专利名称：分离纯化人羊水干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及细胞的分离纯化方法，特别是涉及一种分离纯化人羊水干细胞的方法。
背景技术：
人羊水干细胞(human amniotic fluid-derived stem cells, hAFSCs)的研究 近几年逐渐受到关注。2003年，In't Anker等证实从孕中期(17-22周)羊水中能够分 离培养出hAFSCs，从而开辟了一条新的成体干细胞的获取途径，引起了研究者的极大 兴趣和关注。目前的研究表明hAFSCs除了具备一般成体干细胞的生物学性状，以及 良好的增殖能力及多向分化潜能之外，还能表达一些全能干细胞特有的标志分子如 SSEA-4 (stage-specific embyronic antigen-4，特殊期胚月台抗原-4) 、 Oct-4及腿og 等，说明hAFSCs是一群发育更为原始的成体干细胞；羊水属于人体遗弃组织，取材方 便，不会对供者造成新的创伤，且没有伦理、法律方面的限制，利用hAFSCs有可能研 发出通用型组织工程产品，因而具有诱人的应用前景；美国《时代》周刊将羊水干细 胞的研究进展评为2007年度世界十大医学突破之一，说明了人们对其应用前景的高度 关注和认可程度。
人羊水细胞是一群混杂细胞，hAFSCs只占其中很少的一部分，目前通常采用的贴 壁培养方法难以得到生物学性状一致的hAFSCs，影响其体外扩增和向特定目的细胞的 多向诱导分化效率。近年来，随着对成体干细胞生物学性状及其调控机制的研究不断 深入，研究人员对成体干细胞分离纯化的特异性标志物进行了进一步的研究；研究表 明成体干细胞是胚胎发育过程中保存下来的未分化的细胞，提示成体干细胞与胚胎 干细胞(embryonic stem cells, ESCs)可能会有更多的相似性与同源性；进一步还 有学者发现在大鼠骨髓组织中存在着一种数量稀少的胚胎样原始干细胞，表达胚胎干 细胞的特异性标志如Oct-4、 Rex-1及SSEA-1，体外培养条件也类似于胚胎干细胞； 另有研究表明人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 中确实存在着一群数量极少的SSEA-4阳性表达的细胞群，经过分离纯化的这群细胞 具备了全能干细胞的某些性状，同时提高了向其它组织细胞诱导分化的能力和效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种性状均一的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细 胞的分离纯化方法。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案 一种分离纯化人羊水干细胞的 方法，是以特殊期胚胎抗原-4 (stage-specific embyronic antigen-4， SSEA-4)为 筛选标志，从贴壁培养的人羊水干细胞中分离纯化出性状均一的特殊期胚胎抗原-4阳 性表达的人羊水干细胞。
可通过免疫磁珠筛选方法从人羊水干细胞中分离纯化出性状均一的特殊期胚胎 抗原-4阳性表达的人羊水干细胞，具体来讲，是将带有磁珠的特殊期胚胎抗原-4单 抗标记人羊水千细胞，使人羊水干细胞表面的特殊期胚胎抗原-4与特殊期胚胎抗原-4 单抗特异结合，再将特殊期胚胎抗原-4单抗孵育后的人羊水干细胞置于外带磁场的过 滤柱中过滤，滤完后撤除磁场，收集过滤柱内细胞，得到特殊期胚胎抗原-4阳性表达 的人羊水干细胞。
所述人羊水干细胞的获取方法是多种多样的，例如为取正常分娩的人羊水组织， 通过贴壁培养获取人羊水干细胞，并常规传代2-3代。
为获得更好的分离纯化效果，所述方法中还包括将收集的特殊期胚胎抗原-4阳性 表达的人羊水干细胞置于人羊水干细胞培养基中进行传代扩增培养的步骤。
此外，为检测分离纯化效果，还可对分离纯化的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人 羊水干细胞进行生物学性状检测，包括流式细胞术检测(特殊期胚胎抗原-4阳性细胞 所占比例在95%以上说明获得了较好的分离纯化效果)、人全能干细胞特异性标志物 Nanog及Oct-4检测、核型分析、多向诱导分化及致瘤实验等，得到性状均一，具有 良好的增殖和诱导分化能力，G0/G1期细胞比例在90X以上，并能表达人全能干细胞 特异性标志物特殊期胚胎抗原-4、 Nanog及Oct-4的人羊水干细胞。
用上述方法获得的性状均一的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞也属 于本发明的保护范围。
本发明提供了一种以SSEA-4抗原作为分离和纯化成体干细胞的特异性标志的分 离纯化特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞的方法。实验结果表明用本发明的 方法可得到性状均一，具有良好的增殖和诱导分化能力，G0/G1期细胞比例在90X以 上，并能表达人全能干细胞特异性标志物特殊期胚胎抗原-4、 Nanog及0ct-4的人羊 水干细胞。本发明提供了一条获得人羊水干细胞的新途径，并为人羊水干细胞的深入 应用奠定了基础。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中描述到的各种生物 材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反 法律和道德伦理能够获取的同类生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用；在产 业实施中，来源于大鼠、小鼠、猪或人等哺乳动物的各种细胞或组织、废弃物均为离 体的，并包括从生物材料库、细胞库中取得，或商业购买获得，还包括按照已有文献 的介绍制备获得。
本发明实施例中所用人羊水组织，来源于正常生产过程中的遗弃人羊水组织，羊 水标本的获取均经过供者的知情同意，并通过提供羊水组织的医院伦理委员会批准。 本方法的要旨是提供从这些已有的人羊水组织中获取人羊水干细胞的过程，人羊水组 织的获取途径不构成对本发明的限制。
实施例1、性状均一的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞的分离纯化 获得性状均一的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞，具体方法包括以下 步骤
一、人羊水干细胞的获取和培养
0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液0.25g胰蛋白酶与0.02g EDTA溶于100mL磷酸盐缓 冲液，经0.22微米滤膜过滤，4'C保存备用。
磷酸盐缓冲液KH2P04 0. 2g、 Na2HP04'12H20 3 . 4g、 KC1 0. 2g、 NaCl 8. 0g，双蒸 水溶解并加至1000mL，调pH值为7.2，用0. 22 ^ m的微孔滤膜过滤，4"C保存备用。
细胞培养基低糖DMEM培养液，补充胎牛血清15% 、 bFGF4ng/mL、青霉素50U/mL 及链霉素50U/mL， 4'C保存备用。
取正常人羊水组织，通过贴壁培养获取人羊水干细胞，并常规传代2-3代，具体 方法为无菌羊水组织5-10mL，于1800rpm离心5分钟，在超净台内去上清，并加 lmL培养基充分混悬细胞，然后接种于25cm2培养瓶中，放于37。C、 5%0)2孵箱中培 养，四天后观察，正常情况下会看到贴壁生长的细胞，后全量更换培养基继续培养， 待培养瓶内细胞长至80%以上融合时，用0.25X的胰蛋白酶37"C消化细胞，传代， 常规传代培养，以扩增细胞数。
其中，常规传代培养方法如下
当培养瓶中细胞长到70-80%融合状态，即可消化传代，在超净台中，去除培养 瓶中培养基，后加入lmL 0.25X胰蛋白酶-EDTA溶液，消化1-2分钟，在显微镜下看 到细胞由梭形变为椭圆形时，即可加含血清培养基lmL终止消化，然后用滴管吹打贴 壁细胞，使细胞混悬，把细胞悬液移至lOraL无菌离心管，1100rpm离心5分钟，于超 净台内去除上清，并加lraL培养基重悬细胞，按l: 3比例稀释，接种于3个75 cm2 培养瓶中，轻轻摇匀细胞，置于37T:、 5XC02孵箱中培养，每3天换液一次。通过上述贴壁培养方法可初步获得一群主要为成纤维细胞样的混杂细胞群。流式
细胞检测贴壁培养的人羊水干细胞中特殊期胚胎抗原-4阳性细胞数为55-70%，远远 高于文献报道的骨髓来源间充质干细胞的2-3%。
二、 特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞的筛选
通过免疫磁珠筛选方法从步骤一的混杂细胞群中分离纯化出性状均一的特殊期 胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞，具体来讲，是向培养后由胰酶消化而得的人羊 水干细胞混悬液中添加特殊期胚胎抗原-4单抗(R&D) ， 100 ii 1体系10til单抗/107 个细胞，5'C孵育30分钟，使人羊水干细胞表面的特殊期胚胎抗原-4与特殊期胚胎抗 原-4单抗特异结合，加2mL磷酸缓冲液，300rpra离心10分钟洗脱未结合的单抗，混 悬细胞，再加入能与特殊期胚胎抗原-4单抗结合的磁珠(MiltenyiBiotec) ， 100ul 体系10ul单抗/107个细胞，孵育后，加2mL磷酸缓冲液，300rpm离心10分钟洗脱 未结合的磁珠，充分混悬细胞，并使单细胞悬液置于外带磁场(Mini MACS Miltenyi Biotec)的过滤柱(Miltenyi Biotec)中过滤，滤完后撤除磁场，收集过滤柱内细 胞，得到特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞，此后即可进行培养与扩增。
通过细胞计数检测过滤柱中细胞占总细胞的比例，结果过滤柱中细胞(SSEA-4 阳性细胞)占总细胞比例为50-60%，与流式细胞检测结果基本一致，证明获得了较 好的分离纯化效果。
三、 传代扩增培养
将收集的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞置于人羊水干细胞培养液中 进行传代扩增培养，传代培养方法，试剂及剂量、培养基及其配方及培养条件，均与 步骤一 (人羊水干细胞的获取和培养)相同。
四、 生物学性状的检测
为检测分离纯化效果及细胞多向分化潜能，对步骤三经分离纯化及传代培养得到 的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞进行了相应生物学性状的检测，具体内
容如下
1、 SSEA-4表达检测
将筛选后的羊水干细胞继续培养，通过流式细胞术检测观察SSEA-4阳性细胞比 例。结果，筛选后的羊水干细胞呈贴壁生长，细胞呈梭形、成纤维细胞样，排列规则， 群体倍增时间为34小时，92X的细胞处于G0/G1期，SSEA-4表达率为100% ，并且 常规传代培养能维持100%表达，说明可以利用本发明的免疫磁珠分选方法筛选得到 人羊水干细胞中SSEA-4表达阳性细胞，筛选后的人羊水干细胞在相当长的传代培养 过程中其SSEA-4表达率仍能保持100%，细胞持续处于未分化状态。2、 人全能干细胞特异性标志物Nanog及Oct-4检测
用Western Blotting方法检测步骤经分离纯化及传代培养得到的特殊期胚胎抗 原-4阳性表达的人羊水干细胞的人中全能干细胞特异性标志物Nanog及Oct-4的表达 水平，所用抗体分别为鼠抗人Nanog抗体和兔抗人Oct-4抗体(R&D)，结果经分离 纯化及传代培养得到的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞中均能表达人全 能干细胞特异性标志物Nanog及Oct-4，进一步说明该群细胞具有全能干细胞某些特 异性标志物的表达。
3、 CD29、 CD90、 CD105及CD34表达检测
选取生长状态良好的经过筛选的人羊水干细胞制备成单细胞悬液，调整细胞密度 为2.0X107mL，加入Ep管中，PBS洗两次，在每只Ep管中分别加入鼠抗人CD29、 CD34、 CD90、 CD105—抗(以PBS代替一抗作为阴性对照)，室温反应30min， PBS洗涤 2次后，再滴加FITC标记的抗鼠IGg，反应15min，流式细胞仪检测。
结果筛选后的人羊水干细胞表达CD29、 CD90、 CD105等间充质干细胞标识，不表 达CD34等造血干细胞标志，表明细胞具有多能干细胞性状，而非单能干细胞。
4、 核型分析
具体实施和分析方法包括以下步骤(参考文献杜传书，刘祖洞，主编.医学
遗传学.第二版，北京人民卫生出版社。)
(1) 筛选得到的人羊水干细胞在指数生长期加秋水仙素(应用液5mg/L)，终浓度 0.03mg/L， 5%C02 37'C继续培养4h，胰蛋白酶消化；
(2) 离心，吸弃上清，加O. 075M KC1低渗液，37。C低渗20min。加O. 3mL固定液 (甲醇冰醋酸3:1)混匀固定lmin;
(3) 离心，吸弃上清，加固定液7-8mL，重悬固定30min;
(4) 重复步骤(3) 2次，留固定液滴片，制备出染色体标本；
(5) Giemsa染色后显微镜下观察分析；寻找染色体分散较少，长短适宜的中期 分裂细胞，在油镜下计数染色体数目及结构畸变；
(6) 选形态佳的中期分裂细胞3 5个，显微摄影，经冲洗、放大，剪贴后进行染 色体核型分析。
结果，筛选后的人羊水干细胞持续培养20代以上仍表现为正常的二倍体核型， 表明筛选得到的人羊水干细胞具有遗传性状的稳定性和应用的安全性。
5、 多向诱导分化能力检测 (1)神经元样细胞诱导分化
诱导培养基a成分低糖DMEM， 10%胎牛血清，二甲基亚砜，butylatedhydroxyanisole (BHA， Sigma-Aldrich)200 u M， e -NGF25ng/mL。
诱导培养基b成分低糖DMEM88X，胎牛血清10%， 0-NGF25ng/niL。 诱导方法以3X 107cm2的密度接种细胞，加诱导培养基a培养两天，后换为诱
导培养基b，继续培养15-30天。培养结束后，通过反转录聚合酶链式反应(检测引
物为正向引物 5' AGAGGGGAATTCCTGGAG 3'和反向弓|物 5'
CTGAGGACCAGGACTCTCTA3')及免疫荧光技术(检测抗体为抗人nestin抗体，
Sigma公司)即可检测到细胞内特定蛋白nestin的表达。 (2)肝细胞诱导分化 诱导培养基成分低糖DMEM，胎牛血清10%，硫代甘油300yM， 20ng/mLHGF，
10ngAiL肿瘤抑制因子，10—7M地塞米松，10ng/mLFGF4， IX ITS (胰岛素铁硒传递蛋白)。
诱导方法以5X107cm2的密度接种细胞，加诱导培养基培养，三天换液一次， 培养两周，把细胞消化传代于铺有两层胶原凝胶的培养皿中(胶原凝胶上下两层均为 1.0mg/mL)，持续培养两周以上。结果可检测到肝细胞相关标志如甲胎蛋白(AFP)、白 蛋白(Alb)、细胞角蛋白18(CK18)的表达。 (3)成骨样细胞诱导分化
诱导培养基成分低糖DMEM， 10%胎牛血清，青霉素50U/mL及链霉素50U/mL， Vc50yM，地塞米松O. lyM, P-甘油磷酸10mM。
诱导方法以3000cells/cr^的密度接种细胞，加诱导培养基培养，三天换液一 次，培养十一天。结果可检测到成骨细胞相关标志如碱性磷酸酶(AKP)和骨桥蛋白(OPN) 的表达。
上述检测结果显示在特定的诱导培养基作用下，筛选后的人羊水干细胞可以向神 经元样细胞、肝样细胞及成骨样细胞代表三个不同胚层细胞的诱导分化，表明SSEA-4 阳性细胞具有很好的多向分化潜能。
6、致瘤实验
将筛选后的人羊水干细胞接种于裸鼠皮下，接种细胞数量为1X1()7个细胞，结果 2个月后仍无肿瘤形成，表明SSEA-4阳性细胞没有明确的致瘤效能，临床治疗应用安 全可靠。
上述检测结果表明用本发明的方法可得到性状均一，具有良好的增殖和诱 导分化能力，G0/G1期细胞比例在90X以上，并能表达人全能干细胞特异性标 志物特殊期胚胎抗原-4、 Nanog及Oct-4的人羊水干细胞，且具有良好的临床应 用前景。
权利要求
1、一种分离纯化人羊水干细胞的方法，是以特殊期胚胎抗原-4为筛选标志，从贴壁培养的人羊水干细胞混杂细胞群中分离纯化出性状均一的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于通过免疫磁珠筛选方法从贴壁培养的人羊水干细胞中分离纯化出性状均一的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干 细胞。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述免疫磁珠筛选方法是向人羊水干细胞混悬液中添加特殊期胚胎抗原-4单抗，再加能与特殊期胚胎抗原-4单抗结 合磁珠，然后把人羊水干细胞混悬液置于外带磁场的过滤柱中过滤，滤完后撤除磁场， 收集过滤柱内细胞，得到特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述贴壁培养的人羊水干细胞由 人羊水组织通过贴壁培养获取人羊水干细胞，并常规传代2-3代获得。
5、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中还包括将收集的特殊 期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞置于人羊水干细胞培养基中进行传代扩增培 养的步骤。
6、 根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于还可对分离纯化的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞进行生物学性状检测，包括流式细胞术检测、 人全能干细胞特异性标志物Nanog及Oct-4检测、核型分析、多向诱导分化及致瘤实 验。
7、 用权利要求1-6任一项所述方法得到的性状均一的特殊期胚胎抗原-4阳性表 达的人羊水干细胞。
全文摘要
本发明公开了一种分离纯化人羊水干细胞的方法。该方法是以特殊期胚胎抗原-4为筛选标志，从贴壁培养的人羊水干细胞中分离纯化出性状均一的特殊期胚胎抗原-4阳性表达的人羊水干细胞。实验结果表明用本发明的方法可得到性状均一，具有良好的增殖和诱导分化能力，G0/G1期细胞比例在90％以上，并能表达人全能干细胞特异性标志物特殊期胚胎抗原-4、Nanog及Oct-4的人羊水干细胞。本发明提供了一条获得人羊水干细胞的新途径，并为人羊水干细胞的深入应用奠定了基础。
文档编号C12N5/08GK101418284SQ200810227670
公开日2009年4月29日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者慧 刘, 刘大庆, 伟 师, 李保伟, 裴雪涛 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所