制备气道细胞的组合物和方法

制备气道细胞的组合物和方法
【专利摘要】本发明提供了制备气道细胞的组合物和方法。在一个方面，描述了源自诱导多能干(iPS)细胞的上皮气道细胞，其特征在于表达气道细胞表面标记和增殖的能力。在另一个方面，提供了将iPS分化为上皮气道细胞的方法。还公开了工程化肺、制造包括上皮气道细胞的这样的工程化肺和治疗呼吸障碍的方法。
【专利说明】制备气道细胞的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2014年1月14日提交的美国临时专利申请号61/927,097的优先权，其 全部公开内容通过引用并入本文，如同以其全部在本文陈述一样。
[0003] 发明背景
[0004] 在美国，有大约30,000人患有囊性纤维化(CF)，并且每年诊断出大约1,000例新的 CFXF是最严重地影响肺以及胰腺、肝和肠的常染色体隐性遗传病。其特征在于异常地输送 氯化物和钠穿过上皮，导致稠密的、粘性的分泌物。患有CF的人中最常见的死亡原因是呼吸 衰竭。多个研究已经显示囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因的突变可以损害折叠、 分泌、细胞表面稳定性、和/或穿过上皮的CFTR氯离子通道的功能。虽然在进行巨大的努力 以鉴定靶向CFTR结构缺陷的化合物，但是到目前为止它们的临床疗效被证明很差，这凸显 出更好地理解CFTR调节的分子机制的必要性，其是用于研发更有效的疗法的先决条件。
[0005] 在气道中，CFTR突变对近端气道上皮细胞具有很大影响。CF研究中的主要困难之 一是缺少供机制研究和药物研发使用的活的人近端气道上皮细胞一一细胞类型受CFTR突 变选择性地影响。CF的动物模型通常不非常好地重演人的状况。
[0006]已经显示诱导多能干（iPS)细胞展示了发育为肺泡上皮细胞的潜能。多个研究组 已经报道，使用多种方案朝向肺泡II型细胞分化ESC和iPS细胞。然而，仍然很差地理解这些 极度重要的气道疾病的许多方面。
[0007] 因此，本领域中存在用于鉴定将要在肺相关疗法中使用的功能性气道上皮细胞的 可靠来源的需求。

【发明内容】

[0008] 本发明包括制备气道上皮细胞的组合物和方法，该气道上皮细胞可以在组织工程 中使用并且可以用于治疗呼吸障碍。
[0009] 在一个方面，本发明包括源自诱导多能干(iPS)细胞的气道上皮细胞，其特征在于 气道细胞表面标记的表达一一其中气道细胞表面标记包括克拉拉细胞分泌蛋白（CCSP)、细 胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1--和在培养中增殖而不丧失气道细胞表面标记的能力。在一个 方面，本发明包括将诱导多能干(iPS)细胞分化为气道上皮细胞的方法，其包括在缺乏血清 的情况下培养iPS细胞以诱导分化为定形内胚层(DE)细胞，在存在血清的情况下培养DE细 胞以诱导分化为前前肠内胚层(anterior foregut endoderm)(AFE)细胞，并且在存在血 清、细胞因子混合物(cocktail)和高浓度的视黄酸的情况下培养AFE细胞以诱导AFE细胞分 化为气道上皮细胞。在另一个方面，本发明包括工程化三维肺组织的方法，其包括将诱导多 能干(iPS)细胞群分化为气道上皮细胞--其中气道上皮细胞表达包括克拉拉细胞分泌蛋 白（CCSP)、细胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1的气道细胞表面标记;并且能够在培养中增殖而不 丧失气道细胞标记一一和将气道上皮细胞接种在三维支架上。在又另一个方面，本发明包 括包含本文所述的气道上皮细胞的工程化三维肺组织。
[0010]在本文描绘的本发明的以上方面或任何其它方面的多种实施方式中，本发明包括 有纤毛的气道上皮细胞。在另一个实施方式中，气道上皮细胞源自囊性纤维化人iPS细胞。 在又另一个实施方式中，气道上皮细胞能够在培养中增殖至少大约30天，比如大于大约30 天。
[0011] 在另一个实施方式中，气道细胞表面标记的表达进一步包括囊性纤维化跨膜传导 调节蛋白（CFTR)，和/或β-微管蛋白IV、粘蛋白-5AC和P63中的至少一种。在又另一个实施方 式中，气道细胞表面标记以比得上在新鲜分离的人气道细胞上表达的水平表达。
[0012] 在一个实施方式中，培养iPS细胞包括在存在激活素 Α的情况下培养iPS细胞。在这 样的实施方式中，激活素 A在iPS细胞培养中处于大约饱和浓度。在另一个实施方式中，培养 iPS细胞包括在存在无血清补充物的情况下培养iPS细胞。
[0013] 在一个实施方式中，DE细胞表达选自c-ki t、S0X17、F0XA2和CXCR4的一种或多种定 形内胚层细胞标记。在这样的实施方式中，在存在ECM分子的情况下的培养包括在用ECM分 子培养之前使DE细胞解离。同样，ECM分子可以包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、生腱 蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖中的一种或多种。在另一个实施方式中，培养DE细胞 包括顺序地暴露DE细胞至小分子抑制剂以抑制后内胚层命运(posterior endoderm fate) 和诱导近端内胚层命运(proximal endoderm fate)，比如抑制BMP/TGF信号传导的小分子 抑制剂，诸如 dorsomorphin、Noggin、A83-01、DMH-l、D4476、GW788388、LY364947、RepSox、 SB431542、SB505124、SB525334和SD208。同样，小分子抑制剂可以抑制TGF/WNT信号传导，比 如 1洲-1、勖88丨11、〇：1'036477、1肝2、去甲氧基姜黄素、^535483-01、04476、6￥788388、 LY364947、R印 5(?、58431542、58505124、58525334和50208。
[0014] 在另一个实施方式中，AFE细胞表达NKX2.1。
[0015] 在又另一个实施方式中，高浓度的视黄酸包括至少大约0.5μΜ的视黄酸，比如大约 1μΜ〇
[0016] 在另一个实施方式中，细胞因子混合物抑制WNT途径。
[0017] 在还另一个实施方式中，iPS细胞源自患病的人细胞，比如囊性纤维化疾病特异性 人iPS细胞。
[0018] 在另一个方面，本发明包括改善、治疗或减轻需要其的对象中的呼吸障碍的症状 的方法，其包括将诱导多能干（iPS)细胞分化为气道上皮细胞一一其中气道上皮细胞表达 包括克拉拉细胞分泌蛋白（CCSP)、细胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1的气道细胞表面标记，并且 能够在培养中增殖而不丧失气道细胞标记--和以对治疗对象中的呼吸障碍有效的量施 用气道上皮细胞。
[0019] 在本文描绘的本发明的以上方面或任何其它方面的多种实施方式中，本发明包括 形成类器官结构的气道上皮细胞。
[0020]在另一个实施方式中，三维支架包括基质胶(matrigel)。
【附图说明】
[0021]图1图解了将人iPS细胞分化为气道上皮细胞的步骤。
[0022]图2A显示了在第5天时表达c-kit的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞检测分析。 [0023]图2B显示了在第5天时表达F0XA2的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞检测分析。 [0024]图2C显示了在第5天时表达S0X17的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞检测分析。
[0025]图2D显示了在第5天时在克隆Cl中表达CXCR4的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞 检测分析。
[0026]图3A显示了在AFE分化期间激动剂和拮抗剂对F0XA2/S0X2表达的作用。
[0027]图3B显示了在AFE分化期间激动剂和拮抗剂对NKX2.1表达的作用。
[0028]图4图解了方案的步骤，操作所述方案以将人iPS细胞分化为气道上皮细胞并导致 NKX2.1+F0XA2+细胞的增加。
[0029] 图5显示了与暴露于N0GGIN/SB的DE细胞相比，第15天时NKX2.1+F0XA2+细胞的增 加，小于1 %没有前部化(anteriorization) 〇
[0030] 图6A显示了用DAPI染色的离体分化的ΝΚΧ2.Γ细胞。
[0031] 图6B显示了用F0XA2染色的离体分化的ΝΚΧ2.Γ细胞。
[0032] 图6C显示了用NKX2.1染色的离体分化的ΝΚΧ2.Γ细胞。
[0033] 图6D显示了用NKX2.1/F0XA2/DAPI共染色的离体分化的ΝΚΧ2.Γ细胞，表明ΝΚΧ2.Γ 细胞在体外分化。
[0034] 图7A显示了用DAPI染色的离体分化的NKX2.1+/S0X2+。
[0035] 图7B显示了用S0X2染色的离体分化的NKX2.1+/S0X2+。
[0036] 图7C显示了用NKX2.1染色的离体分化的NKX2.1+/S0X2+。
[0037] 图7D显示了用S0X2/NKX2.1/DAPI染色的离体分化的NKX2.1+/S0X2+，表明NKX2. Γ/ S0X2+细胞在体外分化。
[0038] 图8是显示与治疗前的大约1-2%相比，NKX2.1+/S0X2+气道祖细胞接近大约30%的 柱形图。
[0039]图9是显示气道分化和基础培养基的补充物的图。
[0040]图10A显示了第20天时的F0XJ1的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞。
[00411图10B显示了第20天时的KRT5的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞。
[0042]图10C显示了第20天时的CFTR的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞。
[0043] 图10D显示了第20天时的CCSP或SCGB1A1的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞。
[0044]图10E显示了第20天时的P63的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞。
[0045]图10F显示了第20天时的S0X2的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞。
[0046]图10G显示了第20天时的粘蛋白5AC的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞。
[0047]图11是显示在第27天时生长因子和抑制剂结合诱导气道上皮分化的图。
[0048]图12A显示了在第27天时表达F0XJ1的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞检测分 析。
[0049]图12B显示了在第27天时表达CFTR的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞检测分析。 [0050]图12C显示了在第27天时表达β-微管蛋白IV的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞 检测分析。
[0051 ]图12D显示了在第27天时表达S0X2的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞检测分析。 [0052]图12E显示了在第27天时表达CCSP的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞检测分析。 [0053]图12F显示了在第27天时表达KRT5的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞检测分析。 [0054]图12G显示了在第27天时表达粘蛋白5AC的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞检测 分析。
[0055]图12H显示了在第27天时表达P63的源自iPS细胞的细胞群的流式细胞检测分析。 [0056]图13A显示了在第27天时的CFTR的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞。
[0057]图13B显示了在第27天时的F0XJ1的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞。
[0058] 图13C显示了在第27天时的SCGB1A1 (CCSP)的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细 胞。
[0059]图13D显示了在第27天时的粘蛋白5AC的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞。 [0060]图13E显示了在第27天时的NKX2.1的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞中。
[00611图13F显示了在第27天时的KRT5的定量RT-PCR产生成熟肺气道上皮细胞。
[0062]图14是显示在第35天时气道上皮细胞分化成熟的图。
[0063] 图15A显示了染色为近端先祖(proximal progenitor)的气道上皮细胞。
[0064]图15B显示了用F0XJ1抗体染色的气道上皮细胞。
[0065]图15C显示了用粘蛋白5AC抗体染色的气道上皮细胞。
[0066]图1?显示了用CCSP抗体染色的气道上皮细胞。
[0067]图15E显示了用CFTR抗体染色的气道上皮细胞。
[0068] 图15F显示了用PanKRT抗体染色的气道上皮细胞。
[0069]图16A显示了第35天时气道细胞标记粘蛋白5AC的流式细胞检测分析。
[0070]图16B显示了第35天时气道细胞标记F0XJ1的流式细胞检测分析。
[0071]图16C显示了第35天时气道细胞标记β-微管蛋白IV的流式细胞检测分析。
[0072]图16D显示了第35天时气道细胞标记Ρ63的流式细胞检测分析。
[0073]图16Ε显示了第35天时气道细胞标记CFTR的流式细胞检测分析。
[0074]图16F显示了第35天时气道细胞标记CCSP的流式细胞检测分析。
[0075]图16G显示了第35天时气道细胞标记CK5或KRT5的流式细胞检测分析。
[0076]图16H显示了第35天时气道细胞标记S0X2的流式细胞检测分析。
[0077] 图17A显示了在第35天时的KRT5或CK5的定量RT-PCR产生iPS源气道上皮细胞。
[0078] 图17B显示了在第35天时的CFTR的定量RT-PCR产生iPS源气道上皮细胞。
[0079] 图17C显示了在第35天时的NKX2.1的定量RT-PCR产生iPS源气道上皮细胞。
[0080] 图17D显示了在第35天时的P63的定量RT-PCR产生iPS源气道上皮细胞中。
[0081 ] 图17E显示了在第35天时的SCGB1A1或CCSP的定量RT-PCR产生iPS源气道上皮细胞 中。
[0082] 图17F显示了在第35天时的F0XJ1的定量RT-PCR产生iPS源气道上皮细胞。
[0083] 图17G显示了在第35天时的粘蛋白5AC的定量RT-PCR产生iPS源气道上皮细胞。
[0084]图18图解了从CF疾病特异性人iPS细胞生成肺气道先祖的逐步分化途径。
[0085]图19A显示了用CFTR抗体染色的源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞。 [0086]图19B显示了用粘蛋白5AC抗体染色的源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细 胞。
[0087]图19C显示了用PanKRT抗体染色的源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞。 [0088]图19D显示了用CCSP抗体染色的源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞。 [0089]图20A显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的粘蛋白5AC的流式 细胞检测分析。
[0090] 图20B显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的P63的流式细胞检 测分析。
[0091] 图20C显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的β-微管蛋白IV的 流式细胞检测分析。
[0092]图20D显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的F0XJ1的流式细胞 检测分析。
[0093]图20E显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的CFTR的流式细胞 检测分析。
[0094]图20F显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的S0X2的流式细胞 检测分析。
[0095]图20G显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的CK5或KRT5的流式 细胞检测分析。
[0096]图20H显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的CCSP的流式细胞 检测分析。
[0097]图21A显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的NKX2.1的定量RT-PCR〇
[0098]图21B显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的粘蛋白5AC的定量 RT-PCR。
[0099]图21C显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的S0X2的定量RT-PCR〇
[0100] 图21D显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的P63的定量RT-PCR〇
[0101] 图21E显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的SCGB1A1或CCSP的 定量 RT-PCR。
[0102] 图21F显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的F0XJ1的定量RT-PCR〇
[0103] 图21G显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的KRT5的定量RT-PCR〇
[0104] 图21H显示了源自CF疾病特异性人iPS细胞的气道上皮细胞中的CFTR的定量RT-PCR〇
[0105] 图22A是显示在基质胶中发育为肺类器官结构的源自iPSC的气道祖细胞的阳性 P63免疫染色的一组图。
[0106] 图22B是显示在基质胶中发育为肺类器官结构的源自iPSC的气道祖细胞的阳性 NKX2.1免疫染色的一组图。
[0107] 发明【具体实施方式】
[0108] 定义
[0109] 除非另外限定，本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员 通常理解的相同的含义。虽然与本文描述的那些类似或等价的任何方法和材料可以在用于 测试本发明的实践中使用，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明 中，将使用以下术语。
[0110] 还可以理解，本文使用的术语仅仅是出于描述【具体实施方式】的目的，并且不意欲 是限制性的。
[0111] 如本文使用的，冠词"一个(a)"和"一种(an)"用于指一个或多于一个（即，至少一 个)该冠词的语法对象。举例来说，"一个要素"意思是一个要素或多于一个要素。
[0112] 如本文使用的，当提及可测量的值比如量、时距等时，术语"大约"意为包含规定值 的±20%的变化、或在规定值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、 0.1%、0.05%或0.01%内，因为这样的变化适合于进行公开的方法。除非另外从上下文清 楚，本文提供的全部数值由术语大约修饰。
[0113] "前前肠内胚层"是在生成肝的内胚层前面的内胚层。本领域技术人员将容易地领 会"前前肠内胚层"因而包括，例如，咽内胚层和其它更高度分化的内胚层细胞群，并且术语 "前前肠内胚层"包含的多种细胞类型可以展示分子标记的不同的表达模式。本领域技术人 员将领会"前前肠内胚层"生成多种组织，例如，扁桃体、鼓膜、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、气 管、食管、胃、肺和喉/咽。
[0114] 如本文使用的，术语"分化"指的是较少特化的细胞比如干细胞或诱导多能干细胞 变为更特化的细胞类型，以便其成为特定的谱系一一包括但不限于某些祖细胞以及更特化 的体细胞--的过程。干细胞分化的条件是本领域中熟知的。
[0115] 如本文使用的，"分化培养基"指的是细胞生长培养基，其包含添加剂或缺乏添加 剂，以便当在该培养基中培育时，干细胞、诱导多能细胞、或未完全分化的其它这样的组细 胞发育为具有分化细胞或比干细胞、诱导多能细胞或其它这样的细胞更多地分化的细胞的 一些或全部特性的细胞。
[0116] "定形内胚层细胞"意思是表达定形内胚层谱系的一种或多种标记的细胞。这些标 记可以包括但不限于 CXCR4、S0X17、GATA-4、F0XA2、AFP、CER1、C-KIT、EPCAM、SNAI1、GSC、E-Cad或N-Cad。定形内胚层由能够朝向源自内胚层胚层的组织中的一种或多种进一步分化的 细胞在功能上限定。这可以包括肺、甲状腺、肝、胰腺或肠。
[0117] "气道上皮细胞"意思是组成衬在（line)大气道(支气管)和小气道(细支气管）内 的一层细胞的上皮细胞。气道上皮细胞包括有纤毛的、分泌的、基底的和柱状的细胞类型。
[0118] "诱导多能干细胞"或"iPS细胞"意思是通过诱导特定基因的表达，人工地(使用遗 传或化学方法)源自非多能细胞一一通常是成人体细胞一一的一类多能干细胞。诱导多能 干细胞基本上类似于天然多能干细胞。诱导多能干细胞能够分化为多种细胞类型，其包括 但不限于定形内胚层细胞、前前肠内胚层细胞和气道上皮细胞。
[0119] 术语"类器官"指的是模拟组织或器官的表面外观或真实结构或功能的一种或多 种细胞类型的三维聚集体。
[0120] 术语"诱导（induction)"或"诱导（induce)"与引起对细胞的表型发生具体作用的 过程或行为相关。这样的作用可以是引起表型变化的形式，例如，分化至另一种细胞表型； 或可以是维持细胞处于特定细胞的形式，例如，阻止脱分化或促进细胞的存活。
[0121]如本文使用的，术语"多能的"指的是维持允许分化为多种细胞类型的能力的未分 化细胞。
[0122]术语"前体细胞"、"组细胞"和"干细胞"在本领域中可交换地使用，并且如本文使 用的，指的是多能的或谱系-未定型的组细胞，其潜在地能够不限数目地有丝分裂以更新其 自身或产生将分化为期望的细胞类型的子代细胞。与多能干细胞相比，谱系-定型的祖细胞 通常被认为不能够生成在表型上彼此不同的众多细胞类型。相反，祖细胞生成一种或可能 两种谱系一一定型的细胞类型。在一个实施方式中，干细胞是诱导多能干(iPS)细胞。
[0123] "呼吸障碍"意思是身体上显现在呼吸道中的疾病或病症，包括但不限于囊性纤维 化、呼吸窘迫综合征、急性呼吸窘迫综合征、肺结核、咳嗽、支气管哮喘、基于增加的气道高 反应性的咳嗽(支气管炎、流感综合征(flu syndrome)、哮喘、阻塞性肺病等）、流感综合征、 止咳(anti-cough)、气道高反应性、结核病、哮喘（气道炎性细胞浸润、增加的气道高应答 性、支气管收缩、粘液分泌过多等）、慢性阻塞性肺病、气肿、肺纤维化、特发性肺纤维化、咳 嗽、可逆性气道阻塞、成人呼吸疾病综合征、鹤"爱好者"病(pigeon fancieV s disease)、 农民肺、支气管肺发育异常、气道障碍、气肿、变应性支气管肺曲霉病、过敏性支气管炎支气 管扩张、职业性哮喘、反应性气道疾病综合征(reactive airway disease syndrome)、间质 性（inters i t ial)肺病、寄生性肺病等。
[0124] 在本公开内容中，"包括（comprises) "、"包括（comprising) "、"包含 (containing)"和"具有(having)"等可以具有归属于它们在美国专利法中的含义，并且可 以意为"包括（includes )"、"包括（including)" 等；"主要由......组成（consisting essentially of)"或"主要由......构成(consists essentially)"同样地具有归属于美 国专利法的含义，并且该术语是开放式的，其允许比叙述的多的特征的存在，只要叙述的特 征的基本特性或新颖特性没有被比叙述的多的特征的存在改变，但是排除现有技术实施方 式。
[0125] "有效量"意思是相对于未治疗的患者减少或改善呼吸障碍、病症或疾病的临床标 记中的至少一种症状或变化所需的量。用于治疗呼吸障碍、病症或疾病的气道上皮细胞的 有效量取决于具体的障碍、病症或疾病的方式，障碍、病症或疾病的程度，和细胞的施用，以 及对象的年龄、体重和一般健康变化。
[0126] "可扩增性"在本文使用以指细胞增殖的能力，例如，在数目上扩增，或在细胞群的 情况下经历群体倍增。
[0127] 如本文使用的，术语"表达"限定为由其启动子驱动的具体的核苷酸序列的转录 和/或翻译。
[0128] 术语"分离的"、"纯化的"或"生物学上纯的"指的是如此物质，其以不同程度脱离 如在其天然状态发现的正常伴随其的组分。"分离"表示与原始来源或环境分开的程度。"纯 化"表示高于分离的分开程度。"纯化的"或"生物学上纯的"蛋白质充分地不含其它物质，以 便任何杂质不实质地影响蛋白质的生物学性质或引起其它不良后果。即，如果细胞基本上 不含细胞或物质，则其是纯化的。通常使用分析技术测定纯度和均一性，例如，流式细胞术 或流动激活的（flow activated)细胞分选。术语"纯化的"可以表示细胞大体上产生一个群 体。
[0129] 如本文使用的，"表型"指的是细胞的全部物理、生化和生理组成，例如，具有任意 一种性状或任意性状组。
[0130] "增殖"在本文使用以指类似的形式一一尤其是细胞一一的繁殖或增加。即，增殖 包含产生更大数目的细胞，并且可以通过一一除了其它以外一一简单地计数细胞的数目、 测量并入细胞的3H-胸苷等测量。
[0131] 如本文使用的，"样品"或"生物样品"指的是任何事物，其可以包含对筛选方法或 治疗期望的感兴趣的细胞(例如，其癌细胞或肿瘤细胞）。样品可以是生物样品，比如生物流 体或生物组织。在一个实施方式中，生物样品是包含肺动脉内皮细胞的组织样品。这样的样 品可以包括各种各样的细胞、蛋白质和遗传物质。生物组织的实例还包括器官、肿瘤、淋巴 结、动脉和个体细胞(一种或多种）。生物流体的实例包括尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、 粪便、痰、脑脊液、眼泪、粘液、羊水等。
[0132] 如其中使用的，"对象"或"患者"可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例 如牲畜和宠物，比如羊科、牛科、猪科、犬科、猫科和鼠科哺乳动物。优选地，对象是人。
[0133] 如本文使用的，术语"治疗（treat)"、"治疗（treating)"、"治疗(treatment)"等指 的是减少或改善呼吸障碍、病症或疾病和/或与其相关联的一种或多种症状。将领会，虽然 未排除，但是治疗呼吸障碍、病症或疾病不需要该障碍、病症、疾病或与其相关联的症状被 完全地缓和或消除。
[0134] 本文提供的范围理解为是该范围内的全部值的简写。例如，1至50的范围理解为包 括选自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的任 何数字、数字组合或子范围。
[0135] 本文叙述的变量或方面的实施方式包括作为任何单一实施方式的实施方式或与 任何其它实施方式或其部分组合的实施方式。
[0136] 本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其它组合物和方法中的一 种或多种组合。
[0137] 气道上皮细胞
[0138] 供体肺的可替代来源的发展将改变肺病治疗的范例。治疗末期肺病的一个选项是 移植由患者特异性细胞制成的工程化肺。iPS细胞源气道上皮细胞的发现不仅促进了基础 肺病理学的研究，而且促进了研发用于治疗肺病一一包括CF-一的新型疗法。如本文所述 的源自iPS细胞的气道上皮细胞为基于细胞的治疗应用和患病的肺上皮的潜在替换提供了 独特的机会。
[0139] 在一个方面，源自诱导多能干(iPS)细胞的气道上皮细胞包括在本发明中。气道上 皮细胞的特征在于表达气道细胞表面标记，比如克拉拉细胞分泌蛋白（CCSP)、细胞角蛋白5 (KRT5)和F0XJ1。气道上皮细胞还具有在培养中增殖而不丧失气道细胞表面标记的能力。气 道上皮细胞包括有纤毛的、分泌的、基底的和柱状的细胞类型。在一个实施方式中，气道上 皮细胞是有纤毛的。
[0140] 源自iPS细胞的气道上皮细胞还表达大量气道特异性细胞表面标记。气道细胞表 面标记的实例包括但不限于粘蛋白1或MUC1、粘蛋白5AC、FOX J1、CCSP、KRT5、KRT14、TRP63、 SOX17、SOX2、0-微管蛋白 IV或CFTR。
[0141] 粘蛋白1或MUC1是粘蛋白家族的成员，并且是膜结合的糖基化磷蛋白。该蛋白质通 过跨膜结构域锚定至许多上皮的顶端表面。示例性粘蛋白1序列包括在GenBank登录号NM_ 001018016或NP_001018016处发现的人MUC1序列或其片段，和在NM_013605或NP_038633处 发现的小鼠 Mucl序列或其片段。
[0142 ]粘蛋白5AC是在胃和呼吸道上皮中发现的糖蛋白。示例性粘蛋白5AC序列包括在 GenBank登录号XM_003403450或P98088处发现的人MUC5AC序列或其片段。
[0143] 叉头框(forkhead box)Jl(FOXJl)是参与纤毛形成的转录因子。示例性F0XJ1序列 包括在GenBank登录号NM_001454或NP_001445处发现的人F0XJ1序列或其片段，和在NM_ 008240或NP_032266处发现的小鼠 Foxjl序列或其片段。
[0144] 克拉拉细胞分泌蛋白（CCSP)是免疫调节剂和抗炎剂。示例性CCSP序列包括在 GenBank登录号NM_003357或NP_003348处发现的人CCSP序列或其片段，和在NM_011681或 NP_035811处发现的小鼠 CCSP序列或其片段。
[0145] 角蛋白5(KRT5)属于形成角质形成细胞的结构框架的一组坚韧的纤维状蛋白质。 示例性KRT5序列包括在GenBank登录号NM_000424或NP_000415处发现的人KRT5序列或其片 段，和在NM_027011或NP_081287处发现的小鼠 KRT5序列或其片段。
[0146] 角蛋白14(KRT14)是中间丝蛋白的I型角蛋白家族的成员。示例性KRT14序列包括 在GenBank登录号NM_000526或NP_000517处发现的人KRT14序列或其片段，和在NM_016958 或NP_058654处发现的小鼠 KRT14序列或其片段。
[0147] 转化相关蛋白63(TRP63或P63)是参与细胞对压力和发育的应答的转录因子的p53 家族的成员。示例性TRP63序列包括在GenBank登录号NM_001114978或NP_001108450处发现 的人TRP63序列或其片段，和在NM_001127259或NP_001120731处发现的小鼠 TRP63序列或其 片段。
[0148] 性别决定区Y框17(S0X17)是结合目标启动子DNA并在胚胎发育的调节中发挥关键 作用的转录调节子。示例性S0X17序列包括在GenBank登录号NM_022454或NP_071899处发现 的人S0X17序列或其片段。
[0149] 性别决定区Y框2(S0X2)是对维持未分化的胚胎干细胞的自我更新或多能性必需 的转录因子。示例性CFTR序列包括在GenBank登录号NM_003106或NP_003097处发现的人 CFTR序列或其片段，和在NM_011443或NP_035573处发现的小鼠 CFTR序列或其片段。
[0150] β-微管蛋白IV是球状蛋白质的小家族的数个成员中的一个。β-微管蛋白IV以纤毛 细胞类型存在，并且对哺乳动物中的轴丝(axonemal)结构可能是需要的。
[0151] 如本文别处描述的，CFTR是参与输送氯离子穿过细胞膜的蛋白质。示例性CFTR序 列包括在GenBank登录号NM_000492或NP_000483处发现的人CFTR序列或其片段，和在NM_ 021050或NP_066388处发现的小鼠 CFTR序列或其片段。
[0152] 在一个实施方式中，源自iPS细胞的气道上皮细胞包括表达气道细胞表面标记 CFTR。在另一个实施方式中，气道细胞表面标记包括β-微管蛋白IV、粘蛋白-5AC和P63。气道 细胞表面标记在气道上皮细胞中的表达比得上在新鲜分离的人气道细胞上表达的水平。
[0153] 与分离的气道细胞不同，源自iPS细胞的气道上皮细胞能够增殖数代而不丧失气 道上皮细胞相关标记，比如CCSP、P63、F0XJ1、CFTR和MUC5AC。细胞的增殖能力可以出于不同 的目的用于生成数百万细胞。当使用自体iPS细胞源细胞转换这些技术用于产生组织工程 化人肺组织时，"放大(scale up)"先祖群体的能力是特别有价值的。在一个实施方式中，气 道上皮细胞能够在培养中增殖至少大约30天。在另一个实施方式中，气道上皮细胞能够在 培养中增殖大于大约30天。
[0154] 分化为气道上皮细胞
[0155] 在一个方面，本发明进一步提供将诱导多能干（iPS)细胞分化为气道上皮细胞的 方法。方法包括在缺乏血清的情况下培养iPS细胞以诱导分化为定形内胚层(DE)细胞，在存 在血清的情况下培养DE细胞以诱导分化为前前肠内胚层(AFE)细胞，并且在存在血清的情 况下在细胞因子混合物和高浓度的视黄酸中培养AFE细胞以诱导AFE细胞分化为气道上皮 细胞。
[0156] iPS 细胞
[0157] 可以使用与来自 2006(Yamanaka等，Cell Stem Cell 1:39-49(2007))的原始描述 的方法基本类似的方法或本领域技术人员已知的修改得到可以与本发明一起使用的iPS细 胞。例如，可以通过修改将基因插入宿主细胞DNA的方法产生iPS细胞。参见，例如，Wernig 等，PNAS，105:5856-5861(2008) ;Jaenisch等，Cell 132:567-582(2008) ;Hanna等，Cell 133:250-264(2008);和Brambrink等，Cell Stem Cell 2:151-159(2008)。这些参考文献通 过引用以其全部并入，以便教导iPS细胞和产生它们的方法。
[0158] 由于iPS细胞源自已经被重编程为多能干细胞的体细胞，因此多种细胞类型可以 用于生成iPS细胞。例如，用来自患有呼吸障碍--比如囊性纤维化--的对象的自体细胞 治疗将缓解或阻止细胞的免疫排斥。因此，从将接受用源自它们的iPS细胞的分化细胞治疗 的对象生成iPS细胞是有用的。在一个实施方式中，气道上皮细胞源自患病的细胞，比如囊 性纤维化人iPS细胞。在另一个实施方式中，气道上皮细胞源自与患有呼吸障碍的对象自体 的细胞。
[0159] 将iPS细胞分化为气道上皮细胞的方法包括培养iPS细胞以诱导分化为DE细胞。在 一个实施方式中，iPS细胞在缺乏血清的情况下培养。在另一个实施方式中，iPS细胞在存在 无血清补充物的情况下培养。无血清补充物的实例包括但不限于血清替代品（Sigma， St.Louis，M0)、B_27(Life Technologies，Car1sbad，CA)、BI0GR0_2(BI，Israel)、 Knock0ut?(Life Technologies，Carlsbad，CA)、PluriQ(GlobalStem，Rockvilie，MD)、 TCH?(MP，Santa Ana，CA)和其它类似的补充物。
[0160] 在一个实施方式中，iPS细胞可以在存在诱导分化至定形内胚层细胞的试剂、分子 或化合物的情况下培养，其包括但不限于激活素 A、nodal蛋白、激活素 A的激动剂、抑制素的 拮抗剂或其任意组合。例如，细胞可以用激活激活素 A受体的试剂、分子或化合物培养，比如 激活素 A或激活素 A受体激动剂。在另一个实例中，细胞可以用以与激活素 A类似的方式提供 激活信号或刺激细胞的试剂、分子或化合物一一比如nodal蛋白一一培养，导致iPS细胞分 化为定形内胚层细胞。在又另一个实施例中，细胞可以用试剂、分子或化合物，比如激活素 A 抑制剂的拮抗剂，例如，抑制素的抑制剂，或其它拮抗分子培养，所述其它拮抗分子可以间 接地激活激活素 A受体或诱导分化至定形内胚层细胞。
[0161] 诱导iPS细胞分化至定形内胚层细胞的一种或多种试剂、分子或化合物一一比如 激活素 A--的浓度可以在大约5ng/ml至大约500ng/ml的范围内。一种或多种试剂、分子或 化合物--比如激活素 A--的浓度可以是大约5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、 75ng/ml、80ng/ml、85ng/ml、90ng/ml、95ng/ml、lOOng/ml、llOng/ml、120ng/ml、130ng/ml、 140ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、200ng/ml、225ng/ml、250ng/ml、275ng/ml、300ng/ml、 350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml、550ng/ml或其间的任何浓度。在一个实施方式中，iPS细胞 在存在lOOng/ml的一种或多种试剂、分子或化合物一一比如激活素 A-一的情况下培养，以 诱导iPS细胞分化至定形内胚层细胞。诱导分化至定形内胚层细胞的试剂、分子或化合 物一一比如激活素 A-一的浓度还可以在iPS细胞培养中处于大约饱和浓度。激活素 A的饱 和浓度是大约5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、 45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、75ng/ml、80ng/ml、85ng/ml、90ng/ ml、95ng/ml、lOOng/ml、1lOng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、 200ng/ml、225ng/ml、250ng/ml、275ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml、 550ng/ml或更大。在另一个实施方式中，诱导分化至定形内胚层细胞的试剂、分子或化合 物一一比如激活素 A-一的浓度在iPS细胞培养中处于大约饱和浓度。
[0162] iPS细胞可以培养至少大约12小时、16小时、20小时、24小时、30小时、36小时、48小 时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或更久。在一个实施方式中，iPS细胞培养大约5天。在一 个实施方式中，iPS细胞培养大约5天。iPS细胞可以在存在激活素 A的情况下培养至少大约6 小时。iPS细胞可以培养至少大约12小时、16小时、20小时、24小时、30小时、36小时、48小时、 3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或更久。在另一个实施方式中，iPS细胞在存在激活素 A的情 况下培养至少大约5天。
[0163] 可以使用拟胚体(embroid body)方法或直接在饲养层或基质胶上发生iPS细胞至 定形内胚层期的分化。
[0164] 定形内胚层细胞
[0165] 自iPS细胞分化的DE细胞表达大量定形内胚层细胞标记。定形内胚层细胞标记的 实例包括但不限于c-kit、S0X17、F0XA2和CXCR4。
[0166] CD117或c-kit是在人中由KIT基因编码的蛋白质。示例性c-kit序列包括在 GenBank登录号NM_000222或NP_000213处发现的人c-kit序列或其片段，和在NM_001122733 或NP_001116205处发现的小鼠 c-kit序列或其片段。
[0167] CXCR4是对基质衍生因子-1特异性的α-趋化因子受体。示例性CXCR4序列包括在 GenBank登录号ΝΜ_001008540或ΝΜ_001008540处发现的人CXCR4序列或其片段，和在ΝΜ_ 009911或ΝΡ_034041处发现的小鼠 CXCR4序列或其片段。
[0168] 在一个实施方式中，自iPS细胞分化的DE细胞包括表达内胚层细胞表面标记(3_ 1^扒50父17、卩(^厶2和〇父〇?4。
[0169] 将iPS细胞分化为气道上皮细胞的方法还包括在存在血清的情况下培养DE细胞以 诱导分化为前前肠内胚层(AFE)细胞。在一个实施方式中，DE细胞在存在血清的情况下培 养。在另一个实施方式中，DE细胞在存在细胞外基质(ECM)分子的情况下培养。ECM分子的实 例包括但不限于胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、生腱蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚 糖、多糖、纤维素、在ECM中发现的其它分子、和其任意组合。
[0170] DE细胞可以在存在ECM分子的情况下培养之前解离。培养基还可以从DE细胞诱导 培养基改变为AFE细胞诱导培养基。在一个实施方式中，iPS细胞在存在血清的情况下培养。 [0171] DE细胞顺序地暴露于小分子抑制剂以抑制后内胚层命运并诱导近端内胚层命运。 DE细胞还可以在存在ECM分子的情况下培养，同时将DE细胞顺序地暴露于抑制BMP/TGF信号 传导的小分子抑制剂和抑制TGF/WNT信号传导的小分子抑制剂。抑制BMP/TGF信号传导的小 分子抑制剂可以包括但不限于 dorsomorphin、Noggin、A83-01、DMH-l、D4476、GW788388、 1^364947、1^口5(?、58431542、58505124、58525334、50208、和其任意组合。抑制了6?/^1'信号 传导的小分子抑制剂可以包括但不限于IWR-l、Noggin、CCT036477、IWP2、去甲氧基姜黄素、 FH535 A83-01、D4476、GW788388、LY364947、ItepSox、SB431542、SB505124、SB525334、SD208、 和其任意组合。在另一个实施方式中，DE细胞被顺序地暴露于小分子抑制剂以抑制后内胚 层命运并诱导近端内胚层命运。在具体的实施方式中，小分子抑制剂抑制BMP/TGF信号传 导，比如dorsomorphin、Noggin、A83-01、DMH-l、D4476、GW788388、LY364947、RepSox、 38431542、38505124、38525334、30208、和其任意组合。在另一个具体的实施方式中，小分子 抑制剂抑制TGF/WNT信号传导，比如IWR-l、Noggin、CCT036477、IWP2、去甲氧基姜黄素、 FH535 A83-01、D4476、GW788388、LY364947、ItepSox、SB431542、SB505124、SB525334、SD208、 和其任意组合。在另一个实施方式中，DE细胞首先暴露于抑制BMP/TGF信号传导的小分子抑 制剂，然后暴露于抑制TGF/WNT信号传导的小分子抑制剂。
[0172] DE细胞可以在存在抑制BMP/TGF信号传导的小分子抑制剂的情况下培养至少大约 6小时。DE细胞可以用抑制BMP/TGF信号传导的小分子抑制剂培养至少大约12小时、16小时、 20小时、24小时、30小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更久。在 一个实施方式中，DE细胞用抑制BMP/TGF信号传导的小分子抑制剂培养大约2天至大约10天 的范围。在一个实施方式中，DE细胞用抑制BMP/TGF信号传导的小分子抑制剂培养大约2天 至大约7天的范围。
[0173] DE细胞可以在存在抑制TGF/WNT信号传导的小分子抑制剂的情况下培养至少大约 6小时。DE细胞可以用抑制TGF/WNT信号传导的小分子抑制剂培养至少大约12小时、16小时、 20小时、24小时、30小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更久。在 一个实施方式中，DE细胞用抑制TGF/WNT信号传导的小分子抑制剂培养大约2天至大约10天 的范围。在一个实施方式中，DE细胞用抑制TGF/WNT信号传导的小分子抑制剂培养大约2天 至大约7天的范围。
[0174]前前肠内胚层细胞
[0175]自DE细胞分化的AFE细胞表达大量前前肠内胚层细胞标记。前前肠内胚层细胞标 记的实例包括但不限于NKX2.1。
[0176] NKX2.1是在人中由NKX2-1基因编码的蛋白质。示例性NKX2.1序列包括在GenBank 登录号NM_001079668或NP_001073136处发现的人NKX2.1序列或其片段，和在NM_001146198 或NP_001139670处发现的小鼠 NKX2.1序列或其片段。在一个实施方式中，AFE细胞表达 NKX2·1〇
[0177] 将iPS细胞分化为气道上皮细胞的方法还包括培养AFE细胞以诱导AFE细胞分化为 气道上皮细胞。在一个实施方式中，AFE细胞在存在血清的情况下培养。在另一个实施方式 中，AFE细胞在存在高浓度的视黄酸的情况下培养。在又另一个实施方式中，AFE细胞在存在 细胞因子混合物的情况下培养。在具体的实施方式中，细胞因子混合物抑制WNT途径。抑制 WNT途径的细胞因子的实例包括但不限于IWR-1、PD980 59、BMP4、BMP7、和其它WNT拮抗剂、和 其任意组合。
[0178] AFE细胞在存在高浓度的视黄酸的情况下培养以诱导分化。高浓度的视黄酸可以 在大约0. ΙμΜ至大约2.ΟμΜ的范围内。高浓度的视黄酸可以是大约0.1μΜ、0.2μΜ、0.3μΜ、0.4μ Μ、0·5μΜ、0·6μΜ、0·7μΜ、0·8μΜ、0·9、1·0μΜ、1·1μΜ、1·2μΜ、1·3μΜ、1·4μΜ、1·5μΜ、1·6μΜ、1·7μ M、1.8μΜ、1.9μΜ、2 . ΟμΜ、和其间的任何浓度。
[0179] AFE细胞可以在存在高浓度的视黄酸的情况下培养至少大约6小时。AFE细胞可以 在高浓度的视黄酸中培养至少大约12小时、16小时、20小时、24小时、30小时、36小时、48小 时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更久。在另一个实施方式中，AFE细胞在高浓度 的视黄酸中培养至少大约3天。在一个实施方式中，AFE细胞用高浓度的视黄酸培养大约2天 至大约10天的范围。在一个实施方式中，AFE细胞用高浓度的视黄酸培养大约2天至大约7天 的范围。
[0180] 肺组织工程化
[0181] 本发明还提供工程化三维肺组织和制造三维肺组织的方法。在一个方面，描述了 工程化三维肺组织。工程化肺包括气道上皮细胞。气道上皮细胞表达气道细胞表面标记，比 如克拉拉细胞分泌蛋白（CCSP)、细胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1;并且能够在培养中增殖而不 丧失气道细胞标记。因而，本发明提供供体肺组织的可替代来源以用工程化肺治疗末期疾 病。
[0182] 在另一个方面，描述了工程化三维肺组织的方法。方法包括将诱导多能干(iPS)细 胞群分化为气道上皮细胞，其中气道上皮细胞表达气道细胞表面标记:克拉拉细胞分泌蛋 白（CCSP)、细胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1;并且能够在培养中增殖而不丧失气道细胞标记。方 法还包括将气道上皮细胞接种至三维支架上，比如包含基质胶的支架。将气道上皮细胞接 种至三维支架上允许气道上皮细胞形成类器官结构。本领域中已知的支架对本发明是有用 的。支架可以包括但不限于去细胞组织、和合成的/天然的聚合物支架或合成的与天然的聚 合物支架的组合。在一个实施方式中，三维支架包括基质胶。支架生产的方法可以包括在美 国专利号：2013/0013083和2012/0064050中描述的那些，其通过引用以其全部并入。
[0183] 治疗方法
[0184] 源自iPS细胞的气道上皮细胞和包含这样的细胞的工程化肺组织具有在体内治疗 对象的用途。本发明包括用于治疗对象中的呼吸障碍的方法。如本文所述，在一个方面，方 法包括改善、治疗或减轻需要其的对象中的呼吸障碍的症状。方法还包括将诱导多能干 (iPS)细胞分化为气道上皮细胞，其中气道上皮细胞表达气道细胞表面标记--克拉拉细 胞分泌蛋白（CCSP)、细胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1，并且能够在培养中增殖而不丢失气道细 胞标记一一和以对治疗对象中的呼吸障碍有效的量施用气道上皮细胞。
[0185] 治疗对象的方法可以进一步包括施用源自iPS细胞的气道上皮细胞或移植包括源 自iPS细胞的气道上皮细胞的工程化组织，其中施用和移植导致对象中的呼吸障碍的症状 的改善、治疗或减轻。改善、治疗或减轻可以是可以使用自然意识或人造装置检测的呼吸障 碍或呼吸障碍的症状的任何改变。
[0186] 可以使用本发明的方法治疗的呼吸障碍是身体上显现在呼吸道中的疾病或病症， 其包括但不限于囊性纤维化、呼吸窘迫综合征、急性呼吸窘迫综合征、肺结核、咳嗽、支气管 哮喘、基于增加的气道高反应性的咳嗽(支气管炎、流感综合征、哮喘、阻塞性肺病等）、流感 综合征、止咳、气道高反应性、结核病、哮喘(气道炎性细胞浸润、增加的气道高应答性、支气 管收缩、粘液分泌过多等）、慢性阻塞性肺病、气肿、肺纤维化、特发性肺纤维化、咳嗽、可逆 性气道阻塞、成人呼吸疾病综合征、鸽"爱好者"病、农民肺、支气管肺发育异常、气道障碍、 气肿、变应性支气管肺曲霉病、过敏性支气管炎支气管扩张、职业性哮喘、反应性气道疾病 综合征、间质性肺病、寄生性肺病等。在一个实施方式中，呼吸障碍是囊性纤维化。
[0187] 有利地，本发明的组合物和方法表现出相对于现有技术方法的改进。优选地，用于 治疗呼吸障碍的组合物包括源自iPS细胞的气道上皮细胞，如本文别处描述的。
[0188] 本发明还包含使用本发明的药物制剂以实践本发明的方法。这样的药物制剂可以 以适合于施用至对象的形式提供，并且可以包含一种或多种药学上可接受的载体、一种或 多种额外的成分、或这些的一些组合。
[0189] 在本发明的方法中有用的药物制剂可以适当地被开发用于吸入、口服、肠胃外、肺 部、鼻内、静脉内施用或另外的施用途径。其它预期的制剂包括投射(projected)纳米颗粒、 脂质体制剂和基于免疫的制剂(immunologically-based formulation)。施用途径(一种或 多种)对本领域技术人员将是显而易见的，并且将取决于任意数目的因素，包括正在治疗的 疾病的类型和严重性、正在治疗的兽患者或人患者的类型和年龄等。
[0190] 本文描述的药物制剂可以通过药理学领域中已知的或今后开发的任何方法制备。 一般而言，这样的制备方法包括以下步骤:使细胞与载体或一种或多种其它助剂结合，然 后，如果必要或期望的话，将产物成形或包装为期望的单剂量单位或多剂量单位。
[0191] 在一个实施方式中，本发明的细胞使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体 配制。在一个实施方式中，本发明的细胞的药物制剂包括治疗有效量的本发明的细胞和药 学上可接受的载体。有用的药学上可接受的载体包括但不限于甘油、水、盐水、乙醇和其它 药学上可接受的盐溶液比如磷酸盐和有机酸盐。这些和其它药学上可接受的载体的实例在 Remington's Pharmaceutical Sciences( 1991,Mack Publication Co·，New Jersey)中描 述。
[0192] 施用/给药
[0193] 在临床环境中，细胞的递送系统可以通过任何大量方法引入患者，其中的每种在 本领域中是常见的。例如，细胞的药物制剂可以通过吸入或全身性例如通过静脉注射施用。
[0194] 在一个示例性实施中，细胞的药物制剂可以通过注射入肺组织直接地施用。美国 序列号10/914，829描述了直接注射的方案。
[0195] 施用方案可以影响什么构成了有效量。治疗制剂可以在显现与疾病或病症相关联 的症状之前或之后施用至患者。进一步，数个分开的剂量，以及交错的剂量可以每日施用或 顺序地施用，或该剂量可以被连续地输注，或可以是快速浓注。进一步，治疗制剂的剂量可 以成比例地增加或减少，如由治疗或预防状况的紧急度指示的。
[0196] 施用本发明的细胞至对象，优选地哺乳动物，更优选地人，可以使用已知的程序以 对治疗患者中的疾病或病症有效的剂量和时段实施。实现治疗效果所必需的细胞的有效量 可以根据以下因素变化：比如施用的细胞的植入程度;施用时间；施用持续时间；与细胞结 合使用的其它药物、化合物或物质；疾病或障碍的状态;正在治疗的对象的年龄、性别、重 量、状况、一般健康和先前病史;和在医疗领域中熟知的类似因素。可以调整给药方案以提 供最佳的治疗应答。例如，数个分开的剂量可以每日施用或该剂量可以成比例地减少，如由 治疗状况的紧急度指示的。本领域技术人员将能够研究相关的因素并关于细胞的有效量做 出决定，而不需要过度的实验。
[0197] 本发明的药物制剂中的细胞的实际剂量水平可以变化，以便获得对实现具体的对 象、组合物和施用模式的期望的治疗应答有效的细胞的量，而对患者是无毒的。
[0198] 施用途径
[0199] 本发明的细胞的施用途径包括吸入、口服、鼻部、直肠、肠胃外、舌下、经皮、经粘膜 (例如，舌下、舌部、（经）口、（经)尿道、阴道(例如，经阴道的和阴道周围的）、鼻（内）和(经） 直肠）、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌肉内、真皮内、动脉内、静脉内、支气 管内、吸入和局部施用。
[0200] 合适的细胞制剂和剂型包括，例如，分散体、悬浮液、溶液、珠剂(bead)、片剂、乳 剂、霜剂、糊剂、膏药、洗液、圆片(disc)、栓剂、用于鼻部或口服施用的液体喷雾、用于吸入 的雾化制剂、用于膀胱内施用的组合物和制剂等。
[0201] 应当理解，将用于本发明的制剂和组合物不限于在实施例中陈述的具体的制剂。 提出下列实施例以便向本领域技术人员提供完整的公开内容和如何制造和使用本发明的 细胞、分化方法、工程化组织和治疗方法的描述，并且不意欲限制本发明人所视为其发明的 范围。
[0202] 除非另外指示，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术）、微生物学、细胞生 物学、生物化学和免疫学的常规技术，其恰好在本领域技术人员的视界内。这样的技术在文 献中充分地说明，比如，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，第四版（Sambrook， 2012);"Oligonucleotide Synthesis"（Gait，1984);"Culture of Animal Cells" (Freshney，2010);"Methods in Enzymology""Handbook of Experimental Immunology" (Weir，1997);"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"（Miller和Calos，1987); "Short Protocols in Molecular Biology"（Ausubel，2002);"Polymerase Chain Reaction principles Applications and Troubleshooting"，（Babar，2011);"Current Protocols in Immunology"（Coligan，2002)。这些技术适用于生产本发明的多核苷酸和多 肽，并且因此，可以考虑制造和实践本发明。将在下列部分中讨论具体的实施方式的特别有 用的技术。 实施例
[0203] 通过参考下列实验实施例进一步详细地描述本发明。除非另外规定，这些实施例 仅出于说明的目的提供，并且不意欲是限制性的。因而，本发明绝不应当解释为限制于下列 实施例，而是应当解释为包含由于本文提供的教导变得明显的任何和全部变化。
[0204]不需要进一步的描述，认为本领域技术人员可以使用在前的描述和下列说明性实 施例，制造和利用本发明的化合物并且实践要求保护的方法。因此，下列操作实施例具体地 指出本发明的实施方式，并且不以任何方式解释为限制性的。
[0205] 现在描述在进行本文公开的实验中使用的材料和方法。
[0206] 人iPS细胞的培养
[0207] 用于本研究的人iPS细胞系--使用慢病毒重编程的iPS细胞（克隆C2)--由 Madison，WI的威斯康星大学解剖学系的James A Thomson教授提供。克隆C2通过向分离的 人皮肤成纤维细胞慢病毒转导〇〇'-4、5(^2、似11叩和111128基因而生成。0?-1?5细胞由 Darrell N Kotton教授提供，并且由从囊性纤维化患者皮肤样品分离的真皮成纤维细胞生 成。CF-iPS细胞由单个慢病毒载体非转基因地生成。这些诱导多能人干细胞已经在Thomson 和Kotton实验室中被表征。它们具有正常的核型、表达端粒酶活性、表达表征人ES细胞的细 胞表面标记和基因、和维持分化为全部三种原胚层的高级衍生物的发育潜能。这两种iPS细 胞系展示了无法区分于hESC比如H9的形态，并且可以无期限地维持在小鼠胚胎成纤维细胞 饲养物(feeder)或基质胶上。如由Thomson实验室先前所述的，培养和维持两种人iPS细胞。 简略地，iPS细胞在37°C，5 %C02和90-95 %湿度下在补充有4ng/ml bFGF、ImM谷氨酰胺、1 % mM非必需氨基酸和0.1 mM β-巯基乙醇的DMEM-F12培养基和20 %的敲除血清替代品中在辐 射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上增殖，每天更换培养基。使用干细胞切割工具 (Stem Cell Cutting Tool) (VWR)通过机械解离每4-5天将未分化的iPS细胞传代至新鲜的 饲养物上。
[0208] iPS细胞体外分化至气道上皮细胞
[0209] iPS细胞首先朝向定形内胚层(DE)分化。DE细胞在先前描述的条件下开始。简略 地，iPS细胞在补充有100ng/ml激活素 A、2mM L-谷氨酰胺和1%抗生素-抗真菌剂的RPMI 1640培养基中培养48小时。然后，将1 X B27补充物和0.5mM丁酸钠加入相同的培养基，并且 iPS细胞在此培养基中培养3天，每天更换培养基。
[0210]随后，DE细胞被胰蛋白酶消化，并且重新平板接种在人ECM蛋白涂布的平板上，并 且通过在第5至第7天之间将其顺序地暴露于具有10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、ImM非必需氨 基酸、1%抗生素-抗真菌剂的MDM中的小分子抑制剂的组合而分化至前前肠内胚层(AFE)。 参见图1。
[0211] 然后，AFE细胞在由頂DM与20%FBS、2mM L-谷氨酰胺、ImM非必需氨基酸、1%抗生 素-抗真菌剂、视黄酸(0 · 5μΜ)、bFGF( 10ng/ml)、BMP4( 10ng/ml)、Wnt3a( 100ng/ml)和KGF(每 种lOng/ml)组成的肺内胚层分化培养基中维持5天。生长因子组合然后转换为BMP7(10ng/ ml)、KGF( 10ng/ml)、高浓度的视黄酸（ΙμΜ)、RA-补充的B27、IWR-1 (ΙΟΟηΜ) (WNT拮抗剂）、 PD98059(lyM)(MAPK 拮抗剂)持续 3天。
[0212]第 16天开始，细胞在补充有IWR-1 (50nM)、高RA(lyM)、BMP7(10ng/ml)、KGF(10ng/ ml)、EGF(10ng/ml)、地塞米松（50nM)、丁酰cAMP(O.lmM)和异丁基甲基黄嘌呤(O.lmM)的相 同的基础培养基中持续12天进一步分化至气道上皮细胞。作为替代选择，DE细胞使用上面 提及的相同的培养基直接地分化，而不进行分裂。在第28天，使用胰蛋白酶分裂细胞，并且 在BEGM?支气管上皮细胞生长培养基--来自Lonza--中重新接种在胶原蛋白I/III包被 的平板上直至使用。
[0213] 实时定量RT-PCR
[0214] 根据制造商的说明，使用来自Qiagene的RNeasy迷你试剂盒从iPS细胞和iPS细胞 源气道上皮细胞提取总RNA。根据制造商的方案（Invitrogen)，使用Superscript第一链合 成系统以随机的六聚体作为引物合成第一链互补DNA(cDNA)。相等体积的产物混合物被用 作PCR扩增的模板。用iQ? SYBR Green Supermix(Bio-Rad)和使用iCyler和iQ软件（Bio-Rad)显示的200nM每种正向和反向引物在25μ1体积中进行反应。每个样品运行一式三份。 PCR条件包括95°C 4min的预变性步骤，接着进行由95°C 15s，60°C 30s和72°C 30s组成的 40个循环的PCR。对于感兴趣的基因(G0I)，来自一式三份的PCR反应的平均阈值循环(Ct)值 针对于来自相同的cDNA样品的GATOH的平均Ct值标准化。G0I转录物水平在样品A和样品B之 间的倍数变化等于2- ΔΔα，其中 Δ Ct = Ct(G〇i)-Ct(GAPDH)，和 Δ Δ ct= Δ ct⑷-Δ ct⑶。
[0215] 流式细胞术和免疫化学分析
[0216] 在分化前和在诱导DE与AFE和朝向气道上皮分化期间，在不同的时间点通过免疫 化学和/或流式细胞术分析细胞。iPS细胞和分化细胞在PBS中的4 %多聚甲醛中固定20min， 在室温(RT)下用roS中的0.1%Triton X-100透化15min，在RT下在roS中的3%BSA中封闭 60min，并且然后在4°C下在一次抗体中培育过夜，在RT下在二次抗体中培育2h。
[0217] 对于流式细胞术，如制造商所述的，用来自固定/透化试剂盒(BD Bioscience)的 固定溶液固定细胞，并且用一次和检测抗体染色。简略地，通过用0.25%胰蛋白酶培育 2min，细胞解离为单细胞悬浮液。将解离的细胞重悬(0.5X10 6个细胞)在250μ1的固定/透 化溶液中，在冰上保持20min，并且用Perm/Wash缓冲液洗涤两次。在用封闭溶液在冰上封闭 30min后，用封闭溶液中相应的一次抗体在冰上培育细胞30min。在用相应的缀合二次抗体 在冰上培育30min后，细胞重悬在350μ1的Perm/Wash缓冲液中，洗涤两次，并且通过流式细 胞术进行分析。
[0218]统计分析
[0219] 用软件Origin (Or iginLab，Northampton，MA)完成全部统计分析。数据表示为平均 值土s.e.m.(测量的标准误差）。进行T检验以评估两组是否彼此显著地不同。小于0.05的p 值(双侧)被认为统计上显著的。全部误差棒代表土 SEM。
[0220]类器官形成
[0221] 第 15 天的气道祖细胞在补充有高 RA(lyM)、BMP7(10ng/ml)、KGF(10ng/ml)、EGF (10ng/ml)、地塞米松(50nM)、丁酰cAMP(O.lmM)和异丁基甲基黄嘌呤(O.lmM)的頂DM培养基 中一一气道上皮细胞在其中分化一一在气-液相条件中的基质胶中培养30天。如制造商所 述的，细胞用来自固定/透化试剂盒(BD Bioscience)的固定溶液固定，并且用气道上皮细 胞的一次抗体、P63和NKX2.1以及检测抗体染色。
[0222] 现在描述在本文公开的实验的结果。
[0223] 肺具有复杂的三维结构，其以沿着其近端-远端轴的上皮组成中的主要差异为特 征。腔上皮(气管和主支气管)主要由纤毛细胞、神经内分泌(NE)细胞和克拉拉样细胞组成。 后者产生分泌珠蛋白（secretoglobins)--CCSP。在更远端气道(小支气管和细支气管） 中，克拉拉细胞比纤毛细胞占优势，并且比在气管中存在更多的NE细胞。肺的最远端区域组 成肺泡的复杂系统，肺泡由两种主要的上皮细胞类型组成：1型(ATI)和II型(ΑΤΠ )上皮细 胞。ATI衬在肺中的大多数肺泡内（覆盖多至95%的肺泡表面积)并且主要地负责气体交换， 而ΑΤΠ 细胞分泌肺泡表面活性物并且主要地是立方形的形状。先前已经描述了从人iPS细 胞生成定形内胚层(DE)、前前肠内胚层(AFE)和随后的相对均一的人肺泡II型细胞群的分 步分化方法(Ghaedi等，JCI 2012)。在本文描述的操作中，采用了模拟引导气道上皮发育的 信号传导途径的时序和协调的分步分化方法。使用独特的策略，高效地从人多能干细胞生 成了功能性气道上皮细胞。
[0224] 将人iPS细胞诱导为前前肠内胚层和肺内胚层细胞。胚胎呼吸系统一一气管的远 端一一起源于在小鼠的胚胎期9.5天或人的胚胎期4周时分化为许多种类的特化的上皮细 胞的定形内胚层(DE)的前腹面上的肺芽。
[0225] 使用无血清条件将人iPS细胞分化至DE细胞（图1)。通过将iPS细胞暴露于饱和浓 度的激活素 A，生成了大于85%的内胚层细胞。流式细胞检测分析显示源自iPS细胞的细胞 群在第5天表达高百分比的与此胚层相关联的标记。89%的细胞是c-kit阳性的（图2A)， 91%是3(^17阳性的（图2〇,93%是?(^2阳性的（图28)，并且88%的细胞在克隆(：1中表达 内胚层表面标记CXCR4 (图2D)。
[0226]虽然以此方式得到的定形内胚层细胞已经假定是宽广地多能的，但是数个研究已 经显示最前的前肠内胚层谱系，比如胸腺、甲状腺和肺上皮，难以衍生自这些先祖。定向分 化至肺泡上皮应当通过生成定形内胚层(DE)，接着图式发育(patterning)为前前肠内胚层 (AFE)进行。
[0227] 因此，在第二步中，DE细胞进一步分化至AFEJE细胞被解离，重新平板接种在人 ECM包被的平板上，并且在AFE分化培养基中培养2天。ECM蛋白的选择源自先前的研究，其显 示在包含细胞外蛋白基质的混合物(胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、生腱蛋白、弹性蛋白 和大量的蛋白聚糖与糖胺聚糖）的人ECM蛋白表面上培养的DE细胞与在其它ECM蛋白上培养 的DE细胞相比更快地贴附，并且导致更高数目的NKX2. Γ。
[0228] 小鼠与人ES和iPS上的实验已经清楚地证明，在iPS细胞源定形内胚层中双重抑制 激活素 A/nodal和TGF-β/ΒΜΡ信号传导对于定量地生成前前肠内胚层是必需的。在先前的尝 试中，应用Noggin(BMP信号传导的抑制剂）和SB141524(TGF-i3信号传导抑制剂）至DE细胞2 天抑制了后内胚层命运(CDX2+)，支持前内胚层命运(S0X2+)，并且生成强烈表达与AFE表型 相关联的标记的富集的细胞群。
[0229] 为了增加 NKX2.1+F0XA2+祖细胞的数目，对先前的方法做出修改以从DE细胞产生 AFE。Sneock和同事已经显示，连续抑制BMP/TGF，接着TGF和Wnt信号传导途径抑制给予从DE 细胞更好的AFE分化（Huang SX等，Nat Biotechnol.，2013年12月1 日.doi:10.1038/ nbt. 2754)。为了促进AFE同一性，DE细胞然后在第6天至第8天之间顺序地暴露于BMP4/TGF0 和Wnt激动剂与拮抗剂的不同的组合，如表1中列举的。检验增加 NKX2.1 +、F0XA2+S0X2+和 NKX2.1+F0XA2+组细胞数目的能力。表1中列举的激动剂和拮抗剂在AFE分化期间对F0XA2/ S0X2和NKX2.1表达的作用分别显示在图3A和3B中。
[0230] 表1:在第6天至第8天之间顺序地添加的BMP4/TGFi3和Wnt激动剂与拮抗剂的列表。
[0231]
[0232] 先前的研究显示，FGF、BMP4家族成员、KGF和WNT3a提供在胚胎发生期间图式发育 为肺内胚层的信号。BMP4信号传导对肺特化是必需的，并且bFGF和WNT浓度的增加增加了 NKX2. Γ未成熟的肺先祖。为了规定肺细胞命运，在第7天后，培养基转换为包含bFGF(10ng/ ml)、BMP4( 10ng/ml)、Wnt3a( 100ng/ml)和KGF( 10ng/ml)的肺内胚层分化培养基持续5天。在 第7天时比较不同条件之间的FOXA2+SOX2+前内胚层细胞的数目。通过流式细胞术量化总 FOXA2+内胚层细胞中FOXA2+SOX2+前内胚层细胞的双阳性细胞的数目。结果指示，阻断DE细 胞中的BMP4/TGFB和Wnt信号传导与单独的培养基相比增加了 FOXA2+SOX2+前内胚层细胞的 数目。与其它抑制剂的组合相比，当细胞顺序地暴露于dorsomorphin/SB431542(BMP/TGF0 的抑制剂)和IWP2/SB431542(WNT/TGF-f3的抑制剂）的组合时，发现此增加更显著（图3A)。
[0233] ΝΚΧ2.Γ是区分未来的肺与前肠内胚层的其它衍生物的最早的细胞标记。测试顺 序地暴露于BMP/TGFf3和WNT/TGF-β以确定其是否致使iPS细胞-DE细胞更能够分化为NKX2.1 +内胚层细胞。NKX2. Γ细胞的百分比被量化为存在的总细胞的百分比。与其它抑制剂的组合 相比，当DE细胞暴露于dorsomorphin/SB431542(BMP/TGF0的抑制剂）和IWP2/SB431542 (Wnt/TGF-邱勺抑制剂）的组合时，NKX2. Γ细胞的数目更多（图3B)。
[0234] 参见图4和下面的表2,进一步操作方案以在第15天时导致NKX2.1+F0XA2+细胞的增 加，与暴露于N0GGIN/SB的DE细胞中的50%相比其是72.1%，小于1%没有前部化（图5)。用 F0XA2共染色的全部离体分化的NKX2. Γ细胞(图6A-6D)表明体外分化的NKX2. Γ细胞代表肺 内胚层细胞。连续的激活素 A治疗导致罕见的F0XA2+S0X2+细胞和极少的ΝΚΧ2.Γ细胞（图3A 和3B)，这表明激活素 A暴露的最佳持续时间是重要的。在培养中没有检测到PAX8+(甲状腺 标记)和TUJ1(神经元标记)细胞(数据未显示）。全部这些结果与以下发现一致:在连续地阻 断DE细胞中的BMP4/TGFB和WNT信号传导后，FGF、BMP4和WNT信号传导的组合促进肺特异性 NKX2. Γ祖细胞从前内胚层的谱系特化。
[0235] 表2:在第5天至第15天之间顺序地添加的BMP4/TGFi3和Wnt激动剂与拮抗剂的列 表。
[0236]
[0237] 通过免疫荧光染色或PCR，没有在蛋白质水平上检测到任何类型的成熟肺气道上 皮细胞的标记，比如粘蛋白1、粘蛋白5AC(杯状细胞）、F0XJ1 (纤毛细胞）和CCSP(克拉拉细 胞）（数据未显示）。
[0238] 朝向肺气道祖细胞分化肺内胚层细胞。早期肺内胚层(NKX2.1+/F0XA2+)是多能的， 并且其命运取决于由局部微环境(主要是中胚层)提供的信号或控制区域(近端对远端)细 胞命运的信号。气道上皮的特化发生在胚肺的柄中，而尖部中的肺泡先祖分化至远端细 胞--ΑΤΠ 和ATI细胞。柄区域中的NKX2.1+S0X2+细胞是生成成熟气道上皮的气道祖细胞。 相比之下，远端胚胎肺芽尖表达S0X9和F0XP2,并且能产生气道和肺泡的全部细胞类型。
[0239] BMP4在远端表达，而BMP7更靠近气道表达。远端的bFGF和FGF10被近端的KGF (FGF7)替换，而WNT信号传导在近端柄先祖中被抑制并且存在于远端尖部中。S0X2是支气管 谱系特化的关键调节物，其由典范的WNT信号传导负调节。抑制WNT和MAPKK/ERK信号传导途 径增加来自AFE细胞的NKX2.1+S0X2+细胞比例。视黄酸(RA)是肺芽发育的重要因子，而且近 端柄区域中的RA浓度比远端尖部区域处的相对更高。高RA信号传导阻止远端肺发育并且有 助于近端气道发育。
[0240] 为了将NKX2. Γ肺先祖转变为NKX2.1+S0X2+近端祖细胞，调节BMP和WNT途径以控制 气道树的近端至远端图式发育。在第12天，为了增强近端气道命运，将生长因子组合转换为 包含BMP7(10ng/ml)、KGF(10ng/ml)、高浓度的视黄酸（ΙμΜ)、IWR-1 (lOOnM) (WNT拮抗剂）、 PD98059(lyM)(MAPK拮抗剂）的近端诱导培养基持续3天。在3天后，观察到IWR-1、PD98059、 BMP7和高RA浓度抑制WNT途径。与治疗前大约1-2%相比，NKX2.1+/S0X2+气道祖细胞接近大 约 30%。（图7A-7D和8)。
[0241 ]为了进一步促进气道分化，将第15天时的祖细胞在补充有IWR-1 (lOOnM)、RA( 1μ M)、BMP4( 10ng/ml)、BMP7( 10ng/ml)、KGF( 10ng/ml)、EGF( 10ng/ml)的相同的基础培养基中 培养12天。参见图9。定量RT-PCR揭示了成熟肺气道上皮细胞标记比如F0XJ1 (纤毛细胞）（图 10A)、KRT5(基底细胞）（图 10B)、CFTR(图 10C)、CCSP 或 SCGB1A1 (克拉拉细胞）（图 10D)、P63 (图10E)、粘蛋白5AC(杯状细胞）（图10G)的相对适度的增加，并且当与S0X2表达（图10F)相 比时，其在分化的第20天时在源自iPS细胞的细胞中高度地表达。还参见表3。
[0242] 表3:添加至基础培养基以促进气道分化的激动剂和拮抗剂的列表。
[0243]
[0244]
[0245] 第27天时，流式细胞术揭示了上述生长因子和抑制剂组合诱导了气道上皮分化， 此时76%的细胞是气道细胞标记S0X2阳性的（图11和12DKS0X2阳性细胞的百分比在第35 天时从72%增加至92%。基底和分泌/纤毛细胞是大和小气道区室中的两种主要的上皮细 胞谱系。基底细胞(BC)是衬在人肺的传导气道内的假复层上皮并且先前显示为生成其它近 端气道谱系。BC的一个特性是转录因子转化相关蛋白63(P63)和细胞骨架蛋白一一细胞角 蛋白5和14(分别是KRT5和KRT14)--的高水平表达。当在气-液界面处或气管球 (tracheosphere)体外试验中培养时，这些细胞在人气道中增殖并生成纤毛和分泌细胞(克 拉拉细胞）。
[0246] 在分化的第27天，64%的细胞是KRT5阳性的（图12F)且超过60%的细胞是P63+(图 12H)，这表明绝大多数的细胞潜在地是基底细胞先祖。76%的细胞表达克拉拉细胞分泌蛋 白（CCSP)(图12E)。克拉拉样细胞是贯穿近端至远端轴的上皮分泌细胞，并且早就已经被认 为充当气道的祖细胞。囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)是ABC转运体类别的离子通道， 其输送氯离子和硫氰酸根离子穿过上皮细胞膜。大多数的气道上皮细胞，以及神经上皮细 胞表达CFTR蛋白。流式细胞术分析揭示了在第27天时36%的细胞是CFTR阳性的（图12B)。多 至65 %和58%的细胞分别是纤毛细胞标记F0XJ1 (图12A)和β-微管蛋白IV(图12C)阳性的， 这表明在培养中至少三分之一的细胞具有有纤毛的CFTR-表达气道表型（图12Β)。仅8%的 细胞表达粘蛋白 _5AC 杯状细胞标记（图12G)。
[0247] 第27天时的qPCR指示转换为气道分化培养基导致进一步上调气道基因 KRT5(图 13F)、P63、F0XJ1 (图138)、50乂17、]\^：5六(：（图130)和0?丁1?(图13六），同时存在较低水平的粘蛋 白5AC、SCGB1A1(CCSP)(图13C)。在此阶段未检测到其它内胚层谱系标记，比如AFP(肝）、 PDX1、TG (甲状腺）和PAX9 (咽）。
[0248] ECM蛋白在肺中具有非常特异的分布和装配模式。气道上皮分化的复杂过程还涉 及细胞-基质和细胞-细胞相互作用。与其它ECM蛋白相比，人气管和气道主要由胶原蛋白I 和III组成。因此，第28天开始，细胞被转移至胶原蛋白I/III包被的平板上BEGM?支气管上 皮细胞生长培养基--来自Lonza--中持续另外7天。使用修改的人肺泡分化的条件，在 第35天，AFE细胞被高效地成功转变为气道上皮祖细胞。
[0249] 第35天时，分化细胞是气道上皮细胞标记CFTR(图15E)、CCSP(图15D)、粘蛋白5AC (图15C)、F0XJ1 (图15B)和PanKRT(图15F)阳性染色的。如在第35天时通过流式细胞术确定 的，100%的细胞是气道细胞标记S0X2阳性的（图16H)，并且多至97.5%的细胞是P63阳性的 (图16D)。多至100 %的细胞表达CCSP (克拉拉细胞）（图16F)、β-微管蛋白IV (图16C)和FOXJ1 (纤毛细胞）（图16B)。62 %和24%的细胞分别是CFTR(图16E)和粘蛋白5AC(图16A)阳性的。 [0250] 在第35天结束时，绝大多数的--92.2%的--细胞是KRT5或CK5阳性的，同时它 们表达展示纤毛表型和分泌表型的F0XJ1和CCSP。这证明了 iPS细胞源气道细胞在此阶段仍 具有多能潜能。当它们正在经历分化至其它近端细胞比如克拉拉细胞和纤毛细胞时，气道 祖细胞或基底细胞维持基底细胞标记KRT5和P63的表达是可能的。Gomperts等在类器官试 验中证明克拉拉细胞表达F0XJ1，具有纤毛表型，以及包含表达Muc5AC、CCSP和角蛋白5的细 胞。
[0251]第35天时的定量RT-PCR揭示了CK5或KRT5(图 17A)、SCGB1A1 (CCSP)(图 17E)、CFTR (图17B)、P63(图17D)、F0XJ1 (图17F)和粘蛋白-5AC(图17G)在iPS源气道上皮细胞中高度表 达，而且表达水平比得上新鲜分离的人气道细胞。在未分化的iPS、DE、AFE细胞中检测不到 这些基因。
[0252] 然后，检验类似的分步分化方法以从CF疾病特异性人iPS细胞生成肺气道先祖(图 18)。有趣地，CF-iPS细胞克隆产生类似的结果并且对朝向DE、AFE、气道上皮细胞分化具有 类似的功效，这表明此方案可以被推广至来自其它来源的其它iPS细胞系（图19A-19D显示 了细胞染色，图20A-20H显示了流式细胞检测分析，和图21A-21H显示了定量RT-PCR结果）。
[0253] 免疫染色分析还显示源自iPSC的气道组细胞群能够在基质胶中发育为肺类器官 结构。该结构是气道标记--P63 (图22A)和NKX2.1 (图22B)--阳性的。
[0254] 研发用于植入人体的功能性肺泡组织的离体装配的先进技术是组织工程师所面 对的挑战性任务中的一个。将ESC和iPS细胞分化至肺上皮细胞或前体的最近研究已经表明 使用干细胞源上皮细胞用于肺工程化的有希望的治疗策略。
[0255] 在本研究中，研发了用于将iPS细胞定向分化至功能性传导气道上皮细胞的高效 的方法，所述功能性传导气道上皮细胞可以用于去细胞肺支架的再细胞化，并且其最终可 以提供用于肺移植的自体移植物。显著地，这种定向分化的方法广泛地适用于数种多能细 胞系(人iPS细胞克隆C1--重编程自胎儿肺成纤维细胞，和CF-iPS细胞--重编程自真皮 成纤维细胞）。两种iPS细胞克隆产生类似的结果，并且对朝向DE、AFE和不同类型的气道细 胞分化具有类似的功效，这表明此方案可以被推广至来自其它来源的其它iPS细胞系。iPS 细胞分化至肺泡上皮的大多数努力集中于生成II型上皮细胞，而极少研究针对气道上皮的 分化。在全部发布的报道中，功效很低并且气道标记的表达似乎是随机的。在低效地分化 ESC和iPS细胞的非均一的培养中，存在在群体内留下未分化的多能干细胞的风险，其可以 在移植后携带畸胎瘤形成的显著风险。无论何种干细胞类型用于分化，在肺工程化中特别 是在生成大数量的分化良好的细胞中仍存在挑战。在先前的报道中，来自iPS细胞的分化的 气道细胞已经难以扩增。然而，与分离的气道细胞不同，在本研究中的iPS细胞源气道细胞 能够增殖数代而不丧失气道上皮细胞相关标记，比如〇^?、？63、？(^11、0?了1?和粘蛋白-5八(：， 并且可以用于生成数千万的细胞，其可以接种至无细胞的基质支架。当使用自体iPS细胞源 细胞转换这些技术用于产生组织工程化人肺组织时，"放大"先祖群体的能力将是特别有价 值的。
[0256] 而且，提供允许治疗遭受遗传和变性障碍的患者的限定的可移植的细胞的供应是 人细胞疗法的主要目标。在某些肺病中，比如囊性纤维化，移植从人肺分离的成人肺干细胞 和祖细胞或肺泡细胞正在形成为恢复患者中的正常肺功能的新型治疗方法。然而，此方法 受限于人肺泡细胞的缺乏，更重要地，缺乏在损伤的肺中体内移植这样的细胞。
[0257] 源自iPS细胞的气道上皮细胞或肺上皮前体提供有希望的治疗策略，其使用基于 干细胞的吸入疗法以在患者中替换天然肺上皮细胞并重构健康的肺上皮。
[0258] 而且，新药物的研发是昂贵的且资源密集型的。iPS源气道上皮细胞潜在地对药物 研发非常有价值，其从早期靶标研究和安全评定以及筛选模型中用作工具跨度至发现新化 学实体。iPS源气道上皮细胞可以用于对肺组织病理学测试药物。此外，iPS源气道上皮细胞 可以用于检验治疗剂的具体的递送运载体对肺组织病理学的作用，例如，与经由不同的递 送系统施用的相同药剂的作用相比，或简单地评价递送运载体自身（例如病毒载体对非病 毒载体)是否能够影响肺病理学。
[0259]使用在饲养层或基质胶上将iPS细胞定向分化至定形内胚层期取代胚状体方法。 当与EB方法相比时，朝向DE定向分化产生高纯度的群体。这主要是因为在胚状体中，甚至在 存在激活素 A的情况下，从两种其它的胚胎胚层一一中胚层和外胚层一一留下细胞。
[0260]为了诱导定形内胚层，iPS细胞在补充有100ng/ml激活素 A的无血清RPMI 1640培 养基中培养48小时。然后，1 X B27补充物、0.5mM丁酸钠被添加入相同的培养基，并且iPS细 胞在此培养基中培养另外3天。在先前建立的公布的方案中，细胞在包含激活素 A的培养基 中培养4天而不是5天。1 X B27补充物提供了低血清条件。这些细胞还显示了在存在丁酸钠 的情况下的均匀的形态。
[0261] 在其它方案中，研究者已经主要地使用无血清培养基或限定的培养基。相比之下， 本文描述的修改的方案导致IPS源细胞群在第5天时表达高百分比的与此胚层相关联的标 记。该细胞群中89 %的细胞是c-kit阳性的，91 %是S0X17阳性的，93 %是F0XA2阳性的，并且 88 %的细胞在克隆C1中表达内胚层表面标记CXCR4。
[0262] 为了将定形内胚层分化至前前肠内胚层，DE细胞在包含5%FBS和Dorsomorphin/ SB141524的頂DM中培养。其它方案使用其它基础培养基代替頂DM，并且其它的使用无血清 培养基或限定的培养基。
[0263] 为了控制从前前肠内胚层至传导气道细胞的分化，生长因子和细胞外蛋白基质是 焦点。在本文描述的分化方法中，选择具有10%FBS的頂DM中的EGF、KGF和BMP7、BMP4、IWR-1 (WNT3a抑制剂)和高视黄酸。此分化混合物还没有在先前的报道中使用。
[0264] 本文描述的方法模拟胚胎发生期间的肺发育，其使用存在于肺中的细胞外基质蛋 白（这些包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、生腱蛋白、弹性蛋白、和大量的蛋白聚糖与 糖胺聚糖）以及在肺发育和再生中发挥主要作用的生长因子的组合。iPS细胞首先朝向定形 内胚层(DE)分化，并且然后在ECM包被的表面上培养。本文描述的分化方法的发现首先使用 ECM包被的表面用于气道上皮细胞分化，连同人iPS细胞中的生长因子用于组织特异性分 化。
[0265] 气道上皮分化的复杂过程还涉及细胞-基质和细胞-细胞相互作用。人气管和气道 主要由胶原蛋白I和III组成。因此，第28天开始，细胞被转移至胶原蛋白I/III包被的平板 上BEGM?支气管上皮细胞生长培养基一一来自Lonza-一中持续另外5天。此研究是首先使 用胶原蛋白I/III混合包被的表面用于自iPS细胞的气道上皮分化中的一种。
[0266] 意外地发现人多能干细胞可以高效地体外定向分化为传导气道上皮。使用本文描 述的方法用于人气道分化，在第35天，AFE细胞高效地成功转变为气道上皮祖细胞。如在第 35天通过流式细胞术确定的，大约100%的细胞是气道细胞标记S0X2阳性的，并且多至大约 97.5%的细胞是P63阳性的。此外，多至大约100%的细胞表达CCSP(克拉拉细胞）、β-微管蛋 白IV和F0XJ1 (纤毛细胞）。大约62%和24%的细胞分别是CFTR和粘蛋白5AC阳性的。
[0267] 在第35天结束时，绝大多数的--大约92.2%的--细胞是KRT5阳性的，同时它 们表达显示纤毛和分泌表型的F0XJ1和CCSP。定量RT-PCR还揭示了 CK5、SCGBlal(CCSP)、 〇?丁1?、？63、？(^11和粘蛋白-54(：在丨？3源气道上皮细胞中高度地表达，而且相对水平比得上 新鲜分离的人气道细胞。
[0268] 与分离的气道细胞不同，本文描述的iPS细胞源气道细胞能够增殖数代而不丧失 气道上皮细胞相关标记，比如CCSP、P63、F0XJ1、CFTR和粘蛋白-5AC。这使得可能生成数千万 细胞用于进一步的目的，比如接种无细胞的基质支架用于制造工程化肺组织。
[0269] 其它实施方式
[0270] 在本文的变量的任何限定中叙述一列要素包括将该变量限定为任何单一要素或 所列要素的组合(或子组合）。在本文叙述的实施方式包括作为任何单一实施方式或与任何 其它实施方式或其部分组合的实施方式。
[0271] 本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用以其全部并 入本文。虽然已经参考具体的实施方式公开了本发明，但是明显地，本领域技术人员可以设 计本发明的其它实施方式和变型，而不背离本发明的真实精神和范围。附带的权利要求意 欲解释为包括全部这样的实施方式和等价变型。
【主权项】
1. 源自诱导多能干(iPS)细胞的气道上皮细胞，其特征在于： 表达气道细胞表面标记，其中所述气道细胞表面标记包括克拉拉细胞分泌蛋白 (CCSP)、细胞角蛋白5 (KRT5)和FOXJ1;和 在培养中增殖而不丧失所述气道细胞表面标记的能力。2. 权利要求1所述的气道上皮细胞，其中所述气道上皮细胞是有纤毛的。3. 权利要求1所述的气道上皮细胞，进一步包括表达囊性纤维化跨膜传导调节蛋白 (CFTR)04. 权利要求1所述的气道上皮细胞，进一步包括表达β_微管蛋白IV、粘蛋白-5AC和P63 中的至少一种。5. 权利要求1所述的气道上皮细胞，其中所述气道细胞表面标记以比得上在新鲜分离 的人气道细胞上表达的水平表达。6. 权利要求1所述的气道上皮细胞，其中所述气道上皮细胞源自囊性纤维化人iPS细 胞。7. 权利要求1所述的气道上皮细胞，其中所述气道上皮细胞能够在培养中增殖至少大 约30天。8. 权利要求7所述的气道上皮细胞，其中所述气道上皮细胞能够在培养中增殖大于大 约30天。9. 将诱导多能干(iPS)细胞分化为气道上皮细胞的方法，包括： 在缺少血清的情况下培养所述iPS细胞以诱导分化为定形内胚层(DE)细胞； 在存在血清的情况下培养所述DE细胞以诱导分化为前前肠内胚层(AFE)细胞;并且 在存在血清、细胞因子混合物和高浓度的视黄酸的情况下培养所述AFE细胞以诱导所 述AFE细胞分化为所述气道上皮细胞。10. 权利要求9所述的方法，其中培养所述iPS细胞的步骤包括在存在激活素 A的情况下 培养所述iPS细胞以诱导分化至所述DE细胞。11. 权利要求10所述的方法，其中所述激活素 A在所述iPS细胞培养中处于大约饱和浓 度。12. 权利要求9所述的方法，其中培养所述iPS细胞的步骤包括在存在无血清补充物的 情况下培养所述iPS细胞。13. 权利要求9所述的方法，其中所述DE细胞表达选自c-k i t、SOX 17、F0XA2和CXCR4的一 种或多种定形内胚层细胞标记。14. 权利要求9所述的方法，其中培养所述DE细胞的步骤包括在存在细胞外基质(ECM) 分子的情况下培养所述DE细胞。15. 权利要求14所述的方法，其中在存在ECM分子的情况下培养的步骤包括在用ECM分 子培养之前使所述DE细胞解离。16. 权利要求14所述的方法，其中所述ECM分子包括胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、 生腱蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖中的一种或多种。17. 权利要求9所述的方法，其中培养所述DE细胞的步骤包括将所述DE细胞顺序地暴露 于小分子抑制剂以抑制后内胚层命运和诱导近端内胚层命运。18. 权利要求17所述的方法，其中所述小分子抑制剂抑制BMP/TGF信号传导。19. 权利要求18所述的方法，其中所述小分子抑制剂选自(1〇^〇1]1〇印11；[11、1'1〇88；[11、483- 01、01^-1、04476、6￥788388、1^364947、1?印5(?、58431542、58505124、58525334和50208。20. 权利要求17所述的方法，其中所述小分子抑制剂抑制TGF/WNT信号传导。21. 权利要求20所述的方法，其中所述小分子抑制剂选自IWR-l，Noggin、CCT036477、 IWP2、去甲氧基姜黄素、FH535A83-01、D4476、GW788388、LY364947、RepSox、SB431542、 SB505124、SB525334和SD208。22. 权利要求9所述的方法，其中所述AFE细胞表达NKX2.1。23. 权利要求9所述的方法，其中所述高浓度的视黄酸包括至少大约0.5μΜ。24. 权利要求9所述的方法，其中所述细胞因子混合物抑制所述WNT途径。25. 权利要求9所述的方法，其中所述iPS细胞源自患病的人细胞。26. 权利要求25所述的方法，其中所述患病的人细胞是囊性纤维化疾病特异性人iPS细 胞。27. -种工程化三维肺组织，其包括权利要求1所述的气道上皮细胞。28. 工程化三维肺组织的方法，包括： 将诱导多能干（iPS)细胞群分化为气道上皮细胞，其中所述气道上皮细胞表达包括克 拉拉细胞分泌蛋白（CCSP)、细胞角蛋白5(KRT5)和FOXJl的气道细胞表面标记;并且能够在 培养中增殖而不丧失气道细胞标记;和 将所述气道上皮细胞接种至三维支架上。29. 权利要求28所述的方法，其中所述气道上皮细胞形成类器官结构。30. 权利要求28所述的方法，其中所述三维支架包括基质胶。31. 改善、治疗或减轻有需要的对象中的呼吸障碍的症状的方法，包括： 将诱导多能干（iPS)细胞分化为气道上皮细胞，其中所述气道上皮细胞表达包括克拉 拉细胞分泌蛋白（CCSP)、细胞角蛋白5(KRT5)和FOXJl的气道细胞表面标记，并且能够在培 养中增殖而不丧失气道细胞标记;和 以对治疗所述对象中的所述呼吸障碍有效的量施用所述气道上皮细胞。32. 权利要求31所述的方法，其中所述呼吸障碍是囊性纤维化。
【文档编号】C12N5/074GK105916978SQ201580004541
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2015年1月14日
【发明人】M·格赫德, L·尼克拉森
【申请人】耶鲁大学