专利名称：干细胞及胚胎来源的心肌细胞及推定的心肌细胞的纯化方法
技术领域：
本发明涉及从千细胞及胚胎来源的细胞群中纯化心肌细胞的方法 和利用方法。
背景技术：
成人体内心肌细胞丧失增殖活性，在诸如重症心肌梗塞、心肌症 等病症中，必须依赖心脏移植手术。但现状的心脏捐赠者不足至今仍 是一 个难以克服的问题，因此寻找心脏移植以外的治疗方法是当务之急。
针对此情况，在体外制备、纯化心肌细胞，对心肌细胞进行补充， 成为挽救必须依赖心脏移植的患者的最有希望的方法。因此，为了荻 得心肌细胞，对使干细胞(胚胎干细胞或各种成体干细胞)进行分化 的方法、从胎盘获得等方法进行了大量研究。
可以通过分别在小鼠胎干细胞中，将抑制分化的因子(滋养细胞、
白血病抑制因子LIF等)、在人胚胎干细胞中将抑制分化的因子(滋 养细胞、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子TGF等) 从培养液中除去，形成细胞块(类胚体)从而积极的引发分化。
在体外进行分化的模式一部分沿袭了生理的发育，特别是发育初 期的事件，在受精卵中发生的生理发育与体外的分化模式有着众多的 共同点。体外向心肌细胞分化的语系，与生理发育相同都要先形成未 分化的中胚叶细胞，其一部分经过推定心肌细胞(presumptive cardiac myocyte)(前心脏中胚叶)后，分化为心肌细胞。但是，由 于胚胎性干细胞可以分化为构成脏器的所有细胞，使其只分化为一种 细胞在技术上还存在困难。
另外，在体外非生理条件下(in vitro),引发所有细胞发生分 化较难，有可能存在一部分未分化的细胞。另外，可以分化为心肌细 胞的成体干细胞为存在于骨髓或脐带中的间叶干细胞、存在于各组织 中的组织干细胞(神经管细胞、脂肪肝细胞、骨骼肌干细胞等)，它 们可分化为多种细胞，而非心肌细胞一种。任何一种成体干细胞，其 分化为心肌细胞的详细机制过程均未被充分的探明，它们都经历一定 时期的迁移状态后形成含有心肌细胞或其它分化细胞、未分化细胞的 细胞集群。
概括地说，所有的干细胞都有共同的缺点，即产生心肌细胞以外 的其它细胞的副产物，或残留有未分化的细胞等对临床应用有害的性 质。未分化细胞具有增殖活性，并可以分化为多种细胞，因此难以直 接将含有分化诱导后的心肌细胞的细胞集群原状移植至生物体内，用 于治疗。
因此，为了安全的实施使用干细胞进行治疗，获得理想的治疗效 果，有必要寻找将心肌细胞本身从细胞集群中纯化分离出来的方法。
目前，多采用使心肌细胞特异性表达GFP等荧光标记，使用流式 细胞分选仪纯化表达荧光标记的细胞的方法(非专利文献1)，或使 心肌细胞特异性表达耐抗生素蛋白质，使用抗生素物质进行选择的纯 化方法(非专利文献2)，进行心肌细胞的纯化。但是在这些方法中， 必须进行遗传基因的改变存在由此引起的安全性问题，因而无法利用 于实际的移植当中。另外，上述方法均为伴有基因改变的方法，不仅 基因组的改变本身存在着伦理上的问题，还存在细胞癌化率的改变等 无法预测的严重风险(非专利文献3)。
虽然已知心脏可以利用来自骨骼肌等其它器官产生的乳酸作为能 量源(非专利文献4),但利用该性质纯化心肌细胞的尝试以前还从 未有过。
另外，心脏、肝脏、肾脏中，利用天门冬氨酸和谷氨酸向线粒体 内运送NADH，与其他器官有着不同的机制(非专利文献5) 。 NADH向 线粒体内的运送对于在线粒体内的能量生产的必不可少的。迄今为止， 根据该机理的不同之处尝试心肌细胞的纯化是没有先例的。
非专利文献l: MullerM， etal.， FASEB J. 2000; 14:2540-2548 非专利文献2: Klug MG, et al.， J. CI in. Invest. 1996; 98: 216-224
非专利文献3: Schroder AR， et al. ， Cell. 2002; 110:521-529 非专利文献4: KhairallahM， etal.， Am J Physiol Heart Circ
Physiol 2004; 286， H1461-1470
非专利文献5: Chatham JC， et al. ， J.Biol Chem 1995;
270:7999-8008
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题为，开发一种利用在目前以纯化心肌细胞为目的研 究中从未想到过利用的诸多性质、以及新发现的诸多性质，可在不改 变遗传基因，不添加特别的蛋白质及生理活性物质的情况下，从含有 来源于胚胎及干细胞的心肌细胞的细胞混合物中，高度且高收率的纯 4匕心肌干细力包的方法。
解决问题所用的方法
技术领域：
本发明的发明者们，为了构建能有效生产胚胎干细胞来源的心肌 细胞的系统，对培养液进行了系统研究。通过改变使用的培养液的组 成，进行各种培养液组成成分的浓度研究、及应当适应的时期的研究， 结果发现了以下现象
(1 )在低.无血清条件下引起对具有非心肌细胞分化倾向性的细 胞分化增殖抑制及诱导细胞凋亡的现象；
(2 )在弱酸性培养液中引起具有非心肌细胞分化倾向性的诱导细 胞凋亡的现象的现象；
(3) 在低钩培养液中引起对具有非心肌细胞分化倾向性的细胞分 化增殖抑制及诱导细胞凋亡的现象；
(4) 在低营养培养液中进行培养的情况下非心肌细胞选择性死亡
的现象；
(5 )在低钓环境下培养心肌细胞时心肌细胞的自律跳动减弱，能
量消耗被抑制的现象。
(6)低.无血清化促进心肌细胞自我集合块形成的现象，和
(7 )心肌细胞细胞块零乱分散的情况下心肌细胞的生存率显著下
降的现象。
本发明的发明者们，通过组合针对上述现象的方法并进行优化， 发现可有效且高度地选择纯化胚胎干细胞来源的心肌细胞，从而完成 了本发明。另外还发现，胚胎干细胞中发现的方法，可应用于胎盘来 源的心肌细胞的选择和/或纯化、及成体干细胞来源的心肌细胞的选择 和/或纯化，从而完成了本发明。
更具体而言，在本发明的一种方案为提供一种选择心肌细胞的方 法，是从含有胚胎干细胞来源、成体干细胞来源或胎盘来源的心肌细 胞和非心肌细胞的细胞混合物中，选择心肌细胞的方法，其特征为将
上述细胞混合物在具有选自(i)低糖条件；及(ii )低钾条件、低营 养条件、添加乳酸条件、添加天门冬氨酸和/或谷氨酸的条件、及添加 丙酮酸的条件中的1个或多个条件的培养液中进行培养，对心肌细胞 进行选择。在该方案中，对上述细胞混合物进行胚胎干细胞方向的分 化诱导，形成含有推定心肌细胞(未分化中胚叶)的类胚体，将该类 胚体在低血清条件及/或弱酸性pH条件的培养液中进行培养而进行 制备。
在本发明另一个方案中，提供一种选择来源于胚胎干细胞的心肌 细胞的方法，其特征为，在对胚胎干细胞进行分化诱导以后，形成含 有未分化的中胚叶的类胚体以后，通过将该类胚体在低血清条件及/ 或弱酸性pH条件的培养液中培养，以制备含有推定心肌细胞的细胞混 合物，然后通过在同一培养液中继续进行该细胞混合物的培养的而获 得心肌细胞。
图1为表示附着培养的类胚体的心肌细胞的存在模式的图。
图2为表示无血清条件下培养的结合类胚体中的心肌细胞的存在 模式的图。
图3为表示通过无血清化选择推定心肌细胞的图。 图4为表示低钙环境影响的图。
图5为表示对于在胚胎干细胞中，通过无血清和/或弱酸性pH条 件选择推定心肌细胞的图。
图6 - 1为表示在胚胎干细胞中，通过无血清和/或弱酸性pH条件 对推定心肌细胞进行分析的图。
图6 - 2为表示在胚胎干细胞中，通过无血清和/或弱酸性pH条件 对推定心肌细胞进行分析的图。
图7为表示对于胚胎千细胞，通过无血清和/或弱酸性pH条件选 择的心肌细胞块的图。
图8为表示对于在无糖和/或无血清和/或添加乳酸的培养条件下 选择心肌细胞的图。
图9为表示对于在无糖和/或无血清，添加乳酸的培养条件下对于 已经选择和/或回收的心肌细胞的特异性染色的图。
图10为表示对于在无血清和/或弱酸性和/或低钙和/或无糖，并 添加乳酸的培养条件下刚刚选择后的心肌细胞块和死细胞块的图。
图11为表示使用密度梯度离心除去死细胞块构成的高密度凝集 体的方法的图。
图12- 1为表示在无血清和/或弱酸性和/或低钾和/或无糖，并添 加乳酸的培养条件下选择的心肌细胞块的图。
图12- 2为表示在无血清和/或弱酸性和/或低钙和/或无糖，并添 加乳酸的培养条件下选择的心肌细胞块的图。
图13为表示在无血清和/或弱酸性和/或低钙和/或无糖，并添加 天门冬氨酸和/或谷氨酸的培养条件下純化的心肌细胞的图。
图14为表示纯化骨髓干细胞来源的心肌细胞的图。
图15为表示纯化胎盘来源的心肌细胞的图。
图16为表示在无血清和/或弱酸性和/或低钙和/或无糖，并添加 丙酮酸的培养条件下，在培养时发生自律性搏动的细胞区域的图。
图17为表示在无糖和/或无血清，并添加乳酸的培养条件下，在 15天培养后选择的绒猴心肌细胞块的图。
图18为表示在无糖和/或无血清，并添加乳酸的培养条件下，对 于选择和/或回收的绒猴细胞的心肌细胞特异性染色的图。
图19为表示在无糖和/或无血清，并添加乳酸的培养条件下选择 回收的绒猴细胞，在受供者心脏内部生长附着的图。
图20为表示在有糖(对照)条件下进行培养的人胚胎干细胞来源 的细胞块(对照)、和无糖(心肌选择)条件下进行15天心肌细胞选 择培养的人胚胎干细胞来源的细胞块(心肌选择条件)的状态的图。
图21为表示在无糖(心肌选择)条件下对人胚胎干细胞进行15 天心肌细胞选择培养后，变更培养液条件后，再次启动自律性搏动的 心肌细胞形成的胚胎干细胞来源的各细胞块的，抗肌动蛋白抗体及抗 Nkx2. 5抗体的染色图像的图。
具体实施例方式
对于具有向心肌细胞分化能力的干细胞(胚胎千细胞、骨髓干细 胞等成体干细胞)，进行适当的心肌细胞分化诱导后，发生向心肌细 胞的分化。即，例如通过从培养液中去除白血病抑制因子(LIF)进行 悬浮培养，使形成细胞块(类胚体)以悬滴法对小鼠胚胎干细胞进行 处理，可诱导胚胎干细胞向心肌细胞进行分化。或者使用绒猴胚胎干 细胞或人类胚胎干细胞，可同样的诱导胚胎干细胞向心肌细胞进行分 化。
本发明的方法可适用于来源于任意一种哺乳动物的干细胞。例如， 本发明的方法可适用于来源于小鼠、牛、山羊、猪、猫、绒猴、猕猴、 人的干细胞，只要是来自于上述动物的干细胞无其他限定。例如，作 为本发明中使用的干细胞，可例举出目前已经作为培养细胞广泛使用 的小鼠、猴子、人等哺乳动物的来源的ES细胞。
作为来源于小鼠的ES细胞的具体例子，可举出EB3细胞、El4细 胞、D3细胞、CCE细胞、Rl细胞、129SV细胞、Jl细胞等。本发明中 使用的源于小鼠的ES细胞可从例如美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection, ATCC)或Chemicon公司、Cell & Molecular Technologies公司等购入。
源于猴子的ES细胞，有例如猕猴(rhesus monkey: Macaca mulatta ) ( Thomson et al.， Proc. Natl.Acad.Sci. USA 1995; 92: 7844 ) 或食蟹猴(cynomolgus monkey: Macaca fascicularis ) (Suemoriet al.， Dev. Dyn. 2001; 222: 273-279 )、普通绒猴(common marmoset: Callithrix jacchus ) ( Sasaki et al.， Stem Cells. 2005; 23: 1 304-1313 )等建立的报道，可以进行使用。例如，可以从财 团法人.实验动物中央研究所处获得绒猴的ES细胞。
来源于人的ES细胞，目前全世界已经建立有数10种以上，例如 美国.国立卫生研究所的清单(http:〃stemcells. nih.gov/ registry/index, asp)上登记了很多细胞林可供使用，同时还可以从 Cel lart is公司或ES Cell International公司、Wisconsin Alumni Research Foundation等处购入。另夕卜，曰本方面，可以从国立大学 法人 京都大学再生医科学研究所附属干细胞医学研究中心处获得 (Suemori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.， 2006; 345: 926-932 )
另外，也有确立牛(Mitalipova et al. ， Cloning 2001; 3:59-67 )、 鸟(Petitte et al.， Mech. Dev. 2004; 121: 1159-1168 )、斑马鱼 (Fishman， M. C. ， Science 2001; 294: 1290-1291 )的ES细胞的报道。
通常ES细胞通过培养初期胚胎进行建立，从进行了体细胞核的核 移植的初期胚胎可以制得ES细胞(Munsie et al.， Curr. Biol. 10: 989, 2000; Wakayama et al. ， Science 292:740, 2001; Hwang et al., Science 303:1669， 2004 )。另外，还有使孤雌胚胎在嚢胚期 同样的阶段发生，从其制备ES细胞的尝试(美国专利公开第02/ 168763号；Vrana K et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 11911-6 );或还有通过ES细胞与体细胞的融合，制备具有体细胞核的遗传基因的 ES细胞的方法等的报道(国际
发明者服部文幸, 福田惠一 申请人:阿斯比奥制药株式会社;学校法人庆应义塾