为820ml/L;
[0042] 细胞缓冲液中各组分含量为：7.6mM的KC1、2.5mM的CaCl2、280mM的NaCl、H 2C03/ NaHC03、NaH2P〇4/Na2HP〇4、无菌水，细胞缓冲液的pH为7 · 38，渗透压为312m0sm/L;
[0043] 氨基酸混合液中各组分含量为:5.7g/L赖氨酸、0.7g/L色氨酸、6.5g/L苯丙氨酸、 2.5g/L蛋氨酸、1.5g/L苏氨酸、4.3g/L异亮氨酸、4.6g/L亮氨酸、3. lg/L缬氨酸、1. Og/L亚硫 酸氢钠、1 〇g/L的山梨醇。
[0044] 实施例5
[0045] 肝细胞保存液5，含有体积比为18ml/L羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、1750mg/ L葡萄糖、18g/L谷氨酸钠、280mg/L维生素 C、9g/L酚红、18mg/L葡醛内酯多烯磷脂酰胆碱、细 胞缓冲液、氨基酸混合液；
[0046] 细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比为1:1.3，两者的混合溶液在肝细胞保存液 中含量为880ml/L;
[0047] 细胞缓冲液包括：7 · 3mM的KC1、2 · 53mM的CaCl2、285mM的NaCl、H2C03/NaH⑶3、 NaH2P〇4/Na2HP〇4、无菌水，细胞缓冲液的pH为7 · 42，渗透压为316m0sm/L;
[0048] 氨基酸混合液中各组分含量为:6.3g/L赖氨酸、1.2g/L色氨酸、6.9g/L苯丙氨酸、 2. Og/L蛋氨酸、2.7g/L苏氨酸、5.5g/L异亮氨酸、4. Og/L亮氨酸、5. Og/L缬氨酸、0.4g/L亚硫 酸氢钠、9g/L的山梨醇。
[0049] 实施例6
[0050] 肝细胞保存液6，含有体积比为20ml/L羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、1230mg/ L葡萄糖、20g/L谷氨酸钠、300mg/L维生素 C、10g/L酸红、20mg/L葡醛内酯、100mg/L多稀磷脂 酰胆碱、细胞缓冲液、氨基酸混合液；
[0051 ]细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比为1:1.85，两者的混合溶液在肝细胞保存液 中含量为900ml/L;
[0052] 细胞缓冲液包括：9 · 8mM的KC1、2 · ImM的CaCl2、276mM的NaCl、H2C〇3/NaHC〇3、 NaH2P〇4/Na2HP〇4、无菌水，细胞缓冲液的pH为7 · 35，渗透压为320m0sm/L;
[0053] 氨基酸混合液中各组分含量为:3.7g/L赖氨酸、0.63g/L色氨酸、4.9g/L苯丙氨酸、 3.5g/L蛋氨酸、1.3g/L苏氨酸、3. Og/L异亮氨酸、5.2g/L亮氨酸、2.9g/L缬氨酸、1.2g/L亚硫 酸氢钠、l〇g/L的山梨醇。
[0054] 对照例
[0055] 对照例1
[0056]对照保存液1，含有体积比为16ml/L羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、1.3g//L葡 萄糖、16g/L谷氨酸钠、260mg/L维生素 C、8g/L酚红、细胞缓冲液、氨基酸混合液；
[0057] 细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比为1:1.7，两者的混合溶液在肝细胞保存液 中含量为820ml/L;
[0058] 细胞缓冲液中各组分含量为：7.6mM的KC1、2.5mM的CaCl2、280mM的NaCl、H 2C03/ NaHC03、NaH2P〇4/Na2HP〇4、无菌水，细胞缓冲液的pH为7 · 38，渗透压为312m0sm/L;
[0059] 氨基酸混合液中各组分含量为:5.7g/L赖氨酸、0.7g/L色氨酸、6.5g/L苯丙氨酸、 2.5g/L蛋氨酸、1.5g/L苏氨酸、4.3g/L异亮氨酸、4.6g/L亮氨酸、3. lg/L缬氨酸、1. Og/L亚硫 酸氢钠、1 〇g/L的山梨醇。
[0060] 对照例2
[00611对照保存液2，含有体积比为16ml/L羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、1.3g//L葡 萄糖、16g/L谷氨酸钠、260mg/L维生素 C、8g/L酸红、16mg/L葡醛内酯、80mg/L多稀磷脂酰胆 碱、细胞缓冲液、氨基酸混合液；
[0062] 细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比为1:1.7，两者的混合溶液在肝细胞保存液 中含量为850ml/L;
[0063] 细胞缓冲液中各组分含量为：7.6mM的KC1、2.5mM的CaCl2、280mM的NaCl、H 2C03/ NaHC03、NaH2P〇4/Na2HP〇4、无菌水，细胞缓冲液的pH为7 · 38，渗透压为312m0sm/L;
[0064] 氨基酸混合液中各组分含量为:5.7g/L赖氨酸、0.7g/L色氨酸、6.5g/L苯丙氨酸、 2.5g/L蛋氨酸、1.5g/L苏氨酸、4.3g/L异亮氨酸、4.6g/L亮氨酸、3. lg/L缬氨酸、1. Og/L亚硫 酸氢钠、1.5g/L谷氨酸、2.8g/L天门冬氨酸、2.3g/L精氨酸、3.9g/L瓜氨酸、10g/L的山梨醇。
[0065] 对照例3
[0066]对照保存液3，含有体积比为16ml/L羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、1.3g//L葡 萄糖、16g/L谷氨酸钠、260mg/L维生素 C、8g/L酚红、细胞缓冲液、氨基酸混合液；
[0067] 细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比为1:1.7，两者的混合溶液在肝细胞保存液 中含量为840ml/L;
[0068] 细胞缓冲液中各组分含量为：7.6mM的KC1、2.5mM的CaCl2、280mM的NaCl、H 2C03/ NaHC03、NaH2P〇4/Na2HP〇4、无菌水，细胞缓冲液的pH为7 · 38，渗透压为312m0sm/L;
[0069] 氨基酸混合液中各组分含量为:5.7g/L赖氨酸、0.7g/L色氨酸、6.5g/L苯丙氨酸、 1.5g/L苏氨酸、4.3g/L异亮氨酸、3. lg/L缬氨酸、1.0g/L亚硫酸氢钠、10g/L的山梨醇。
[0070] 试验例
[0071]利用上述实施例1~6的肝细胞保存液及对照例1~3的对照保存液对相同的L-02 细胞进行保存试验，试验过程如下：取同样体积的配制好的各个肝细胞保存液及对照保存 液，分别置于不同容器中，标记清晰，按照每l〇〇ml加入的1 X 101()数量的肝细胞给每个保存 液添加等量的肝细胞，放置于〇~4°C无菌环境后，分别在24h，48h，72h取样，测定其保存液 中L-02细胞的存活率，并记录进行比较，其试验结果见下表。
[0072] L-02细胞保存试验结果对比表
[0073]
[0074]从上述表格中可以看到，本发明所提供的肝细胞保存液首先在存活率方面明显优 于已有的细胞保存液，并且其中的各种成分均为人体可利用，或者是临床上使用的成分，所 以可以在治疗过程中进入人体，同时，该保存液的酚红除了可以作为观察细胞质量指标之 一，同时可以在治疗过程中实时监测肾脏排泄功能是否正常。而保存液中的高渗环境，可以 在一定程度上辅助缓解可能出现的肝性脑病，同时谷氨酸钠可以辅助降低因肝功能不足而 出现的血氨升高现象。该细胞保存液是特别针对L-02细胞所设计的保存液，保存液中的成 分可以在维持细胞存活率的情况下，更好的发挥该细胞的功能。
【主权项】
1. 一种肝细胞保存液，其特征在于：所述肝细胞保存液含有1~2g/L的葡萄糖、10~ 20g/L的谷氨酸钠、200~300mg/L的维生素 C、5~10g/L的酸红、10~20mg/L的葡醛内酯、50 ~100mg/L的多烯磷脂酰胆碱、羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、细胞缓冲液、氨基酸混合 液； 其中，每升肝细胞保存液中含有10~20ml的羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，含有 800~900ml的细胞缓冲液与氨基酸混合液的混合溶液，所述细胞缓冲液与氨基酸混合液的 体积比为1:1~2; 所述细胞缓冲液中各组分及含量为~10mM的KC1、2~2.6mM的CaCl2、276~290mM的 NaCl、H2C03/NaHC03、NaH2P〇4/Na 2HP〇4、无菌水，所述细胞缓冲液的pH为7.35~7.45，渗透压 为300~320m0sm/L; 所述氨基酸混合液中各组分及含量为:3.5~6.5g/L的赖氨酸、0.5~1.5g/L的色氨酸、 4.3~7.48凡的苯丙氨酸、1.8~4.68凡的蛋氨酸、1.0~3.88凡的苏氨酸、2.5~5.88凡的异 亮氨酸、3.6~6.3g/L的亮氨酸、2.6~5.4g/L的缴氨酸、0.2~1.3g/L的亚硫酸氢钠、9~ l〇g/L的山梨醇。2. 根据权利要求1所述的肝细胞保存液，其特征在于:所述肝细胞保存液含有1300~ 1600mg/L的葡萄糖、14~16g/L的谷氨酸钠、230~270mg/L的维生素 C、6~8g/L的酸红、15~ 18mg/L的葡醛内酯、60~80mg/L的多稀磷脂酰胆碱。3. 根据权利要求2所述的肝细胞保存液，其特征在于:所述每升细胞保存液中含有12~ 18ml的羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液，含有820~880ml的细胞缓冲液与氨基酸混合液 的混合溶液，，所述细胞缓冲液与氨基酸混合液的体积比为1:1.3~1.7。4. 根据权利要求3所述的肝细胞保存液，其特征在于:所述细胞缓冲液中各组分及含量 为：7 · 6~9 · 2mM的KC1、2 · 3~2 · 5mM的CaCl2、280~285mM的NaCl、H2⑶3/NaHC〇3、NaH2P〇4/ Na2HP〇4、无菌水，所述细胞缓冲液的pH为7.35~7.45，渗透压为300~320m0sm/L。5. 根据权利要求4所述的肝细胞保存液，其特征在于:所述氨基酸混合液中各组分含量 为:4~5.7g/L的赖氨酸、0.7~1.2g/L的色氨酸、5.3~6.5g/L的苯丙氨酸、2.5~3.2g/L的 蛋氨酸、1.5~2.7g/L的苏氨酸、3.5~4.3g/L的异亮氨酸、4.6~5.7g/L的亮氨酸、3.1~ 5.0g/L的缴氨酸、0.4~1.0g/L的亚硫酸氢钠、9~10g/L的山梨醇。6. -种制备权利要求1所述肝细胞保存液的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1)配制 细胞缓冲液:取KC1、CaCl2、NaCl和灭菌水混合，利用缓冲对H 2C03/NaHC03、NaH2P〇4/Na2HP〇4将 pH调至7.35~7.45,搅拌混匀，灭菌即为细胞缓冲液；（2)配制氨基酸混合液:取赖氨酸、色 氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、亚硫酸氢钠溶于含山梨醇的无 菌水溶液，搅拌混匀即为氨基酸混合液；（3)配制肝细胞保存液:将细胞缓冲液和氨基酸混 合液混合，搅拌混匀得混合溶液，将羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、葡萄糖、谷氨酸钠、 维生素 C、酚红、葡醛内酯、多烯磷脂酰胆碱，加入混合溶液，搅拌混匀测定其渗透压为300~ 320m0sm/L后，过滤除菌即得肝细胞保存液。7. -种利用权利要求1所述肝细胞保存液保存肝细胞的方法，其特征在于:该方法为在 无菌条件下将肝细胞与所述肝细胞保存液混合，每l〇〇ml肝细胞保存液中保存的肝细胞少 于或等于1 X 1〇1()，储存在细胞培养反应器中，置于〇~4°C环境中保存。
【专利摘要】本发明公开了一种肝细胞保存液及其制备方法和应用，该肝细胞保存液通过将羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液、葡萄糖、谷氨酸钠、维生素C、酚红、葡醛内酯、多烯磷脂酰胆碱、细胞缓冲液及氨基酸混合液混合，从而形成了成分稳定、营养物质多元、溶液渗透体系缓冲力强的细胞保存液。该细胞保存液不仅可为肝细胞提供营养，还能很好的维持细胞活性，使得在后续的临床使用中发挥更好的效果。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105532646
【申请号】CN201610054463
【发明人】周平, 陈露, 闵娅兰, 郭伟, 李亚丽
【申请人】武汉仝干生物科技有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月27日