一种成肌细胞膜片及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种成肌细胞膜片及其制备方法，所述的成肌细胞膜片为通过脂肪干细胞定向诱导而得到的。本发明提供的成肌细胞膜片，在具备良好机械性能同时，能够高表达肌细胞标志蛋白，可用于肌肉损伤及修复重建。本发明还提供了上述成肌细胞膜片的制备方法。上述成肌细胞膜片及其制备方法十分具有实用价值。
【专利说明】
一种成肌细胞膜片及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及组织工程与再生医学领域，尤其涉及一种成肌细胞膜片及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 肌细胞是一种终末分化细胞，再生能力差，肌肉损伤后主要以瘢痕修复为主，继而 影响其运动及收缩功能。临床上多种疾病病因与肌肉损伤或功能异常密切相关，如压力性 尿失禁、肌无力、杜氏肌营养不良等，但目前治疗手段有限且疗效欠佳。正常肌细胞由肌卫 星细胞分化而成，后者是位于基膜下的一类静息期肌源性干细胞，其数量随年龄增长而不 断降低，至成年时仅剩下不足7%，因此难以满足广泛而严重的肌肉再生需求。
[0003] 利用干细胞移植修复是目前组织工程研究的热点，通常将干细胞通过体外诱导技 术促其定向分化，继而细胞悬液注射组织损伤处进行修复，并已取得一定疗效。但是这种利 用细胞悬液原位注射有一些缺陷难以克服:首先，干细胞属于贴壁生长，细胞直接注射之前 须通过酶消化使其分散形成细胞悬液，这样不可避免影响细胞活性和丢失细胞;其次，几乎 所有文献均提及注射的细胞聚集在注射点周围，仅有少量细胞沿正常肌纤维组织深入生 长，因此如何使细胞在植入受损周围并形成更为均匀的分布，以整体区域修复，而非若干点 修复，将是影响最终临床疗效的关键。
[0004] 细胞膜片技术是通过刺激细胞外基质大量分泌并连接细胞形成一种细胞密度高、 细胞分布均匀、质地均一的膜片状组织的技术。已有研究证实，细胞膜片中细胞无须胰酶消 化处理，直接移植修复后，细胞凋亡率低，细胞活性保持长达12个月。脂肪干细胞是组织工 程应用最常见干细胞类型之一，具有细胞活性高、脂肪组织中含量丰富、取材简便、可重复 切取、机体损伤小等优势。脂肪干细胞具有多向分化潜能，分化能力强，多项研究证实添加 5_氮杂胞苷及马血清可促进其成肌分化。干细胞诱导技术和细胞膜片技术均为近年来发展 起来的组织工程关键技术之一，然而单独应用存在一定局限性，目前国内外均未见将脂肪 干细胞诱导成肌技术结合细胞膜片技术应用于肌肉修复重建研究中。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了 一种成肌细胞膜片及其制备方法。
[0006] 本发明第一方面提供了一种成肌细胞膜片，所述的成肌细胞膜片为通过脂肪干细 胞定向诱导而得到的。
[0007] 较佳地，所述的成肌细胞膜片由细胞膜片技术与干细胞成肌诱导技术结合而构建 的肌分化膜片状组织组成。
[0008] 本发明第二方面提供了上述的成肌细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括以下 步骤：
[0009] 步骤一:将脂肪干细胞高密度地接种于细胞培养皿中；
[0010] 步骤二:在所述的细胞培养皿中加入梯度浓度维生素进行刺激，并加入5-氮杂胞 苷和马血清诱导，得到所述的成肌细胞膜片。
[0011 ] 较佳地，所述的高密度为5 X 104个/cm2。
[0012] 较佳地，所述的步骤二中加入梯度浓度维生素进行刺激为以lOOμg/ml维生素 C强 刺激3天，更换50μg/ml维生素 C温和刺激18天。
[0013] 较佳地，所述的步骤二中加入5-氮杂胞苷和马血清诱导，所述的5-氮杂胞苷浓度 为lOymol/L，所述的马血清含量为5%，诱导时间为3周。
[0014] 本发明提供的成肌细胞膜片，在具备良好机械性能同时，能够高表达肌细胞标志 蛋白，可用于肌肉损伤及修复重建。维生素 C在细胞外基质形成过程中起着关键作用，可显 著促进细胞胶原合成，形成细胞-基质连接以及细胞间连接三维立体结构，在既往报道的细 胞膜片构建中广泛使用。5-氮杂胞苷是一种甲基转移酶抑制剂，与控制向肌源性分化的特 异启动子基因上阻遏蛋白结合，诱导DNA去甲基化，激活肌源性调节因子，启动干细胞向成 肌分化。马血清中含有促干细胞成肌分化的调节因子，与5-氮杂胞苷联合使用促加强成肌 分化能力。因此，我们在本发明中利用维生素 C促进细胞膜片形成的同时，联合5-氮杂胞苷/ 马血清促进脂肪干细胞成肌分化，构建一种成肌诱导细胞膜片。该膜片表面平整，质地均 一，细胞外基质含量丰富，厚度大，具备较好抗牵拉特性，不易破裂，具有临床应用的可操作 性，成肌确切，能自体移植。其厚度和机械性能具备可操作性，成肌确切，有望应用于肌肉损 伤修复。
【附图说明】
[0015] 图1为成肌细胞膜片HE染色观察图；
[0016]图2A和2B为成肌细胞膜片扫描电镜观察图；
[0017] 图3为成肌细胞膜片中α-SMA和Desmin基因水平表达图；
[0018] 图4A和图4B为成肌细胞膜片中a-SMA和Desmin蛋白水平表达图；
[0019]图5为免疫组化分析成肌细胞膜片中a-SMA和Desmin蛋白分布图。
【具体实施方式】
[0020]下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发 明。
[0021] 1、脂肪干细胞原代培养
[0022] 比格犬，6-8个月，戊巴比妥全身麻醉后无菌切取腹股沟处10g脂肪组织，剔除肉眼 可见筋膜及血管，0.25 %氯霉素浸泡30分钟，PBS漂洗3遍，眼科剪尽量剪碎成肉沫状，加入 0.1 % I型胶原酶在37°C中消化lh，100目滤网过滤，300g离心5min，加入干细胞培养基重悬 后接种于100mm细胞培养皿中继续培养，每2-3天更换培养基。
[0023] 脂肪干细胞培养基组成:450ml低糖DMEM培养基+50ml胎牛血清+100U/ml青霉素+ 100mg/ml硫酸链霉素，0.22μηι滤网过滤除菌。
[0024] 2、脂肪干细胞纯度鉴定
[0025]将原代培养脂肪干细胞传代至Ρ2，流式细胞仪鉴定其干细胞纯度，选取CD45、 ⑶90、⑶105作为表面抗原标志，0.25 %胰蛋白酶+0.01 %EDTA消化后4%多聚甲醛固定15分 钟，PBS清洗2遍，300g离心5min后加入250μ1 PBS重悬，分别加入2μ1 CD45-FITC抗犬抗体、1 μL CD90-PE抗犬抗体、2μ1 CD105-FITC抗犬抗体，在4°C条件下避光孵育30分钟，PBS清洗2 遍，上机检测。
[0026] 3,脂肪干细胞成肌诱导膜片制备
[0027] 将P2代脂肪干细胞以5 X 104个/cm2接种于60mm细胞培养皿，待细胞融合至90 %以 上时，更换干细胞成肌诱导培养基A继续培养，3天后更换干细胞成肌诱导培养基B连续培养 18天，每2天更换细胞培养液，培养3周即可成制备一种基于脂肪干细胞定向诱导的成肌细 胞膜片，可直接用镊子轻轻撕下。
[0028] 干细胞成肌诱导培养基A成分:425mL低糖DMEM培养基、50mL胎牛血清、100U/mL青 霉素、100mg/mL硫酸链霉素 、ΙΟμΜ ΙΟμ mol/L的5-氮杂胞苷、25mL含量为5%的马血清、100μ g/ml的维生素 C、3.7g/L NaHC03，上述培养基PH值为7.2。
[0029] 干细胞成肌诱导培养基B成分:425mL低糖DMEM培养基、50mL胎牛血清、100U/mL青 霉素、100mg/mL硫酸链霉素、10μΜ lOymol/L 5-氮杂胞苷、25mL含量为5%马血清、5(^8/11^ 维生素 C、3.7g/L NaHC03，上述培养基PH值为7.4
[0030]如图1所示，诱导培养3周后收获膜片状物，表面平滑，灰白样外观，质地均匀，具有 较好机械性能，能用镊子提起;HE染色显示，脂肪干细胞成肌诱导膜片由7-8层细胞构成，厚 度约100μπι，细胞之间紧密连接形成致密片状整体。
[0031] 4、脂肪干细胞成肌诱导膜片鉴定
[0032] 1)扫描电镜观察细胞膜片
[0033]成肌诱导3周至细胞膜片形成后，取小于lcm2细胞膜片样品，生理盐水清洗3遍， 1.25 %戊二醛4 °C预固定2h，0.1M磷酸缓冲液清洗3次，每次15分钟，1 %饿酸4 °C固定2h，酒 精梯度脱水，临界点干燥仪中干燥约2h，双面胶将干燥样品粘贴于样品台上，喷金3分钟，扫 描电镜观察。
[0034]如图2A和2B所示，低倍镜下（X800)观察成肌诱导膜片表面平整，细胞排列方向一 致，融合成梭状肌管样细胞分布(A);高倍镜下（X3000)细胞表面纤维蛋白和胶原大量分 布，并连接各细胞形成致密整体(B)。
[0035] 2)成肌标志基因 α-SMA和Desmin表达
[0036]本实施例所用引物信息如下：
[0039] 设置成肌诱导组和对照组，对照组未予以成肌诱导，仅单纯添加维生素 C刺激形成 脂肪干细胞膜片，成肌诱导组则予以上述方法诱导3周至细胞膜片形成，Trizol提取细胞膜 片中总RNA，逆转录cDNA合成，cDNA合成反应体系如下：
[0041 ] 制备cDNA溶液，保存于-80°c待用。实时定量PCR反应体系配置如下：
[0043] 将配制好的PCR反应溶液置于Real-time PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为： 95 °C 2分钟预变性，然后按95 °C 30s，58 °C 30s，72 °C 30s，共做35个循环，最后72 °C 5分钟延伸。 qPCR结果予以比较CT值法进行统计分析。
[0044] 如图3所示，qPCR结果显示，与对照组相比，成肌诱导细胞膜片中成肌标志基因 α_ SMA和Desmin表达显著升高，ρ〈0.001，表明5-氮杂胞苷/马血清诱导脂肪干细胞在基因水平 产生了显著的成肌分化。
[0045] 3)Western_blot检测细胞膜片α-SMA和Desmin蛋白表达
[0046] 依照上述方法成肌诱导3周至细胞膜片形成后，全蛋白提取试剂盒提取细胞膜片 中总蛋白，Lowry法测定蛋白浓度，取蛋白样品对目的蛋白a-SMA和Desmin的表达水平进行 检测，转PVDF膜80V 2h后，TBST稀释的BSA(浓度1%)封闭1 h，剪膜，加入一抗(a-SMA 1: 1000稀释，Desmin 1:300稀释)4°C过夜孵育，加入HRP标记二抗（1:1500稀释)室温孵育45分 钟，ECL显色系统定影显色，观察杂交条带。
[0047] 如图4A和图4B所示，Western blot结果显示，成肌诱导细胞膜片中成肌标志蛋白 a-SMA和Desmin高表达，而对照组中a-SMA蛋白低表达，Desmin蛋白未见表达，a-SMA蛋白相 对表达差异有统计学意义，P = 0.005。
[0048] 4)免疫组化分析细胞膜片a-SMA和Desmin蛋白表达
[0049] 依照上述方法成肌诱导3周至细胞膜片形成，设置未诱导细胞膜片作为对照组，石 蜡切片脱蜡入水，柠檬酸钠 (PH 6.0)溶液水浴煮沸30min抗原修复，5 %BSA封闭常温30min， 一抗(α-SMA 1:1500稀释，Desmin 1:500稀释)4 °C 孵育过夜，PBS 清洗5遍，HRP-二抗37 °C 孵 育3〇11^11，048(1:50)显色15分钟，终止后苏木紫复染，酒精梯度脱水后中性树胶封片。
[0050] 如图5所示，与对照组相比，成肌诱导细胞膜片中a-SMA和Desmin蛋白免疫组化染 色强阳性表达，呈现棕黄色广泛分布。
[0051] 本发明提供的成肌细胞膜片，在具备良好机械性能同时，能够高表达肌细胞标志 蛋白，可用于肌肉损伤及修复重建。维生素 C在细胞外基质形成过程中起着关键作用，可显 著促进细胞胶原合成，形成细胞-基质连接以及细胞间连接三维立体结构，在既往报道的细 胞膜片构建中广泛使用。5-氮杂胞苷是一种甲基转移酶抑制剂，与控制向肌源性分化的特 异启动子基因上阻遏蛋白结合，诱导DNA去甲基化，激活肌源性调节因子，启动干细胞向成 肌分化。马血清中含有促干细胞成肌分化的调节因子，与5-氮杂胞苷联合使用促加强成肌 分化能力。因此，我们在本发明中利用维生素 C促进细胞膜片形成的同时，联合5-氮杂胞苷/ 马血清促进脂肪干细胞成肌分化，构建一种成肌诱导细胞膜片。该膜片表面平整，质地均 一，细胞外基质含量丰富，厚度大，具备较好抗牵拉特性，不易破裂，具有临床应用的可操作 性，成肌确切，能自体移植。其厚度和机械性能具备可操作性，成肌确切，有望应用于肌肉损 伤修复。
[0052]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种成肌细胞膜片，其特征在于，所述的成肌细胞膜片为通过脂肪干细胞定向诱导 而得到的。2. 根据权利要求1所述的成肌细胞膜片，其特征在于，所述的成肌细胞膜片是由细胞膜 片技术与干细胞成肌诱导技术结合而构建的一种肌分化膜片状组织。3. -种根据权利要去1所述的成肌细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一:将脂肪干细胞高密度地接种于细胞培养皿中； 步骤二:在所述的细胞培养皿中加入梯度浓度维生素进行刺激，并加入5-氮杂胞苷和 马血清诱导，得到所述的成肌细胞膜片。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的高密度为5 X IO4个/cm2。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤二中加入梯度浓度维生素 进行刺激为以l〇〇μg/ml维生素 C强刺激3天，更换50μg/ml维生素 C温和刺激18天。6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤二中加入5-氮杂胞苷和马 血清诱导，所述的5-氮杂胞苷浓度为lOwnol/L，所述的马血清含量为5%，诱导时间为3周。
【文档编号】C12N1/38GK105950547SQ201610343196
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】傅强, 周术奎
【申请人】上海市第六人民医院