胞拟胚体在体外能够分化成机体的三个胚层组成细胞，从而为利用小鼠ES细胞拟胚体制作技术诱导形成机体所有类型组成细胞乃至生殖细胞精子和卵子奠定坚实的基础。
权利要求
1.改进的小鼠拟胚体制作方法，包括如下步骤(1)小鼠ES细胞的培养取12. 5d小鼠胎儿成纤维细胞用高糖DMEM培养液进行培养，待细胞铺满培养皿后，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的细胞消化液消化传代培养，取铺满培养皿的胎儿成纤维细胞用10 μ g/ml的丝裂霉素作用2. 5h，用含2. 5mg/ml胰酶-0. 2mg/ml EDTA的细胞消化液消化后接种至0. 1 %明胶处理的培养皿上于培养箱中进行培养，取接种后第2d均勻铺满培养皿的细胞用作饲养层；小鼠ES细胞Rl细胞系为商品化细胞系，取第26代小鼠ES细胞 Rl细胞系接种到小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000U/ml LIF的高糖DMEM培养液进行培养；(2)拟胚体的制作取小鼠ES细胞用PBS洗涤，加入含2. 5mg/ml胰酶的细胞消化液放置于培养箱消化 3min，用手轻轻震动拍打培养皿，收集脱落的牛iPS细胞集落，离心，PBS洗涤，再离心后用去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培养液重悬，接种细胞至低贴附的细菌培养皿中培养箱中培养；(3)拟胚体的悬浮培养接种培养的第2d，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到新的低贴附的细菌培养皿中，补加去除1000U/ml LIF的高糖DMEM培养液于培养箱中培养；(4)拟胚体的贴壁培养拟胚体在低贴附的细菌培养皿中培养一周后，从低贴附的细菌培养皿中连同拟胚体一起将细胞培养液转移至离心管中，室温静止，待细胞集落形成的拟胚体自然沉淀到离心管底后，转移拟胚体接种到明胶包被的普通细胞培养皿中，补加去除1000U/ml LIF的高糖 DMEM培养液于培养箱中培养，一周后即可用于体外三胚层分化能力检测。
全文摘要
本发明公开了改进的小鼠拟胚体制作方法，其步骤包括小鼠ES细胞的培养、拟胚体的制作、拟胚体的悬浮培养和拟胚体的贴壁培养。本发明采用含胰酶的细胞消化液将小鼠ES细胞消化为细胞集落，使得这些细胞集落中细胞完整地聚集在一起，并从饲养层细胞上脱离下来，而饲养层细胞则被消化成单个细胞，从而能够直接制作高纯度、高质量小鼠ES细胞拟胚体。
文档编号C12N5/073GK102329770SQ20111028647
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者丁建平, 任春环, 刘亚, 刘洪瑜, 张子军, 张运海, 方富贵, 曹鸿国, 李运生, 杨盼, 章孝荣, 蒲勇, 陶勇 申请人:安徽农业大学