肝细胞保存液及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞的保存液，具体涉及一种肝细胞保存液及其制备方法和应用，属 于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，细胞生物治疗技术逐渐代替传统药物治疗，在各大疾病领域上发挥重要 的作用。细胞治疗是指利用具有某些特定功能的细胞，采用生物工程方法通过体外扩增、特 殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和 机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。细胞治疗逐渐成为目前抗肿瘤，抗乙肝、 丙肝的最新、最好的免疫治疗方法。
[0003] 其中，L-02肝细胞是肝病细胞治疗中的种子细胞。经国内外学者对L-02细胞的生 物学特性及功能的深入研究，发现该细胞能够分解代谢许多物质，其功能与正常肝细胞功 能特别相似，并且该细胞能够不断增殖，且不具有致癌性。这一发现为肝病患者的治疗和治 愈带来了光明的前景。
[0004] 但是L-02细胞存活率及生物活性直接影响了其治疗效果。因此，如何维持L-02细 胞的高存活率及活性成为了肝病细胞治疗的关键。在此之前，人们用生理盐水或者葡萄糖 溶液作为细胞的保存液，但是由于缺乏营养、溶液等张力或等渗透力的差异等原因，导致细 胞在保存及运输过程中出现活力低下、大量溶胀死亡等现象，细胞的大量死亡及活性的降 低会直接影响肝病的治疗效果。
[0005] 此外上述保存液的成分复杂，配置过程繁琐，且并不是针对L-02细胞的保存液，同 时其保存效果也并未达到令人满意的效果。为了进一步的适应临床应用的需要，开发一种 能在长时间保存和运输中，机能维持L-02细胞的存活率及活力，又能在进入到肝病手术患 者体内后缓解手术后可能出现的并发症的新保存液成为了当务之急。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术中L-02细胞培养存在活力低下、易大量溶胀死亡 的缺陷，提供一种成分稳定、营养物质多元、溶液渗透体系缓冲力强的肝细胞保存液及其制 备方法和应用。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供的肝细胞保存液含有1~2g/L的葡萄糖、10~20g/ L的谷氨酸钠、200~300mg/L的维生素 C、5~10g/L的酸红、10~20mg/L的葡醛内酯、50~ 100mg/L的多烯磷脂酰胆碱、羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、细胞缓冲液、氨基酸混合 液；
[0008] 其中，每升肝细胞保存液中含有10~20ml的羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，含 有800~900ml的细胞缓冲液与氨基酸混合液的混合溶液，所述细胞缓冲液与氨基酸混合液 的体积比为1:1~2;
[0009] 所述细胞缓冲液中各组分及含量为：7~10mM的KC1、2~2.6mM的CaCl2、276~ 29〇1^的恥(：1、!12(：〇3/恥!10)3、恥!12?〇4/恥2册〇4、无菌水，所述细胞缓冲液的口11为7.35~7.45， 渗透压为300~320m0sm/L;
[0010]所述氨基酸混合液中各组分及含量为：3.5~6.5g/L的赖氨酸、0.5~1.5g/L的色 氨酸、4.3~7.4g/L的苯丙氨酸、1.8~4.6g/L的蛋氨酸、1.0~3.8g/L的苏氨酸、2.5~5.8g/ L的异亮氨酸、3.6~6.3g/L的亮氨酸、2.6~5.4g/L的缬氨酸、0.2~1.3g/L的亚硫酸氢钠、9 ~l〇g/L的山梨醇。
[0011]优选地，所述肝细胞保存液含有1300~1600mg/L的葡萄糖、14~16g/L的谷氨酸 钠、230~270mg/L的维生素 C、6~8g/L的酸红、15~18mg/L的葡醛内酯、60~80mg/L的多稀 磷脂酰胆碱。
[0012]优选地，所述每升细胞保存液中含有12~18ml的羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射 液，含有820~880ml的细胞缓冲液与氨基酸混合液的混合溶液，，所述细胞缓冲液与氨基酸 混合液的体积比为1:1.3~1.7。
[0013] 优选地，所述细胞缓冲液中各组分及含量为：7.6~9.2mM的KC1、2.3~2.5mM的 CaCl2、280 ~285mM 的 NaCl、H2 ⑶ 3/NaHC〇3、NaH2P〇4/Na2HP〇4、无菌水，所述细胞缓冲液的 pH 为 7 · 35~7 · 45，渗透压为 300~320m0sm/L。
[0014] 优选地，所述氨基酸混合液中各组分含量为:4~5.7g/L的赖氨酸、0.7~1.2g/L的 色氨酸、5.3~6.5g/L的苯丙氨酸、2.5~3.2g/L的蛋氨酸、1.5~2.7g/L的苏氨酸、3.5~ 4.3g/L的异亮氨酸、4.6~5.7g/L的亮氨酸、3.1~5.0g/L的缴氨酸、0.4~1 .Og/L的亚硫酸 氢钠、9~10g/L的山梨醇。
[0015] 本发明还提供了一种制备上述的肝细胞保存液的方法，包括如下步骤：（1)配制细 胞缓冲液:取KCl、CaCl2、NaCl和灭菌水混合，利用缓冲对H 2C03/NaHC03、NaH2P〇4/Na2HP〇4将pH 调至7.35~7.45,搅拌混匀，灭菌即为细胞缓冲液；（2)配制氨基酸混合液:取赖氨酸、色氨 酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、亚硫酸氢钠溶于含山梨醇的无菌 水溶液，搅拌混匀即为氨基酸混合液；（3)配制肝细胞保存液:将细胞缓冲液和氨基酸混合 液混合，搅拌混匀得混合溶液，将羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、葡萄糖、谷氨酸钠、维 生素 C、酚红、葡醛内酯、多烯磷脂酰胆碱，加入混合溶液，搅拌混匀测定其渗透压为300~ 320m0sm/L后，过滤除菌即得肝细胞保存液。
[0016] 本发明还提供了一种利用上述的肝细胞保存液保存肝细胞的方法，该方法为在无 菌条件下将肝细胞与所述肝细胞保存液混合，每l〇〇ml肝细胞保存液中保存的肝细胞少于 或等于1 X 101()，储存在细胞培养反应器中，置于0~4°C环境中保存。
[0017] 本发明的有益效果:利用本发明肝细胞保存液配方及其制备方法所生产出的肝细 胞及其保存液可运用于临床辅助治疗肝细胞功能不足的特定患者，改善患者血液环境，使 得患者自身肝组织的功能得以恢复。该肝细胞保存液通过将羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注 射液、葡萄糖、谷氨酸钠、维生素 C、酚红、葡醛内酯、多烯磷脂酰胆碱、氨基酸混合液及细胞 缓冲液混合，从而形成了成分稳定、营养物质多元、溶液渗透体系缓冲力强的肝细胞保存 液。利用本发明保存肝细胞时，保存液不仅可以为肝细胞提供营养，可肉眼大致观察pH值， 还能很好的维持细胞活性。此外，该肝细胞保存液较人体血液的渗透压高一些，使得肝细胞 在运输及储存过程中处于低收缩状态，在用于肝病患者手术后的治疗中，可以缓解可能出 现的并发症，观察治疗过程中的肾脏排泄功能，同时，待患者病程好转过程中也不会引起机 体离子体系的失衡，降低了保存液对机体的副作用，使其在后续的临床使用中发挥更好的 效果。此外，本发明的肝细胞保存液成本低廉，成分稳定，安全，无毒副作用，本制备过程简 便，能在段时间内大量配置，可规模化生产。
【具体实施方式】
[0018] 以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0019] 以下实施例中公开的肝细胞保存液的制备方法如下：
[0020] (1)配制细胞缓冲液:取KCl、CaCl2、NaCl和灭菌水混合，利用缓冲对H 2C03/NaHC03、 NaH2P〇4/Na2HP〇4将pH调至7.35~7.45，搅拌混匀，灭菌即为细胞缓冲液；
[0021] (2)配制氨基酸混合液:取赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、缬氨酸、亚硫酸氢钠溶于含山梨醇的无菌水溶液，搅拌混匀即为氨基酸混合液；
[0022] (3)配制肝细胞保存液:将细胞缓冲液和氨基酸混合液混合，搅拌混匀得混合溶 液，将羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、葡萄糖、谷氨酸钠、维生素 C、酚红、葡醛内酯、多烯 磷脂酰胆碱，加入混合溶液，搅拌混匀测定其渗透压为300~320m0sm/L后，过滤除菌即得肝 细胞保存液。
[0023] 利用本发明的肝细胞保存液保存肝细胞的方法为:在无菌条件下将肝细胞与所述 肝细胞保存液混合，每l〇〇ml肝细胞保存液中保存的肝细胞少于或等于1 X 101()，储存在细胞 培养反应器中，置于0~4°C环境中保存。
[0024] 实施例1
[0025]肝细胞保存液1，含有体积比为10ml/L羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、28/1葡 萄糖、10g/L谷氨酸钠、200mg/L维生素 C、5g/L酸红、10mg/L葡醛内酯、50mg/L多稀磷脂酰胆 碱、细胞缓冲液和氨基酸混合液；
[0026] 细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比为1:1，两者的混合溶液在肝细胞保存液中 含量为800ml/L;
[0027] 细胞缓冲液中各组分含量为：l〇mM的KCl、2mM的CaCl2、290mM的NaCl、H 2C03/ NaHC03、NaH2P〇4/Na2HP〇4、无菌水，细胞缓冲液的 pH为 7 · 35;
[0028]氨基酸混合液中各组分含量为:3.5g/L赖氨酸、1.5g/L色氨酸、4.3g/L苯丙氨酸、 4.6g/L蛋氨酸、1. Og/L苏氨酸、5.8g/L异亮氨酸、3.6g/L亮氨酸、5.4g/L缴氨酸、0.2g/L亚硫 酸氢钠、9g/L的山梨醇。
[0029] 实施例2
[0030]肝细胞保存液2,含有体积比为12ml/L羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、lg/Ι葡 萄糖、12g/L谷氨酸钠、220mg/L维生素 C、6g/L酸红、12mg/L葡醛内酯、60mg/L多稀磷脂酰胆 碱、细胞缓冲液、氨基酸混合液；
[0031] 细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比为1:2,两者的混合溶液在肝细胞保存液中 含量为850ml/L;
[0032] 细胞缓冲液中各组分含量为：7mM的KC1、2.6mM的CaCl2、276mM的NaCl、H 2C03/ NaHC03、NaH2P〇4/Na2HP〇4、无菌水，细胞缓冲液的pH为7.4，渗透压含量为304m0sm/L;
[0033] 氨基酸混合液中各组分含量为:6.5g/L赖氨酸、0.5g/L色氨酸、7.4g/L苯丙氨酸、 1.8g/L蛋氨酸、3.8g/L苏氨酸、2.5g/L异亮氨酸、6.3g/L亮氨酸、2.6g/L缬氨酸、1.3g/L亚硫 酸氢钠、9g/L的山梨醇。
[0034] 实施例3
[0035]肝细胞保存液3，含有体积比为14ml/L羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、1.6g/L 葡萄糖、14g/L谷氨酸钠、240mg/L维生素 C、7g/L酸红、14mg/L葡醛内酯、70mg/L多稀磷脂酰 胆碱、细胞缓冲液、氨基酸混合液；
[0036] 细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比为1:1.3，两者的混合溶液在肝细胞保存液 中含量为840ml/L;
[0037] 细胞缓冲液中各组分含量为：9.2mM的KC1、2.3mM的CaCl2、285mM的NaCl、H 2C03/ NaHC03、NaH2P〇4/Na2HP〇4、无菌水，细胞缓冲液的pH为7 · 45，渗透压为308m0sm/L;
[0038] 氨基酸混合液中各组分含量为：4g/L赖氨酸、1.2g/L色氨酸、5.3g/L苯丙氨酸、 3.2g/L蛋氨酸、2.7g/L苏氨酸、3.5g/L异亮氨酸、5.7g/L亮氨酸、5. Og/L缬氨酸、0.4g/L亚硫 酸氢钠、l〇g/L的山梨醇。
[0039] 实施例4
[0040] 肝细胞保存液4,含有体积比为16ml/L羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、1.3g/L 葡萄糖、16g/L谷氨酸钠、260mg/L维生素 C、8g/L酸红、16mg/L葡醛内酯、80mg/L多稀磷脂酰 胆碱、细胞缓冲液、氨基酸混合液；
[0041 ]细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比为1:1.7，两者的混合溶液在肝细胞保存液 中含量