一种从间充质干细胞高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，本发明经过mRNA重编程，将间充质干细胞重编程为多能干细胞，然后采用基质三明治方法，加入激活素A和骨形态发生蛋白4，能够获取可跳动有功能的心肌细胞，且分化效率大于80％，本发明提供的方法可大大提高心肌细胞的分化效率。现有技术心肌细胞体外增殖能力有限，无法满足体外构建组织工程心肌的需要，本发明可为缺血性心血管疾病的细胞治疗研究，提供重要的实验依据资料，具有很好的临床应用前景。
【专利说明】
一种从间充质干细胞高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物细胞技术领域，具体涉及一种从间充质干细胞高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法。
【背景技术】
[0002]在心脏外科领域，目前使用的各种补片、管道都没有生长能力，无法辅助心脏功能，远期还会出现感染、血栓形成、毁损等。组织工程学技术的应用为研究开发新的心脏修复材料提供了一种新的思路和方法。通过组织工程方法构建组织工程血管或心肌补片可以克服上述补片的缺点，达到理想的先天性心脏病外科重建的目的。目前限制组织工程心肌研究一个最重要的课题就是缺乏大量有功能可跳动的心肌细胞。
[0003]
【申请人】前期研究也证明在诱导剂5-氮胞苷的作用下，脐带间充质干细胞能够分化为心肌细胞，但是分化效率较低，只有约30 %的间充质干细胞能够分化为心肌细胞，且分化来的心肌细胞不能够跳动(武开宏，莫绪明，卢士红，周斌，韩忠朝。脐带干细胞分化为心肌细胞样的实验研究。中华小儿外科杂志2009;30(10):33-6)。无法满足体外组织工程心肌研究的需要。
【发明内容】
[0004]发明目的:本发明的目的是为了解决现有技术的不足，采用mRNA重编程方法，将间充质干细胞重编程为多能干细胞，然后采用基质三明治方法，加入激活素A和骨形态发生蛋白4(BMP4)定向诱导培养，获取分化效率大于80%，可跳动的心肌细胞。该方法可大大提高心肌细胞的分化效率，也可为心肌细胞损伤后提供补充来源，为干细胞移植治疗心肌梗死及晚期心功能不全等奠定基础，具有很好的临床应用前景。
[0005]技术方案:为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]—种从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0007](I)采用mRNA重编程方法从脐带间充质干细胞获取多能干细胞并进行鉴定；
[0008](2)采用基质三明治方法对获取的多能干细胞进行心肌细胞定向诱导，在心肌细胞定向诱导培养液中加入激活素A和骨形态发生蛋白4，培养诱导；
[0009](3)然后采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测心肌特异性基因表达，采用免疫细胞化学方法鉴定心肌特异性抗体，采用流式细胞仪鉴定细胞分化效率，采用电生理检查心肌细胞的功能。
[0010]作为优选方案，以上所述的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，步骤(2)所述的步骤(2)所述的基质三明治方法为:用Versene消化酶消化步骤(I)多能干细胞，按IX 105/cm2种植到Matrigel包被的6孔板或12孔板上，当细胞100%融合时，细胞培养基更换为RPMI 1640培养基+无胰岛素B27培养基+50ng/ml激活素A+Matrigel胶，24小时后，加入RPMI 1640培养基+无胰岛素的B27培养基+10ng/ml BMP4+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，第5天细胞液换为RPMI1640培养基+含胰岛素的B27培养基，后每2天进行细胞换液。
[0011]作为优选方案，以上所述的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，步骤(2)培养诱导8?30天。
[0012]作为优选方案，以上所述的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，步骤(2)激活素A的浓度为50ng/ml，骨形态发生蛋白4的浓度为10ng/ml。
[0013]本发明通过大量实验筛选，研究不同浓度激活素A和骨形态发生蛋白4(BMP4)对心肌细胞诱导分化效率的影响，实验结果表明，采用50ng/ml激活素A和10ng/ml BMP4，能够使心肌细胞的分化效率达到80%以上。取得了很好的技术效果。
[0014]作为优选方案，以上所述的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，步骤(3)逆转录-聚合酶链反应检测心肌特异性α-肌动蛋白、转录因子Nkx2.5、肌球蛋白MLC_2a基因阳性;免疫细胞化学方法鉴定心肌特异性肌球蛋白MLC-2a、MLC_2v和α-肌动蛋白抗体阳性。
[0015]作为优选方案，以上所述的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，步骤(3)流式细胞仪检测细胞分化效率在80%以上；电生理检查获得的心肌细胞具有正常的动作电位和离子电流，说明获取的心肌细胞具有正常的电生理功能。
[0016]有益效果:本发明所提供的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法和现有技术相比具有如下优点:
[0017]本发明提供的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，可操作性强，稳定性好，可为体外构建组织工程心肌研究提供一个获取大量有功能心肌细胞的方法，也可为缺血性心血管疾病的细胞治疗研究，提供重要的实验依据资料，也可为心肌细胞损伤后提供补充来源，为干细胞移植治疗心肌梗死及晚期心功能不全等奠定基础，具有很好的临床应用前景。
【附图说明】
[0018]图1为本发明膜片钳检查所获得的心肌细胞的电位和离子电流。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
[0020]实施例1 mRNA重编程间充质干细胞及心肌细胞分化
[0021](I)采用mRNA重编程方法从脐带间充质干细胞获取多能干细胞并进行鉴定:
[0022]采用0ct4、Sox2、Klf4、cMyc、Lin28为mRNA重编程因子，按3:1:1:1:1摩尔配比，人NUFF成纤维细胞(Stemgent公司)按2.5 X 104/cm2接种在0.2%Gelatin包被的六孔板上(重编程滋养细胞)和T75培养瓶内(用于收集NUffcondit1ned Pluriton重编程培养基)，培养基为NUFF专用培养基。第2天，将分离的间充质干细胞按2.5 X 103/cm2种植到NUFF细胞上，培养基为DMEM/F12+10%FBS。第3天，开始重编程(d0)，培养基更换为Pluriton?培养基，加入200ng/ml B18R，放入37 °C、5 %⑶2培养箱中。2小时后，开始mRNA转染，加入mRNA重编程因子、RNAimaxs和Opt1-MEM培养基，充分混匀后，室温静置15分钟，依次加入各孔中，完成mRNA转染。将细胞放回培养箱中，4小时后，予以细胞换液，培养基为Pluriton?，含200ng/mlB18R的重编程培养基(该培养基至少在2小时前准备好，并放入培养箱中，以便获得适当的氧张力)。每日重复此操作至第17日。第6日开始，将Pluriton?培养基更换为条件培养基(NUFF Condit1ned Pluriton?培养基)。每日倒置显微镜下观察细胞变化及克隆形成情况，第5、7、10、14、18日在荧光显微镜下观察nGFP表达。第18天开始，培养基中不再加入B18R，而改成加入ΙΟμΜ ROCK抑制剂(Υ27632)，继续培养I周，若出现大的细胞克隆形成，对克隆进行挑选、消化并传代培养。初次消化采用0.48mM Versene酶消化3分钟，mTeSRl培养基中和后，用专用玻璃细胞刷将细胞克隆取出，并用200μ1细胞枪头小心吹打，接种到Matrigel包被的12孔板上，培养基为mTeSRl培养基+10μΜΥ27632。I周-10天后，细胞克隆增大或融合，采用Dispase酶消化5分钟，DMEM/F12培养基洗3遍，加入mTeSRl培养基，玻璃吸管将细胞克隆划成细胞碎片，并小心吹打，将细胞按1: 3-1:6传代。经3-5次传代培养后，即可去除掺杂的NUFF细胞、成纤维细胞和其它未分化细胞。
[0023]采用①形态学观察克隆样生长；②RT-PCR检测干细胞特异性基因表达:Nanog、0CT4、Sox2表达;③干细胞特异性蛋白表达:TRA-1-81活细胞染色，免疫组化鉴定干细胞特异性TRA-l-60、0CT4、Nanog表达;④细胞核型分析来鉴定多能干细胞。
[0024](2)采用基质三明治方法对获取的多能干细胞进行心肌细胞定向诱导:用Versene消化酶消化步骤(I)多能干细胞，按I X 15/cm2种植到Matrigel包被的6孔板或12孔板上，当细胞100%融合时，细胞培养基更换为RPMI 1640培养基+B27培养基(无胰岛素)+50ng/ml激活素A+Matrigel胶(8.7ug/cm2)，24小时后，加入RPMI 1640培养基+B27培养基(无胰岛素)+10ng/ml 81^4+101^/1111碱性成纤维细胞生长因子化?6?)，第5天细胞换液为1?^11640培养基+B27培养基(含胰岛素)，后每2天进行细胞换液。
[0025](3)然后采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测步骤(2)诱导培养的心肌细胞的心肌特异性α-肌动蛋白、转录因子Nkx2.5、肌球蛋白MLC_2a基因表达阳性;并免疫细胞化学方法鉴定心肌特异性肌球蛋白MLC_2a、MLC-2 V和α-肌动蛋白抗体阳性。
[0026]采用流式细胞仪鉴定细胞分化效率，并采用电生理检查心肌细胞的功能。如图1所示，膜片钳检查发现所获得的心肌细胞具有正常的动作电位和离子电流，且诱导分化效率在80%以上。
[0027]本发明采用经过鉴定的脐带间充质干细胞，经过mRNA重编程，该方法安全、效率高，能够消除基因插入和DNA突变的影响，可避免采用逆转录病毒或慢病毒的安全性问题。
[0028]实施例2不同浓度激活素A和不同浓度BMP4对心肌细胞分化效率影响的筛选实验
[0029]本发明采用不同浓度激活素A(5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml和100ng/ml)和不同浓度骨形态发生蛋白4(BMP4) (5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml和50ng/ml)对心肌细胞进行诱导，诱导培养方法同实施例1，研究发现采用基质三明治方法，浓度为50ng/ml激活素A和10ng/ml BMP4并加入10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能够达到最优化的诱导效果，心肌细胞分化效率在80 %以上。
[0030]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)采用mRNA重编程方法从脐带间充质干细胞获取多能干细胞并进行鉴定； (2)采用基质三明治方法对获取的多能干细胞进行心肌细胞定向诱导，在心肌细胞定向诱导培养液中加入激活素A和骨形态发生蛋白4，培养诱导； (3)然后采用逆转录-聚合酶链反应方法检测心肌特异性基因表达，采用免疫细胞化学方法鉴定心肌特异性抗体，采用流式细胞仪鉴定细胞分化效率，采用电生理检查心肌细胞的功能。2.根据权利要求1所述的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，其特征在于，步骤(2)所述的基质三明治方法为:用Versene消化酶消化步骤(I)多能干细胞，按IX 1Vcm2种植到Matrigel包被的6孔板或12孔板上，当细胞100%融合时，将细胞培养基更换为RPMI 1640培养基+无胰岛素B27培养基+50ng/ml激活素A+Matrigel胶，24小时后，加入RPMI 1640培养基+无胰岛素的B27培养基+10ng/ml BMP4+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，第5天细胞液换为RPMI1640培养基+含胰岛素的B27培养基，后每2天进行细胞换液。3.根据权利要求1或2所述的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，其特征在于，步骤(2)培养诱导8?30天。4.根据权利要求1所述的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，其特征在于，步骤(2)激活素A的浓度为50ng/ml，骨形态发生蛋白4的浓度为10ng/ml。5.根据权利要求1所述的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，其特征在于，步骤(3)逆转录-聚合酶链反应检测心肌特异性α-肌动蛋白、转录因子Nkx2.5、肌球蛋白MLC_2a基因阳性;免疫细胞化学方法鉴定心肌特异性肌球蛋白MLC-2a、MLC-24Pa-肌动蛋白抗体阳性。6.根据权利要求1所述的从间充质干细高效获取可跳动有功能心肌细胞的方法，其特征在于，步骤(3)流式细胞仪检测细胞分化效率在80%以上；电生理检查获得的心肌细胞具有正常的动作电位和离子电流，说明获取的心肌细胞具有正常的电生理功能。
【文档编号】C12N5/0775GK105950548SQ201610357813
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】武开宏, 李琳, 徐飞, 莫绪明
【申请人】南京医科大学附属南京儿童医院