专利名称：将多能性干细胞分化诱导成心肌细胞的方法
技术领域：
0001
本发明涉及一种有选择地且高效率地由ES细胞等多能性干细胞 制备心肌细胞的方法。
背景技术：
0002
(1 )使用多能性千细胞制备心肌细胞
一般而言，心肌细胞在出生前一边自主跳动一边活跃地进行细胞 分裂，出生后立刻丧失其分裂能力，而且未分化的干细胞或前体细胞 只是极少数存在，其增殖能力和分化能力极低、心肌细胞若由于遭受 心肌梗塞和心肌炎等各种应激而死亡，丧失的心肌细胞无法获得补充。 其结果是，残存的心肌细胞由于代偿性肥大而保持心脏机能，若各种 应激持续进行，超出其允许的范围，则引起进一步的心肌细胞的疲惫、 死亡，呈现出心肌机能的降低(即心力衰竭)。0003
以心力衰竭为代表的心脏病位居日本死亡原因的第2位，其预后 极差，心脏疾病患者的5年存活率在50%左右。因此，可以认为治疗 效果高的心力衰竭治疗法的开发与医疗福利的大幅前进以及医疗经济 的改善相关联。作为心力衰竭治疗药， 一直以来使用的是使心肌的收 缩力增加的洋地黄制剂和黄嘌呤制剂等强心剂，已知由于长期给药这 些药物过度消耗心肌能量，因此使病情恶化。而且，最近，用通过交 感神经系统和高血压蛋白原酶-血管紧张素系的亢进而减轻过剩的心 脏负荷的P阻断剂和ACE抑制药进行的治疗日益成为主流，然而这些 只不过是对症的治疗方法，并不能使受到伤害的心脏组织回复到原样。
4与之相对，心脏移植是一种针对重症心力衰竭的根本的治疗方法，由 于器官提供者的不足和医疗伦理、患者的肉体的、经济的负担重等问 题，这种方法难以作为一般的治疗方法频繁使用。
0004
因此，可以认为补充性移植衰弱或丧失的心肌细胞的方法对于心 力衰竭的治疗极为有用。事实上，已知在使用动物的实验中，若从胎 儿中获得未成熟的心肌细胞，将其移植到成体心脏组织中，移植细胞 作为心肌细胞有效地发挥功能(参照非专利文献1)。但是，该方法 难以获得大量的心肌细胞，从伦理的观点考虑，也难以应用于临床医 疗。
0005
因此，未分化的干细胞分化^i秀导成心肌细胞，将其作为移植用细 胞使用的方法近年来尤为受到关注。现在，由于在成体心脏組织中没 有发现可以清楚鉴定为可以产生心肌细胞的前体细胞或干细胞的细胞 群，因此为了实施上述方法，可以考虑使用未分化的具有更丰富的分 化能力的多能性干细胞。0006
所谓多能性干细胞(pluripotent stem cells),被定义为通过 离体培养仍然保持未分化状态，基本可以持续或长期细胞增殖，呈现 正常的核(染色体)型，具有在适当的条件下分化成所有三个胚层(外 胚层、中胚层、和内胚层)系统的细胞的能力的细胞。作为多能性千 细胞，最熟知的是分离自#刀期胚的胚胎干细胞(embryonic stem cells: ES细胞)和分离自胎儿期的原始生殖细胞的胚胎生殖细胞(embryonic germcells: EG细胞)、出生后立即从精巢中分离的生殖细胞系干细 胞(germline stem cells: GS细胞)等。0007
从以前就知道，尤其是ES细胞，通过离体培养，可以分化成心肌 细胞。初期的研究基本都是使用小鼠来源的ES细胞进行。若ES细胞 在单一细胞状态(通过实施酶处理等细胞之间不粘附，各个细胞分散的状态)下，不存在白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor: LIF)等分化抑制因子下进行悬浮培养，则ES细胞之间粘附、凝集， 形成被称为胚状体(embryoidbody: EB)的初期胚类似的结构体。已 知，这之后，通过在悬浮状态或粘附状态下培养EB，出现具有自主跳 动性的心肌细胞。0008
按上述方式制备的ES细胞来源心肌细胞呈现出与胎儿心脏来源 的未成熟的心肌细胞极为相似的性状(参照非专利文献2、 3)。而且， 实际上，在将ES细胞来源心肌细胞移植到成体心脏组织中的动物实验 例中，与移植了胎儿心肌的例相比基本没有变化，因此确认也具有极 高有效性(参照专利文献l、非专利文献4)。0009
1995年，Thomson等人首次从灵长类中建立ES细胞，逐渐带来了 使用来源于多能性千细胞的心肌细胞的心肌再生治疗法的实用化的现 实意义(专利文献2、非专利文献5参照)。接着，他们从人初期胚 中成功地分离并建立了人ES细胞林(参照非专利文献6)。而且， Gearhart等人由人原始生殖细胞建立了 hEG细胞林(参照非专利文献 7、专利文献3)。0010
Kehat等人(参照非专利文献8 )和Xu等人(参照专利文献4、 非专利文献9)报道了，与小鼠ES细胞相同，也可以由人ES细胞分 化诱导心肌细胞。若根据这些报道，由人ES细胞分化诱导的心肌细胞 具有自主跳动能力，在表达产生肌球蛋白重链/轻链或ot -辅肌动蛋 白、肌4丐蛋白I (Troponin I)、心房'性利尿狀(atrial natriuretic peptide; ANP )等心肌特异的蛋白质、GATA-4和Nkx2. 5、 MEF-2c等 心肌特异的转录因子的同时，根据细微解剖学观察和电生理学分析， 可期待胎生期的未成熟的心肌细胞的性质得意维持，应用于再生医疗。0011
另一方面，作为来源于多能性干细胞的心肌细胞在用于细胞移植治疗和其它目的使用时的重要问题，可以列举用以往的方法由ES细胞 或EG细胞所形成的EB中在心肌细胞以外还混合了血细胞系统细胞和 血管系统细胞、神经系统细胞、肠道系统细胞、骨、软骨细胞等其它 细胞。而且，在这些分化的细胞中，心肌细胞所占的比例不怎么高， 只不过为总体的5~20%左右。0012
从混合有其它种类的细胞混合物中，有选择地选择心肌细胞的方 法，可列举通过对ES细胞的基因人为地进行修饰，使之被赋予药物耐 受性或异位性表达能力，回收具有作为心肌细胞或其前体细胞的性状 的细胞的方法。例如、Field和共同研究者们通过在小鼠ES细胞中导 入位于oc型肌球蛋白重链启动子控制下的可以表达新霉素(G418)耐 受性基因的基因盒，只有该ES细胞分化成心肌细胞，伴随其表达ot型 肌球蛋白重链基因时，构建出了在添加了 G418的培养基中可以生存的 系统(参照专利文献1、非专利文献4)。且发现通过该方法选择为 G418耐受性细胞的细胞以99%以上的几率为心肌细胞。但是，虽然该 方法中心肌细胞的纯度极高，但是最终获得的心肌细胞数仅仅为全部 细胞数的几个百分比左右，所以难以获得移植治疗所必需的心肌细胞。0013
而且，Xu等人报道了通过用5-氮杂胞嘧啶核苷处理人ES细胞， EB中的肌钩蛋白I阳性(心肌)细胞由15%增加到44°/。(参照非专利 文献9)。但是，即使是该方法中，心肌细胞所占的比例也不超过EB 中的50°/。。而且，去甲基化剂5-氮杂胞嘧啶核苷是通过使结合于DNA
的甲基去除而使基因的表达状态变化的药物，由于药物直接作用于染 色体，作为制备移植用细胞的药物并不合适。
0014
此外，作为使ES细胞高效生成心肌细胞的方法，例如，在小鼠 ES细胞中，添加视黄酸(参照非专利文献10 )和抗坏血酸(参照非专 利文献11 ) 、 TGF p 、 BMP-2 (参照非专利文献12 ) 、 PDGF (参照非专 利文献13)、强啡肽B(Dynorphin B)(参照非专利文献14)、或使细胞内的、活小生氧类(reactive oxygen species: R0S)(参照非专利 文献15 )和Ca2+ (参照非专利文献16 )增加的处理方式促进性作用于 心肌细胞的分化诱导，可这些方法的任何一个方法都无法形成心肌细 胞特异的或选择性的分化诱导。最近，包括发明人在内的研究组公开 了，若通过用BMP拮抗剂瞬时处理ES细胞，就可以以比以往的方法更 高效地有选择性地分化诱导心肌细胞(专利文献5、非专利文献17 )。0015
(2 )心肌细胞的分化和/或发育过程中Wnt蛋白质功能的发挥 分泌性蛋白质Wnt蛋白质是被确认了其广泛存在于脊推动物以及 线虫或昆虫等无脊推动物中的蛋白家族中的一群，已知该基因家族中 有多种分子种类(非专利文献18、 19)。例如、现已判明与人和小鼠 相关的有19种(Wnt-l、 2、 2b/13、 3、 3a、 4、 5a、 5b、 6、 7a、 7b、 8a、 8b、 9a、 9b、 10a、 10b、 11、 16)。这些由Wnt基因编码的Wnt
蛋白质群其组织特异性各不相同，然而结构却相互类似。0016
Wnt蛋白质作为配体有助于细胞内信号传递系统时，与存在于细 胞膜上的7次跨膜Frizzled (Frizzled;以下、Fzd)家族受体结合。 有多个在Fzd受体的下游作用的途径，但作为最主要的途径，可以列 举由糖原合成酶激酶(Glycogen Synthase Kinase: GSK ) -3 p介导 的P连环蛋白的磷酸化抑制。不存在Wnt信号时，0连环蛋白与GSK-3 P在APC ( Adenomatous polyposis coli)蛋白上通过洋虫胶(Axin) 一起被补充，被GSK-3P迅速地磷酸化。被磷酸化的P连环蛋白受到 泛素化而被蛋白酶体分解。0017
另一方面，Wnt蛋白质一旦与Fzd受体结合，细胞内因子蓬乱蛋 白(Dishevelled)就被活化，从而补充GSK-3 P ， P连环蛋白不被磷 酸化，在细胞质内作为游离型残留并同时转移到核内。核内转移的P 连环蛋白通过与存在于核内的淋巴细胞活化因子-l/T细胞因子 (Lymphoid enhancer factor—1/T cell factor;以下、LEF-1/TCF)结合而形成转录活化复合体，诱导目的基因的转录。将伴随这样的&
连环蛋白的蓄积和核内转移的信号传递途径称为"古典的"Wnt途径、 或经典Wnt (canonical Wnt)信号途径，可活化该途径的Wnt-l或 Wnt-3a、 Wnt-8a等家族分子类被称为经典Wnt。公知的是即使在通过 各种GSK-3P抑制剂进行的处理中也同样会引起经典Wnt信号途径的 活化。
0018
已知Wnt配体也通过Fzd受体活化p连环蛋白途径以外的信号传 递途径，可以列举活化MAP激酶的1种JNK ( Jun N-末端激酶)的平 面内细胞极性(Planar cell polarity: PCP )途径、通过三聚物型G 蛋白质的活化和接连发生的磷脂酶(Phospholipase) C的活化使得细 胞内Ca"浓度上升以及蛋白质激酶C活化的Ca"途径(非专利文献19、 20)。这些途径相对于经典Writ信号途径，被称为"非古典的"Writ 途^f圣、或非(non )经典(non-canonical ) Wnt信号途4圣。据才艮道Wnt—4 和Wnt-11是可以活化该途径的Wnt家族分子，这些Wnt配体对经典 Wnt信号途径有抑制作用。0019
而且，在Wnt蛋白质的分子种类中，根据作用的细胞种类和其分 化阶段，该细胞中表达的Fzd受体的差异，也存在可以活化经典途径 和非经典途径这两者的种类。例如，已知Wnt-5a在非洲爪蛙胚的2 次轴形成和乳腺上皮细胞的癌化等一般的测试系统中作为非经典Wnt 作用，但另一方面，对于ES细胞，诱导P连环蛋白的稳定化和转录活 性，也就是说使经典Wnt信号途径活化(非专利文献21)。0020
已知Wnt蛋白质在各种细胞、组织或癌的发生、增殖、分化过程 中，与各种各样的生物学功能相关。在发育初期过程中，心肌细胞从 侧板中胚层的一部分出现，然后， 一边重复细胞分裂一边增殖，渐渐 形成心脏。在该过程中，Writ信号的有无承担着重要的作用，这从几 个事例就可以清楚。例如，在鸡和非洲爪蛙的发育初期过程中，使经典Wnt信号途径活化的Wnt-3a和Wnt-8a基因的异位的和/或强制性 表达可显著抑制心脏的形成(非专利文献22、 23)。0021
另一方面，与Wnt-3a或Wnt-8a结合，具有抑制该信号传递作用 的Frzb和Dkk-1等所有的Wnt拮抗剂促进心形成，由此提示经典Wnt 信号对心肌发育有抑制性作用。
0022
与之相反，已知拮抗性作用于经典Wnt信号的非经典Wnt信号途 径的活化可促进性^l"导心肌细胞的发育、分化。Pandur等人(非专利 文献24)已阐明不使经典途径活化，而使非经典途径活化的Wnt-ll 是非洲爪蛙的心脏发育所必需的因子。然后，在小鼠ES细胞(非专利 文献25 )和人的血管内皮前体细胞(非专利文献26 )的心肌分化诱导 系统中也同样确认了 Wnt-ll的促进效果。而且，已知与非经典Wnt 信号途径的活化相关，可以由舌组织分化诱导心肌细胞(专利文献6 )。0023
另一方面，与上述事例不同，已知经典Wnt信号途径的活化促进 性地作用于胚胎性癌细胞(Embryonic carcinoma cells: EC细胞) 的心肌分化。作为EC细胞中的1种的P19细胞的亚抹、P19CL6细胞 具有在二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide: DMSO)刺激下向心肌细胞 分化的性质，然而如果在培养基中添加Wnt-3a或Wnt-8，则促进了伴 随P连环蛋白稳定化的向心肌细胞的分化(非专利文献27)。而且， 显示出，在本系统中，添加Wnt蛋白质的时机，在紧随分化诱导后前 4天内是很不错的(非专利文献28)。0024
在P19细胞系可以分化诱导成心肌细胞和神经细胞这一方面，一 部分呈现出类似于ES细胞的性状。但是，P19细胞系不具有ES细胞 的多种分化能力和嵌合体形成能力，而且，发现细胞表面标志和表达 基因等，也有很大差异。即，虽然存在P19细胞系在某种实验中作为 ES细胞的模式系统使用的情况，然而很难说它一定是具有与ES细胞
10相同的性状的细胞，本实验系统中获得的发现是尚且还无法有科学 根据地进行预测是否可以推定那样的ES细胞等可以作为多能性干细 胞的心肌分化诱导系统。0025
最近，报道了在使用小鼠ES细胞的实验系统中，通过从分化诱导 开始的前3天内添加经典Wnt即Wnt-3a蛋白，ES细胞的心肌分化受 到促进(Naito A等人、第28次日本分子生物学会年会、2005. 12. 7 ~ 10、博多、日本；非专利文献30)。但是，在我们的相同的研究中， 并没有发现显著的分化促进效果(实施例2)，而且，其它研究组通 过对小鼠ES细胞进行Wnt-3a处理也没有引起特别显著的心肌分化诱 导效果(非专利文献25 )，或者也没有关于存在抑制效果效果(非专 利文献29)的报告。即，经典Wnt信号途径的活化对以ES细胞为代 表的多能性干细胞对心肌分化的效果并不明确，不能认为已建立了用 于诱导心肌分化的最佳培养法。
专利文献l: 美国专利第6， 015， 671号
专利文献2: 美国专利第5， 843， 780号
专利文献3: 美国专利第6， 090， 622号
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发明内容
发明要解决的问题0026
本发明的问题在于提供通过通过活化经典Wnt信号途径，高效率 且选择性地将未分化的多能性干细胞分化诱导成心肌细胞的方法；通 过该方法获得的心肌细胞；以及在以心脏病作为目标的细胞移植、注 入、其它治疗中^f吏用该细胞的方法等。
用于解决问题的方法0027
本发明人等使用多能性干细胞、尤其是使用最频繁的细胞-ES细 胞作为制备心肌细胞制的干细胞源，对向心肌细胞或其前体细胞分化 诱导的条件反复进行了各种研究，结果发现，培养时的某个时期，通 过在培养基中添加促进经典Wnt信号途径的活化的物质(以下、Wnt 信号活化物质)，相对于通常的方法选择性地以极为高效率产生被认 为是具有跳动能力的心肌细胞的细胞，从而完成了本发明。0028
作为可以在本发明中使用的多能性干细胞，可以列举小鼠、猴、 人等哺乳动物来源的ES细胞、EG细胞、GS细胞、以及所有与ES细胞 具有类似性状的多能性干细胞。此时，所谓与ES细胞类似的性状是指 可以定义为在ES细胞中存在特异的表面(抗原)标记，或ES细胞特 异的基因表达、或畸胎瘤(teratoma)形成能力或嵌合小鼠形成能力、 这样的在ES细胞中存在的特异性的细胞生物学的性质。0029本发明中，作为促进经典Wnt信号途径活化的物质的具体例子， 可以列举各种经典Wnt蛋白质、GSK-3P抑制剂、其它可以活化经典 Wnt信号途径的低分子化合物等。而且，还可以使用可以活化经典Wnt 信号途径的基因、例如各种经典Wnt基因、P连环蛋白基因、或失去 其N末端而被GSK-3 P将磷酸化部位取代为非磷酸化氨基酸的P连环 蛋白基因活性型变异体等。0030
在本发明中，所谓经典Wnt蛋白质被定义为Wnt家族蛋白质群中 与Fzd家族受体结合，通过GSK-3P抑制p连环蛋白的磷酸化，促进 P连环蛋白的稳定化以及转录活性能的物质。作为本发明所涉及的合 适的经典Wnt蛋白质，可以列举例如、Wnt-l和Wnt-3a、Wnt-5a、Wnt-8a 等，进而还可以列举在氨基酸序列中与该蛋白质具有80%以上、更优 选90%以上的同源性且具有P连环蛋白活化能力的蛋白质。0031
本发明的一个特征在于用Wnt信号活化物质瞬间刺激ES细胞等多 能性干细胞，作为这种刺激方法，没有特别的限定，优选可以列举在 含有经典Wnt蛋白质、例如、通过使纯化的经典Wnt基因表达而获得 的重组蛋白质(以下、重组Wnt蛋白质)的培养基中进行培养的方法。 使用的经典Wnt蛋白质和编码其的基因优选为与多能性干细胞来源的 物种同种的动物来源，也可以使用其它种动物来源的。在使用重组Wnt 蛋白质时，无菌地去除不新鲜的培养基，在含有浓度为0.1 ng/mL~ 500 ng/mL、优选1 ng/mL~ 200 ng/mL、更优选10 ng/mL~100 ng/mL 的重组Wnt蛋白质的培养基中进行培养。0032
本发明中涉及的所谓GSK-3P抑制剂被定义为抑制GSK-3P蛋白 质的激酶活性(例如对P连环蛋白的磷酸化能力)的物质，已知的有 数十种以上，作为其具体例子，可以列举靛玉红衍生物即BIO (别称 GSK-3 0抑制因子IX; 6-溴靛玉红3'-肟)、马来酰亚胺衍生物即 SB216763 ( 3-(2，4-二氯苯)-4-(1-甲基-IH-吲哚-3-基)-lH-吡咯-2，5-二酮)、苯基oc溴甲基酮化合物-GSK-3p抑制因子VII ( 4-溴代 苯乙酮)、细胞膜透过型磷酸化肽-L803-mts (别称GSK-3 P肽抑制 因子；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-冊2)等。这些化合物从Calbiochem公 司和Biomol公司等处购买，可以容易地使用，没有特别的限制。0033
在使用这些GSK-3p抑制剂时，根据其物质特性的差异，其最适 浓度差异很大。因此，需要根据所使用的化合物种类改变最适浓度。 例如、BIO和SB216763，优选用含有浓度为10 nmol/L ~ 1/n mol/L、 更优选50 nmol/L~ 200 nmol/L的GSK-3 P抑制剂的培养基替代，再 继续培养。GSK-3P抑制因子VII的添加浓度优选为2|amol/L~100|i mol/L，更优选5jLimol/"20jumol/L。 L803-mts的添加浓度优选为5 jamol/L~ 500 pmol/L、更优选20 |u mol/L ~ 200 jla mol/L、更优选25 ja mol/L ~ 200 |a mol/L。0034
而且，作为在本发明的实施中使用的药物，除了 GSK-3p抑制剂 以外，还可以是促进经典Wnt信号途径活化的低分子物质(以下、Wnt 激动剂)，作为合适的例子，可以列举氨基嘧啶衍生物(2-氨基 -4-[3，4-(亚甲二氧)千基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)-嘧啶； Calbiochem社)(Liuetal.， Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 44:1987， 2005 )。在使用该Wnt激动剂时，使用含有浓度为1 nmol/L~1000 画1/L、优选10 nmol/L~ 500画1/L、更优选50 nmol/L ~ 200画1/L 的Wnt激动剂的培养基替换，继续培养。0035
使Wnt信号活化物质作用时，可以以在本发明的实施中使用的多 能性干细胞的分化诱导过程中各种经典Wnt基因的表达模式作为指标 来确定。具体而言，基于常规方法，分化诱导多能性干细胞，从经时 回收的试样中提取mRNA,用RT-PCR法等一般的方法研究各种经典Wnt 基因的表达量，分化诱导后经典Wnt基因的表达量比分化诱导前未分 化的多能性干细胞有显著上升时为"Wnt基因的表达上升期"。作为
15分析对象的经典Wnt基因可以是l种，但理想的是优选2种以上，更 优选3种以上。0036
本发明的实施中，多能性千细胞在用于心肌分化诱导的培养开始 后即刻起，到用上述方法确定出Wnt基因的表达上升期的24小时前这 段期间，在不含Wnt信号活化物质的培养基中进行培养。而且，在用 上述方法确定的Wnt基因的表达上升期的24小时前~ 0小时前、优选 从24小时前的时间点开始、优选24小时~96小时、更优选48小时~ 72小时、在含有Wnt信号活化物质的培养基中培养多能性干细胞。而 且，使Wnt信号活化物质作用期间，可以根据所使用的细胞来源的动 物种类、所使用的细胞林、使用的Wnt信号活化物质种类等条件的差 异，改变最适时间再使用。0037
根据上述方法，从以ES细胞为代表的多能性千细胞中分化诱导的 心肌细胞、接着用公知方法进行细胞回收、分离，通过使用纯化方法 可以有效且大量地获得高纯度的心肌细胞。以下，将这样获得的心肌 细胞称为根据本发明制备的心肌细胞。0038
根据本发明制备的心肌细胞是呈现心肌细胞的形态学的、生理学 的和/或免疫学的特征的细胞。生理学的和/或免疫学的特征没有特 别的限定，根据本发明制备的心肌细胞被识别为心肌细胞，只要发现 在心肌细胞中特异性表达1个或其以上的标记即可。0039
而且，根据本发明制备的心肌细胞可以在用于鉴定促进心肌细胞 的发育或分化诱导、再生、生存等的新型因子或具有可能性的化疗药 物的篩选方法中^(吏用。0040
进而，根据本发明制备的心肌细胞可以在治疗处于心脏疾病状态 的心脏的方法中^f吏用。0041
也就是说，不限于这些，本发明涉及以下事项。
(1) 将多能性干细胞分化诱导成心肌细胞的方法，其包括(i) 在从分化诱导开始到经典Wnt基因的表达上升期的24小时前的时期 内，在不含促进经典Wnt信号途径的活化的物质的培养液中培养多能 性干细胞；然后，
(ii)在经典Wnt基因的表达上升期的24 ~0小时前至24~96 小时的期间内，在含有促进经典Wnt信号途径活化的物质的培养液中 培养。
(2) 根据(1)所述的方法，从到达经典Wnt基因的表达上升期 的24小时前开始在含有促进经典Wnt信号途径活化的物质的培养液中
培养多能性干细胞。
(3 )根据(1)或(2 )所述的方法，在含有促进经典Wnt信号途 径活化的物质的培养液中培养多能性干细胞的时间为48~72小时。
(4 )根据(1) ~ ( 3 )任一项所述的方法，促进经典Wnt信号途 径活化的物质是选自于经典Wnt蛋白质、GSK3 P抑制剂和Wnt激动剂 的物质。
(5) 根据(4)所述的方法，促进经典Wnt信号途径活化的物质 是经典Wnt蛋白质。
(6) 根据(5)所述的方法，经典Wnt蛋白质是选自于Wnt-l、 Wnt-3a和Wnt-5a中的至少一种Wnt蛋白质。
(7) 根据(5)或(6)所述的方法，经典Wnt蛋白质在培养液中 的浓度为0.1 ng/mL~ 500 ng/mL。
(8) 根据(4)所述的方法，促进经典Wnt信号途径活化的物质 是GSK3P抑制剂。
(9) 根据(8)所述的方法，GSK3P抑制剂是选自于GSK3p抑制 因子VII、 L803-mts、 SB216763、和GSK3 P抑制因子IX ( BIO )中的 至少一个抑制剂。
(10 )根据(8 )或(9 )所述的方法，GSK3 P抑制剂在培养液中的浓度，当是GSK3 P抑制因子VII的情况下为2Mmol/L~ 100nmol/L、 当是L803—mts的情况下为5jamol/L 500 nmol/L、当是SB216763的 情况下为10 nmol/L~ 1 jimol/L、或、在为GSK3 P抑制因子IX ( BIO ) 时为10 nmol/L~ 1 jumol/L。
(11) 根据(4 )所述的方法，促进经典Wnt信号途径活化的物质 为Wnt激动剂。
(12) 根据(11)所述的方法，Wnt激动剂为氨基嘧啶衍生物。
(13) 根据(11)或(12)所述的方法，Wnt激动剂在培养液中 的浓度为1 nfflol/L~ 1000 nmol/L。
(14) 根据(1) ~ (13)所述的方法，多能性千细胞为胚胎干细 胞、胚胎生殖细胞、或生殖细胞系干细胞。
(15 )根据(14 )所迷的方法，多能性干细胞为胚胎干细胞(14 )。 (16) (14)或(15)所述的方法，多能性千细胞来源于人。 发明的效果0042
通过使用本发明中涉及的方法，可以由ES细胞等多能性干细胞极 为有效且选择性地生产心肌前体细胞和心肌细胞。通过本发明所涉及 的方法制备的心肌(前体)细胞可以用于探询和开发对心脏疾病治疗 有效的药物中，与此同时也存在着可以应用于针对严重的心脏疾病的 心肌移植治疗中的可能性。
附图的简要说明
0043
图1 A表示在ES细胞分化诱导的过程中Wnt基因等的表达变化。 图中的符号的含义如下所示。 :未处理组、■:腱蛋白(Chordin) 处理组、▲: Dan处理组。纵轴表示Wnt基因表达量相对于作为内部 标准使用的GAPDH基因的表达量的相对比例。而且，※表示该Wnt基 因的表达量与分化诱导前未分化的ES细胞相比显著上升的时间点。
图1B表示ES细胞分化诱导时的过程中Wnt基因等的表达变化。图中的符号的含义如下所示。 :未处理组、■:腱蛋白处理组、▲: Dan处理组。纵轴表示Wnt基因表达量相对于作为内部标准使用的 GAPDH基因的表达量的相对比例。而且，※表示该Wnt基因的表达量 与分化诱导前未分化的ES细胞相比显著上升的时间点。
图1C表示ES细胞分化诱导时的过程中Wnt基因等的表达变化。 图中的符号的含义如下所示。O:未处理组、腱蛋白处理组、▲: Dan处理组。纵轴表示Wnt基因表达量相对于作为内部标准使用的 GAPDH基因的表达量的相对比例。而且，※表示该Wnt基因的表达量 与分化诱导前未分化的ES细胞相比显著上升的时间点。
图2A表示根据向培养液中添加重组Wnt蛋白质时间的不同对跳 动性EB出现的影响。
图2B表示根据向培养液中添加重组Wnt蛋白质时间的不同对跳 动性EB出现的影响。
图3A表示在由于ES细胞分化诱导而出现的跳动性EB中心肌细 胞特异的标记基因的表达。纵轴为未处理组(None)中基因表达量为 1时的相对比例。
图3B表示在由于ES细胞分化诱导而出现的跳动性EB中心肌细 胞特异的标记基因的表达。纵轴为未处理组(None)中基因表达量为 1时的相对比例。
图3C表示在由于ES细胞分化诱导而出现的跳动性EB中心肌细 胞特异的标记基因的表达。纵轴为未处理组(None)中基因表达量为 1时的相对比例。
图3D表示在由于ES细胞分化诱导而出现的跳动性EB中心肌细 胞特异的标记基因的表达。纵轴为未处理组(None)中基因表达量为 1时的相对比例。
图4表示在由于ES细胞分化i秀导而出现的跳动性EB中心肌细胞
特异的标志蛋白质的免疫组织化学染色。
图5A表示由GSK3 0抑制剂产生的跳动性EB的出现效果。 图5B表示由GSK3p抑制剂产生的跳动性EB的出现效果。图5C表示由GSK3P抑制剂产生的跳动性EB的出现效果。 图5D表示由GSK3P抑制剂产生的跳动性EB的出现效果。 图5E表示由GSK3P抑制剂产生的跳动性EB的出现效果。 图6表示在普通绒猴(猴)ES细胞的分化诱导过程中Wnt-3基因 的表达变动。
图7表示在由于cmES细胞的分化诱导而出现的跳动性EB中心肌 细胞特异的标记基因的表达。
图8表示在由于c迈ES细胞的分化诱导而出现的跳动性EB中心肌 细胞特异的标志蛋白质的免疫组织化学的染色。
用于实施发明的方式0044
以下，就用于实施包括本发明的上述效果和其它优点和特征的发 明的方式进行描述。0045
本发明的实施中，分子生物学和重組DNA技术等基因工程方法和 一般的细胞生物学方法和现有技术，若没有特別表示，实施者可以参 照本领域标准的书籍。作为这种书籍，可以列举例如、r分子克隆 实验室手册第3版」(Sambrook & Russell、冷泉港实验室出版、2001 ); r Current Protocols in Molecular biology J (Ausubel et al.编、 John Wiley & Sons 、 1987 ); r Methods in Enzymology系歹'J J (Academic Press); r PCR Protocols: Methods in Molecular Biology J ( Bartlett & Striling编、H觀na Press、 2003 ) ; r Animal Cell Culture: A Practical Approach第3版 ( Masters编、0xford University Press、 2000 ) ， r Antibodies: A Laboratory Manual J ( Harlow etal. & "ne编、Cold Spring Harbor Laboratory Press、 1987 )等。而且， 本说明书中所参照的用于细胞培养、细胞生物学实验的试剂和试剂盒 类可以从Sigma 7>司或Aldrich 乂〉司、Invitrogen/GIBCO 乂〉司、 Clontech公司、Stratagene公司等商家获得。
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而且，使用多能性干细胞的细胞培养、和发育'细胞生物学实验的 一般方法，实施者可以参照本领域的标准书籍。这其中包括r Guide to Techniques in Mouse Development J ( Wasserman et al.编、Academic Press, 1993 ); r Embryonic Stem Cell Differentiation in vitro J
(M.V. Wiles、 Meth. Enzy迈ol. 225:900， 1993 ); r Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual J ( Hogan et al.编、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994 ) ; r Embryonic Stem Cells J
(Turksen编、Humana Press, 2002 )。本+兌明书中参照的用于细胞 培养、发育、细胞生物学实验的试剂和试剂盒类可以从 Invitrogen/GIBC0 7>司或Sigma公司等商家获得。0047
小鼠和人的多能性干细胞的制备、传代、保存法，已经建立了标 准的规程，实施者除了参照前面列举的参考书籍之外，还可以通过参
照多种参考文献等来使用这些多能性干细胞。作为这种文献，可以列 举以下文献Matsui et al. ， Cell 70:841， 1992; Thomson et al,， 美国专利第5， 843， 780号；Thomson et al. ， Science 282: 114, 1998; Shamblott et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998; Shamblott et al.，美国专利第6， 090， 622号；Reubinoff et al. ， Nat. Biotech. 18: 399， 2000;国际
发明者小清水右一, 河岛佳代子, 田中智文, 门仓庆知 申请人:阿斯比奥制药株式会社