专利名称：一种纯化cho细胞表达尿激酶原的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程重组尿激酶原的纯化方法，具体地说是从CHO细胞(Chinese Hamster Ovary cells，中国仓鼠卵巢细胞)表达尿激酶原的细胞培养液中纯化尿激酶原的 方法。
背景技术：
血栓病是一种严重危害人类健康的常见病，我国每年死于心脑血管疾病的人数 仅次于癌症，尿激酶原(prourokinase，Pro-uk)也称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂，与 t-PA (tissue plasminogen activator，组织型纤溶酶原激活剂)一样是第二代溶栓药物， 特异性强，副作用小，再栓塞率低。Pro-uk是一种单链丝氨酸蛋白酶原，由411个氨基酸残基组成的糖蛋白，分子质 量54kD，等电点在9. 0左右。有12对二硫键，一个N-糖基化位点(Asn302)和一个0-糖基 化位点(ThrlS)，具有三个蛋白结构区(1)类表皮生长因子区(EGF-like区，第5-49位氨 基酸残基组成)，(2)kringle区(50-136aa) ； (3)丝氨酸蛋白酶活性部位区，其活性中心由 氨基酸 His204、Asp255 和 ser356 构成。目前，已经能够通过基因重组技术在多种基因工程细胞如大肠杆菌、哺乳动物、酵 母、昆虫等细胞生产尿激酶原。已经有不同的方法纯化尿激酶原，这些方法用到了 离子交 换、凝胶过滤、亲和层析等方法的组合，在中试生产过程中我们发现，当细胞培养上清中表 达的尿激酶原活性较低时这些纯化方法很难除去分子量接近尿激酶的细胞杂蛋白，为了提 高产品质量和生产效率我们发展了用疏水层析的纯化方法与离子交换、凝胶过滤的组合， 这种方法能够有效地除去CHO细胞分泌到细胞培养上清的细胞蛋白，获得符合纯度超过 95%以上的合格产品。
发明内容
本发明的目的是改进现有技术的缺陷而提供一种可以有效纯化CHO细胞表达尿 激酶原的方法，该方法简单实用，能够有效地除去CHO细胞分泌到细胞培养上清的细胞蛋 白，获得符合纯度超过95%以上的合格产品。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案具体纯化步骤为1、阳离子交换层析用阳离子交换介质Streamline-SP扩张床，从CHO工程细胞培 养上清中回收尿激酶原；2、疏水层析用丁基高流速琼脂糖凝胶介质(Butyl-S印harose 4 fast flow)除 去1纯化的产品中的部分杂蛋白；3、凝胶过滤用S-200型葡聚糖聚丙烯酰胺高效凝胶(S印hacryl S-200)凝胶色 谱进一步纯化上述2收集的尿激酶原，同时去除硫酸铵。本发明的优点与效益
经过这三步纯化步骤尿激酶原的纯度用十二烷基硫酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)分析其纯度能够达到95%以上，产品的回收效率在60_70%，在产品回收效率 不降低的情况下，能够将细胞培养上清活性较低时的尿激酶原纯化得到合格产品，减小了 细胞培养的压力，也减少了产品的损失，产品的质量和产品的产量得到了提高，该纯化方法 较以前的方法更具优势。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1阳离子交换层析洗脱蛋白峰型；图2阳离子交换层析获得的尿激酶原SDS-PAGE图谱；图3疏水层析获得的尿激酶原SDS-PAGE图谱；图4SehaCryl S-200凝胶过滤蛋白峰和硫酸铵盐峰；图5凝胶过滤后获得的尿激酶原SDS-PAGE图谱。
具体实施例方式实施例1产尿激酶原CHO工程细胞的培养从液氮中取出人尿激酶原工程细胞株CL-IlG工程细胞复苏，在小方瓶中培养，至 细胞贴壁长满后，转入转瓶中培养，细胞贴壁长满后，转入搅拌瓶中培养至Pro-uk活性达 2000IU/ml细胞上清时，转入5L生物反应器中加入多孔微载体；当反应器中细胞培养上清 至3000-6000IU/ml细胞培养上清时，每天能更换培养基1_1. 5个工作体积时，转入30L的 生物反应器中。同样加入多孔微载体并定期部分更换，使细胞不断繁殖生长，采用无血清培 养基，当细胞培养上清活性达到3000IU/ml以上时收集细胞上清，每天更换上清一个工作 体积以上，连续培养收获超过50d。实施例2阳离子交换层析从细胞培养上清中获得尿激酶原粗产品先将CL-IlG工程细胞培养液，在4°C静置后，虹吸细胞培养上清，底部培养液通过 3000g，4°C离心15min，除去细胞及碎片；然后上清液用6mol HCl调至pH 5. 8 ；用去离子水 将扩张床扩至3倍柱床体积，再用0. Olmol磷酸缓冲液，pH5. 8，平衡Streamline-SP阳离子 扩张床色谱柱3个柱体积，然后将细胞培养上清以流速30-60ml/min通过色谱柱，当细胞培 养上清全部通过色谱柱后，再用平衡缓冲液冲洗色谱柱3-5个柱体积，然后改用0. 01mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7. 0含0. lmol/L氯化钠)和0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(含lmol/L氯化 钠，PH 7.0)进行梯度洗脱。用波长280nm的紫外检测仪监测蛋白吸收峰，收集洗脱蛋白吸 收峰组分，洗脱的蛋白峰型如图1 ；将收集的蛋白作SDS-PAGE，结果如图2所示。该步将产 品浓缩100倍，产品的活性回收率超过98%以上。实施例3疏水层析去从粗产品中除去部分细胞蛋白将阳离子交换获得的蛋白用0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液pH7. 0，稀释1倍，加入硫 酸铵至lmol/L，疏水层析填料Butyl-S印harose 4 fast flow，用水洗2-3个柱床体积，然后用lmol/L的硫酸铵(含0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液pH7. 0)平衡2_3个柱床体积，将加 入lmol/L硫酸铵的样品上疏水层析填料。样品上完后用平衡柱床的lmol/L的硫酸铵继 续冲洗至紫外检测仪到基线。然后用0. 4mol/L的硫酸铵(含0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液 PH7. 0)洗脱样品，用波长280nm的紫外检测仪监测蛋白吸收峰，收集洗脱蛋白吸收峰组分， 洗脱的蛋白峰型如图3。将收集的蛋白作SDS-PAGE，结果如图4所示。该步将产品中的CHO 细胞杂蛋白去除接近尿激酶原分子量的部分，产品的活性回收率在90%左右。实施例4凝胶过滤精细纯化尿激酶原将Sehacryl S-200凝胶色谱柱置于4°C，用0. Olmol/L磷酸盐缓冲液(含0. 4mol/ L氯化钠，pH 7.0)平衡凝胶柱；然后将疏水层析收集的尿激酶原以不超过5%体积上样，继 续用平衡缓冲液淋洗色谱柱，用波长280nm的紫外检测仪监测蛋白吸收峰，分别收集峰头、 主峰和峰尾，该部活性回收率在60-70%。如图5所示分别将蛋白和硫酸铵完全分开，将收 集的蛋白作SDS-PAGE，结果如图5所示。纯度测定采用SDS-PAGE结合凝胶扫描分析方法，纯度扫描分析表明，纯化后的 Pro-uk纯度超过95%。回收率测定采用上样纯化后的蛋白总活性与上样纯化前的蛋白总 活性的比值为活性回收率，整个纯化过程的回收率在50-60%，活性测定采用琼脂糖-纤维 蛋白溶圈法。
权利要求
一种纯化CHO细胞表达尿激酶原的方法，其特征在于，该方法包括利用阳离子交换层析从CHO细胞培养上清中回收尿激酶原的步骤；利用疏水层析从粗产品中除去部分杂蛋白的步骤；利用凝胶过滤进一步纯化尿激酶原的步骤。
2.一种纯化CHO细胞表达尿激酶原的方法，其特征在于，该方法包括用 Streamline-SP扩张床阳离子交换直接从CHO细胞培养上清中捕获尿激酶原；用 Butyl-Sepharose 4 fast flow疏水层析从粗产品中除去部分细胞蛋白；用SehacrylS-200 凝胶过滤精细纯化尿激酶原。
3.根据权利要求2所述的纯化CHO细胞表达尿激酶原的方法，其特征在于，所述用 Streamline-SP扩张床阳离子交换直接从CHO细胞培养上清中捕获尿激酶原的步骤为先 将CHO基因工程细胞培养液，在4°C静置后，虹吸细胞培养上清，底部培养液通过3000g，4°C 离心15min，除去细胞及碎片；然后上清液用6molHCl调至pH 5. 8 ；用去离子水将扩张床扩 至3倍柱床体积，再用0. Olmol, pH 5. 8的磷酸缓冲液，平衡Streamline-SP阳离子扩张床 色谱柱3个柱体积，将细胞培养上清以流速30-60ml/min通过色谱柱，当细胞培养上清全部 通过色谱柱后，再用平衡缓冲液冲洗色谱柱3-5个柱体积，然后改用0. Olmol/L磷酸盐缓冲 液(pH 7. 0，含0. lmol/L氯化钠)和0. 01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7. 0，含lmol/L氯化钠) 进行梯度洗脱，用波长280nm的紫外检测仪监测蛋白吸收峰，收集洗脱蛋白吸收峰组分。
4.根据权利要求2所述的纯化CHO细胞表达尿激酶原的方法，其特征在于，所述用 Butyl-Sepharose 4 fast flow疏水层析从粗产品中除去部分细胞蛋白的步骤为将阳离 子交换获得的蛋白用0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液pH 7. 0，稀释1倍，加入硫酸铵至lmol/L， 疏水层析填料8肚71-3印11￡11~0紹4 fast flow，用水洗2_3个柱床体积，然后用lmol/L的硫 酸铵平衡2-3个柱床体积，将加入lmol/L硫酸铵的样品上疏水层析填料；样品上完后用平 衡柱床的lmol/L的硫酸铵继续冲洗至紫外检测仪到基线；然后用0. 4mol/L的硫酸铵洗脱 样品，用波长280nm的紫外检测仪监测蛋白吸收峰，收集洗脱蛋白吸收峰组分，将收集的蛋 白作 SDS-PAGE。
5.根据权利要求2所述的纯化CHO细胞表达尿激酶原的方法，其特征在于，所述用 Sehacryl S-200凝胶过滤精细纯化尿激酶原的步骤为将Sehacryl S-200凝胶色谱柱置 于4°C，用0. Olmol/L磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱；然后将疏水层析收集的尿激酶原以不超 过5%体积上样，继续用平衡缓冲液淋洗色谱柱，用波长280nm的紫外检测仪监测蛋白吸收 峰，分别收集峰头、主峰和峰尾。
全文摘要
本发明公开了一种从CHO细胞表达尿激酶原的细胞培养液中纯化尿激酶原的方法。该方法包括阳离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤的有机组合，能够有效的去除尿激酶原产品中的杂蛋白，得到纯度超过95％以上的尿激酶原产品。该方法能够有效的提高产品生产效率和质量。
文档编号C12N9/72GK101880655SQ20101016437
公开日2010年11月10日 申请日期2010年5月6日 优先权日2009年5月6日
发明者刘红, 张正光, 李世崇, 肖成祖, 胡显文, 胥照平, 陈昭烈, 高丽华 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所