一种细胞混合物及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明属于实验动物技术领域，涉及一种细胞混合物及其制备方法和用途，尤其涉及脂肪干细胞(ADSCs)和永生化脐静脉内皮细胞混合物在制备干预及建立血管畸形动物模型的制剂中的用途。本发明中将脂肪干细胞(ADSCs)和永生化脐静脉内皮细胞混合物用于干预及建立血管畸形动物模型，结果显示，能够低成本并且短期内高效的获得血管畸形动物模型，建立的裸鼠血管畸形动物模型可见明显的静脉畸形，该模型对静脉畸形的发病机制的研究和临床药物治疗的筛选有着重要的实践意义。
【专利说明】
一种细胞混合物及其制备方法和用途
技术领域
[0001]本发明属于实验动物技术领域，涉及一种细胞混合物及其制备方法和用途，尤其涉及脂肪干细胞(ADSCs)和永生化脐静脉内皮细胞混合物在制备干预及建立血管畸形动物模型的制剂中的用途。
【背景技术】
[0002]现有技术公开了血管畸形是一种好发于婴幼儿全身各个部位的血管源性增生，其中约71 %的血管畸形好发于头面及颈部，常会引起严重的患者容貌畸形并影响其身心健康发展。所述血管畸形的主要病理是血管内皮细胞的过度增生和异常血管腔的形成。临床上血管畸形大概分为三期:增生期、静止期和消退期；其中相当一部分可以自然消退。1982年，Mulliken和Glowacki依据细胞动力学，结合物理检查和临床病程，将血管病变分为血管瘤和血管畸形；所述血管瘤(hemang1ma)具有内皮细胞增殖特征，血管畸形(vascularmalformat1ns)是正常内皮细胞的血管畸形；静脉畸形(又称:海绵状血管畸形)是一种好发于头面颈的良性血管畸形，该种畸形在儿童中发病率很高，据调查显示，婴幼儿中I岁以下的发病率高达12%，临床表现为快速增生的充血性肿块，多数不能自然消退，并随着年龄的增长而增大。目前，关于血管畸形和血管畸形的发病原因和机制尚不清楚，临床实践中一直缺乏有效的治疗方法。近年来，血管畸形的生物学特性、临床和病理分类及其治疗一直是本领域研究的热点，特别随着分子生物学和干细胞生物学的发展，国内外学者陆续报道了血管畸形发病与治疗的相关机制；然而，适宜的血管畸形动物模型的缺乏，严重制约了对血管畸形的研究，因此，建立一个血管畸形实验动物模型对血管畸形发病机制的研究和临床药物治疗的筛选具有实践意义。
[0003]有文献报道了有关的血管瘤模型，而血管畸形模型的建立则鲜有报道。基于此，本申请的发明人拟提供细胞混合物在制备干预血管畸形动物模型的制剂中的用途，将有助于建立一种较之前报道的更为可靠的静脉畸形的研究用动物模型，对静脉畸形的发病机制的研究和临床药物治疗的筛选有着重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的缺陷或不足，提供一种细胞混合物及其制备方法和用途，尤其是脂肪干细胞(ADSCs)和永生化脐静脉内皮细胞混合物及其制备方法和在制备干预血管畸形动物模型的制剂中的用途。
[0005]基于永生化的人脐静脉内皮细胞系(Human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)具有增殖能力强的特点，本发明中，采用脂肪干细胞(ADSCs)和人永生化脐静脉内皮细胞(HUVEC)混合物制成种子细胞制剂，用于有效干预及建立血管畸形动物模型。
[0006]具体的，本发明的目的通过下述技术方法实现:
[0007]I)制备获得脂肪干细胞(ADSCs);
[0008]2)制备脂肪干细胞(ADSCs)和人永生化脐静脉内皮细胞(HUVEC)混合物种子细胞制剂；
[0009]3)建立血管畸形动物模型；
[0010]4)组织学检查；
[0011]5)鉴定，评价血管畸形结果。
[0012]本发明中，通过下述方法获得脂肪干细胞(ADSCs);
[0013](I)将离体的无菌脂肪组织，切碎并置于DMEM培养基中清洗，离心弃上清；(2)用5-20倍组织量的质量体积比为0.05?0.3%的消化酶溶液消化所述脂肪组织碎块45?90分钟；所述的消化酶为酵素酶、胶原酶NB4或者两者的混合液；
[0014](3)将步骤⑵的混悬液用吸管反复吹打3?5分钟；
[0015](4)对步骤(3)中解离的细胞在600-1500g离心3_10分钟，弃上清，得细胞团块；
[0016](5)用低糖培养液重悬上述步骤(4)得到的细胞，以1χ104-5χ104个/cm2接种于培养皿内传代培养，得脂肪干细胞(ADSCs)。
[0017]本发明中，取永生化脐静脉内皮细胞和ADSCs按不同的比例混合，制成种子细胞制剂；
[0018]本发明中，将制成的脂肪干细胞(ADSCs)和人永生化脐静脉内皮细胞(HUVEC)混合物作为种子细胞制剂，按常规方法建立裸鼠血管畸形动物模型，2W后行裸鼠双下肢MRI扫描，扫描后对双侧下肢肌肉组织行HE、Masson、免疫荧光、免疫组化等相关染色，鉴定，评价裸鼠血管畸形动物模型的血管畸形的情况；结果显示，建立的裸鼠血管畸形动物模型可见明显的静脉畸形，该模型对静脉畸形的发病机制的研究和临床药物治疗的筛选有着重要的实践意义。
[0019]本发明中，所述的组织为人或动物的脂肪组织，脂肪组织碎块体积为0.5-lOmm3；本发明的一个实施例中，所述脂肪组织碎块体积平均为Imm3;
[0020]本发明中，所述的DMEM培养基体积是脂肪组织体积的5-10倍；
[0021]本发明中，所述中消化酶可使用酵素酶和胶原酶NB4的混合液；所述混合液中，胶原酶NB4的浓度较佳为0.1?0.3%，如0.1%、0.2%、0.3%;酵素酶的浓度较佳为0.05?
0.2% ；
[0022]本发明中，所述消化酶混合酶的溶液是DMEM培养基，可含胎牛血清；本发明中，所述酵素酶即dispase，购自sigma公司(dispase又被称为分散酶、中性蛋白酶)；
[0023]本发明中，所用的内皮细胞为永生化的内皮细胞，与传统内皮细胞的区别在于该细胞的培养液不需要添加任何生长因子，另外，该细胞可以无限传代、扩增而永葆内皮细胞的特性；
[0024]本发明中，所述永生化脐静脉内皮细胞和ADSCs按1:1，1:2，1:3，2:1，3:1，4:1等不同的比例混合；
[0025]本发明中，所述实验鼠为无免疫源性6-8W裸鼠，所述的细胞混合物滞留在裸鼠下肢肌肉组织内；
[0026]本发明中，所述组织学检查包括HE、Masson、免疫荧光(⑶31，VWF，SMA)、免疫组化(CD31，VWF, SMA)等相关染色鉴定等。
[0027]本发明脂肪干细胞(ADSCs)和永生化脐静脉内皮细胞混合物用于干预及建立血管畸形动物模型，结果显示，能够低成本并且短期内高效的获得血管畸形动物模型，建立的裸鼠血管畸形动物模型可见明显的静脉畸形，该模型对静脉畸形的发病机制的研究和临床药物治疗的筛选有着重要的实践意义。
【附图说明】
[0028]图1显示了裸鼠左下肢血管畸形模型的建立；其中，I为Control组，2，3为左下肢血管畸形模型组。
[0029]图2显示了裸鼠左下肢血管畸形的HE(A)及Masson染色。
[0030]图3显示了裸鼠左下肢血管畸形的⑶31免疫荧光染色；其中，
[0031]A为DAPI染色；B为CD31染色；C为GFP染色；D为Merge图。
[0032]图4显示了裸鼠左下肢血管畸形的vWF免疫荧光染色；其中，
[0033]A为DAPI染色为vWF染色；C为GFP染色；D为Merge图。
[0034]图5显示了裸鼠左下肢血管畸形的免疫组化染色；其中，
[0035]A为CD31染色；B为vWF染色；C为SMA染色。
【具体实施方式】
[0036]实施例1
[0037]本实施例中，所述酵素酶即dispase，购自sigma公司(dispase又被称为分散酶、中性蛋白酶)
[0038]本实施例中，采用脂肪干细胞(ADSCs)和人永生化脐静脉内皮细胞(HUVEC)混合物制成种子细胞制剂，用于有效干预及建立血管畸形动物模型。
[0039]首先，通过下述方法获得脂肪干细胞(ADSCs);
[0040]将离体的无菌脂肪组织，切碎为1_3，置于DMEM培养基中清洗，所述的DMEM培养基体积是脂肪组织体积的5-10倍；离心弃上清；
[0041]用5-20倍组织量的质量体积比为0.05?0.3%的消化酶溶液消化所述脂肪组织碎块45?90分钟；所述的消化酶为酵素酶、胶原酶NB4或者两者的混合液；所述消化酶可使用酵素酶和胶原酶NB4的混合液；所述混合液中，胶原酶NB4的浓度较佳为0.1?0.3%，如0.1%、0.2%、0.3% ;酵素酶的浓度较佳为0.05?0.2% ;
[0042]将上述的混悬液用吸管反复吹打3?5分钟；对解离的细胞在600_1500g离心3-10分钟，弃上清，得细胞团块；用低糖培养液重悬上述步骤得到的细胞，以1χ104-5χ104个/cm2接种于培养皿内传代培养，得脂肪干细胞(ADSCs);
[0043]进一步，取永生化脐静脉内皮细胞和ADSCs按按1:1，1:2，1:3，2:1，3:1，4:1不同的比例混合，制成种子细胞制剂；
[0044]所用的内皮细胞为永生化的内皮细胞，与传统内皮细胞的区别在于该细胞的培养液不需要添加任何生长因子，另外，该细胞可以无限传代、扩增而永葆内皮细胞的特性；
[0045]将制成的脂肪干细胞(ADSCs)和人永生化脐静脉内皮细胞(HUVEC)混合物作为种子细胞制剂，选用6-8W无免疫源性裸鼠实验鼠按常规方法建立裸鼠血管畸形动物模型，所述的细胞混合物滞留在裸鼠下肢肌肉组织内；2W后行裸鼠双下肢MRI扫描，扫描后对双侧下肢肌肉组织行HE、Masson、免疫荧光、免疫荧光(⑶31，VWF，SMA)、免疫组化(⑶31，VWF，SMA)等相关染色，鉴定，评价裸鼠血管畸形动物模型的血管畸形的情况；结果显示，建立的裸鼠血管畸形动物模型可见明显的静脉畸形，该模型对静脉畸形的发病机制的研究和临床药物治疗的筛选有着重要的实践意义。
[0046]本实施例中，所述消化酶混合酶的溶液是DMEM培养基，可含胎牛血清；所述酵素酶即dispase，购自sigma公司(dispase又被称为分散酶、中性蛋白酶)。
【主权项】
1.一种细胞混合物，其特征在于，由脂肪干细胞(ADSCs)和永生化脐静脉内皮细胞按.1:1，1:2，1:3，2:1，3:1或4:1的比例混合制成。2.权利要求1所述的细胞混合物在制备干预血管畸形动物模型的制剂中的用途。3.按权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的细胞混合物作为种子细胞制剂通过下述技术方法干预及建立血管畸形动物模型: 1)制备获得脂肪干细胞(ADSCs); 2)制备脂肪干细胞(ADSCs)和人永生化脐静脉内皮细胞(HUVEC)混合物种子细胞制剂； 3)建立血管畸形动物模型； 4)组织学检查； 5)鉴定，评价血管畸形结果。4.按权利要求3所述的用途，其特征在于，通过下述方法获得脂肪干细胞(ADSCs); (1)将离体的无菌脂肪组织，切碎并置于DMEM培养基中清洗，离心弃上清； (2)用5-20倍组织量的质量体积比为0.05?0.3%的消化酶溶液消化所述脂肪组织碎块45?90分钟；所述的消化酶为酵素酶、胶原酶NB4或者两者的混合液； (3)将步骤(2)的混悬液用吸管反复吹打3?5分钟； (4)对步骤(3)中解离的细胞在600-1500g离心3-10分钟，弃上清，得细胞团块； (5)用低糖培养液重悬上述步骤⑷得到的细胞，以11104-51104个/。1112接种于培养皿内传代培养，得脂肪干细胞(ADSCs)。5.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述细胞混合物中，人永生化脐静脉内皮细胞和 ADSCs 按 1:1，1:2，1:3，2:1，3:1，4:1 的比例混合。6.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述血管畸形动物模型中所用的实验鼠为无免疫源性6-8W裸鼠，所述的细胞混合物滞留在裸鼠下肢肌肉组织内。7.按权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的组织学检查包括HE、Masson、免疫荧光CD31，VffF, SMA、免疫组化CD31，VffF, SMA相关染色鉴定。8.按权利要求4所述的用途，其特征在于，所述步骤(2)中消化酶采用酵素酶和胶原酶NB4的混合液；所述混合液中，胶原酶NB4的浓度为0.1?0.3%，所述酵素酶的浓度为.0.05 ?0.
【文档编号】C12N5/0775GK105838670SQ201510017031
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月13日
【发明人】陆信武, 袁福康, 秦金保, 彭智猷, 叶开创, 杨心蕊, 黄丽佳, 蒋米尔
【申请人】上海交通大学医学院附属第九人民医院