专利名称：流行性出血热原代地鼠肾细胞多价纯化疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属生物制药领域，涉及流行性出血热疫苗，特别是涉及应用GHKC为细胞基质和以适应于GHKC的EHF病毒株为毒种，生产流行性出血热多价疫苗及纯化的方法。
流行性出血热(EHF)国际上称肾综合征出血热(HFRS)，是以鼠类作为传播媒介的自然疫源性疾病，是一种严重危害人民健康的病毒性急性传染病。近年来，全世界每年有约15万病例，死亡率达3％～10％。流行疫区在不断扩大，重症型疫区主要发生在亚洲和歇洲东部，轻症型遍及全世界。在中国，已有28个省，市、自治区有本病的发生和不同程度的流行，1986年曾发生11万病例，对人民的健康、生命安全和国民经济的发展均造成严重影响。为此，对疫区高危人群和将进入疫区工作或旅游的人们进行特异性免疫接种，是降低发病率，有效控制本病暴发流行的根本途径。
自1978年韩国李镐汪等首次成功地分离到肾综合征出血热病毒以后(Lee HW,et al,Infect Dis,1978.137,298)，国内外许多研究者都着手进行流行性出血热疫苗的研究。韩国李镐汪首先研制出乳鼠脑纯化疫苗(LeeHW.et al,Archvirol,1990 [supplⅠ],35)，朝鲜金洛济等研制出白鼠和地鼠乳鼠脑纯化疫苗(金洛济等，中华实验和临床病毒学杂志，1991,5,487)，我国在流行性出血热疫苗研究方面进展也较快。兰州生研所用分离自黑线姬鼠的LR1株(Ⅰ型)病毒研制出鼠脑纯化疫苗(孙柱臣等，中国媒介生物学及控制杂志，1992.3<特刊7期>,203).上海生研所和浙江省防疫站用分离自病人血清的Z10株(Ⅰ型)病霉研制出长瓜沙鼠肾细胞疫苗(朱智勇等，中国媒介生物学及控制杂志，1992.3<特刊7期>,279)，流研所用分离自黑线姬鼠的A16株(Ⅰ型)病毒研制了鸡胚细胞疫苗(严玉臣等，中国媒介生物学及控制杂志，1992,3,166)，长春生研所和中国预防医学科学院病毒学研究所用分离自罗赛鼠的L99株(Ⅱ型)病毒研制出地鼠肾细胞疫苗(宋干、黄永成等，病毒学报，1991,7(2),102～106)，但上述的疫苗均是单价疫苗(Ⅰ型或Ⅱ型)，而我国多数是以Ⅰ型或Ⅱ型为主的混合型疫区。
1995年5月，世界卫生组织(WHO)在芬兰赫尔辛基召开了汉坦病毒疫苗研制会议，会议提出“汉坦病毒疫苗的最终目标应是一种能防御各种致病汉坦病毒的多价疫苗”(《国外医学》预防、诊断、治疗用生物制品分册，1997,20(1),27)，韩国从l993年开始用Ⅰ型疫苗和Ⅲ型疫苗(普马拉病毒、PUUV)联合研究双价疫苗，但未见人体临床观察的报道。1993年，我国宋干、黄永成等研制出包括出血热Ⅰ型和Ⅱ型的地鼠肾细胞双价疫苗(宋干等，病毒学报，l993,9(2),144～l51),1997年浙江省防疫站和杭州天元生物药业公司联合研制出原代沙鼠肾细胞(Ⅰ型、Ⅱ型)双价疫苗(董关木，中国公共卫生，1997,13(8),451)，这两种疫苗均含较多的细胞杂蛋白。
本发明的主要目的是提供一种以金黄地鼠肾细胞作为感染病毒的细胞基质，以适应于GHKC的流行性出血热病霉JR-C-1,PS6和L99为毒种，制备流行性出血热双价(或多价)灭活疫苗的方法。该方法包括地鼠肾单层细胞的制备，用已知病毒JR-C-1,PS6和L39感染地鼠肾细胞，收获病毒液和疫苗配制等。
本发明另一个主要目的是提供一种对流行性出血热双价(或多价)灭活疫苗半成品进行纯化的方法，该方法是将半成品疫苗液经高速离心，盐析沉淀，超滤浓缩和柱层析等步骤进行纯化。
本发明的最终目的是提供一种抗原性广谱，抗原含量高，已去除大部分细胞杂蛋白，适合于全国各EHF疫区使用，并且十分安全有效的流行性出血热多价纯化疫苗。
一．流行性出血热疫苗毒种的制备L99株，将分离自江西罗赛鼠的肺组织标本[L99毒株，引自《江西医学院学报》l984,(3),1]，先于2～4日龄乳鼠脑腔接种传代适应，当病毒感染乳鼠脑腔LD50达到8.0Log时，转种于地鼠肾细胞，并以终末稀释传代方法连续传10代以上，进行最后一次传代时，待毒株感染地鼠肾细胞7-9天后，用免疫荧光法(IFA)检查细胞内病霉抗原，当感染细胞IFA达到+++～++++时收获病毒液，加10％～20％牛血清分装后，置-60℃保存。毒种在地鼠肾细胞进行感染性消定，滴度≥8.5log TCID56/ml，支原体和无菌试验均为阴性。同时应用单克隆抗体分型试剂确定毒种的抗原性和血清型的特异性，并且证明毒种内无外源因子。以此毒种作为生产流行性出血热疫苗的毒种。
JR-C-1株，将分离自吉林省延边地区的发病家兔的肾组织标本[即JR毒株，引自《中国公共卫生学报》1990,9(2),74]，如同L99株毒种制备方法一样进行适应传代后，再经空斑克隆法挑选出GHKC感染滴度≥8.5log TCID50/ml的克隆株JR-C-1，在GHKC上增殖和一系列检定合格后作为生产用毒种。
PS6株，将分离自西安临床急性期病人的血清标本，在乳鼠脑内连传三代，得到特异性荧光阳性的毒株[即PS6株，引自姚树元等，PS-6株汉坦病毒Ⅰ型的生物学性状研究(硕士研究生毕业论文)，1996年]。将此毒株在GHKC上连续增殖传7代，使其感染性滴度达8.5log TCID50时，将收获的病毒液进行-系列检定合格后，作为生产用毒种。
二．疫苗生产1、制备地鼠肾细胞选用10-14日龄健康的金黄地鼠，以无菌手续取出肾脏，剪碎后加入0.125％胰酶，置4-8℃18～20小时，弃去胰酶液，用含有0.2％乳白蛋白水解物Earle’s液并加有8％小牛血清的营养液分散细胞，制成细胞悬液，注人10立升培养瓶内，每瓶注入细胞悬液1000～1500ml。将细胞培养瓶置37℃恒温室，旋转培养2-3日，可形成均匀致密的细胞单层。
2、病毒接种与疫苗半成品收获方法一，选择细胞单层生长良好的培养瓶供感染病毒。如果生产Ⅰ型疫苗需感染JR-C-1或PS6毒种，如果生产Ⅱ型疫苗则需感染L99毒种。感染病毒量为3～4log TCID50/ml。感染用液为2％牛血清，0.2％乳白蛋白水解物Earle’s液。将已感染病毒的细胞培养瓶置干32～35℃恒温室内旋转培养1-3天，用Earle’s液冲洗细胞，然后再加入0.1％人白蛋白0.07‰半胱氨酸Earle’s液浸泡20小时左右后，再用同法冲洗一次，然后再换入0.2％人白蛋白199综合培养液，置32～35℃恒温室继续培养，感染病毒后7-9天收获，先收集培养液，再将细胞撞下，置-60℃冻融后再与培养液混合，通过绢布过滤，抽样做无菌试验和病毒滴定。将滤过后的培养液和细胞液混合液加入1/4000甲醛溶液(灭活剂)，先置33～37℃24小时后，转置2-8℃灭活，此即为灭活疫苗的半成品。
方法二，按方法一将细胞感染病毒后，置于32～35℃培养1-3天，换人含2～4％小牛血清199综合培养液，置32～35℃恒温室继续培养，感染病毒后7-9天收获，再加入2～4％小牛血清199综合培养液，置32～35℃继续培养4～6天，第二次收获病毒液。两次收获的病毒液均抽样做无菌试验和病毒滴定，并按方法一所述方法进行灭活。
3、疫苗配制按方法一制备的疫苗半成品，按新生物制品检定规程要求进行原液病毒滴度测定、抗原量测定、残余牛血清含量测定，灭活安全试验等检验合格后，取Ⅰ型和Ⅱ型疫苗半成品等量混合可制成流行性出血热双价疫苗，效力试验合格后，即可分装进行成品检定。包括，无菌试验，PH值应为7.0-8.0，氢氧化铝含量为＜0.7mg/ml，游离甲醛含量＜0.01％，硫柳汞含量＜0.01％，小鼠安全试验4只鼠应健存。
按方法二制备的疫苗半成品，以两个Ⅰ型毒种制备的半成品疫苗液占50％,L99毒种制备的半成品疫苗液占50％的比例配成多价疫苗半成品。
4、疫苗的纯化此方法适合于流行性出血热双价疫苗和多价疫苗的纯化。
选合格的半成品疫苗液，经高速离心(7000rpm40分钟)去掉大部分细胞碎片，加1/50M醋酸锌2～8℃盐析30分钟，2000～4000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用饱和EDTA溶解，用3MTris调PH至7.6～7.8,3000rpm离心30分钟，上清液经超滤进行浓缩和透析(透析液为PH7.2 0.2MPB)，之后加到用PH7.2 0.2MPB平衡的Sepharose gel柱中进行层析，用A280nm监测，PH7.2 0.2MPB洗柱，收集第一峰部分、留样后加防腐剂(1,20000硫柳汞)放4℃保存，纯化样品检测包括，残存牛血清蛋白含量测定(＜50ng/ml)、抗原量测定(ELISA≥1.128)，总蛋白测定(Lowry’s法)，效力检定(PRXT≥1.20)，上述检测合格后，纯化疫苗进行除菌过滤，加Al(OH)3到0.5mg/ml。然后做无菌试验，热原试验，合格后进行分装，即为成品。成品检定包括无菌试验、毒性试验、甲醛测定、硫柳汞测定，Al(OH)3测定，PH测定等。质量指标以灭活疫苗指标为准，纯化疫苗的杂蛋白去除率达95％以上。
本发明制备的出血热纯化疫苗可以解决现有出血热疫苗型别单一、抗原量较低、杂蛋白多、接种后易产生副反应和免疫效果不十分满意的问题，该疫苗适用于我国各EHF疫区使用。
实施例一时间，1998年6月8日～9月19日取12-14日龄的金黄地鼠，处死后用0.3％新洁尔灭消毒，无菌取肾，剪碎，洗净血球，加入PH8.0的0.125％的胰酶液，置8℃进行冷消化，18-20小时后取出。弃去胰酶液，用Earle’s液洗涤，加少量玻璃珠轻摇5-6次，收集各次悬液，经2层纱布过滤，使细胞悬于生长液中(生长液为8％牛血清乳白蛋白液)，摇匀后分装到10立升瓶中，每瓶1000～1500ml，置37℃旋转培养，三日后，细胞长成致密单层。
选取已长成致密单层的细胞培养瓶，弃去原瓶内的生长液，将毒种稀释于2％牛血清的乳白蛋白液中，振摇均匀后分装于培养瓶中，每瓶1000ml。置33℃～35℃旋转培养2天，弃去病毒液，用Earle’s液喷洗，然后加入浸泡液，每瓶1000ml。浸泡液为0.07‰半胱氨酸Earle’s液，含0.1％人白蛋白，浸泡20小时后，弃去浸泡液，用同上方法再喷洗一次，然后换人细胞维持液1000ml/瓶。维持液为199综合培养基含0.2％人白蛋白。将细胞瓶置33～35℃旋转培养，8天后进行收获，先收各瓶培养液800毫升，留存200ml，将细胞瓶置-60℃冻5～6小时后取出，振摇细胞使其破碎，然后将培养液与细胞液混合过滤。按液量加入福尔马林至1,4000，硫柳汞1,20000，充分振摇后置37℃24小时，再转置4℃14天，每天振摇2次。安全试验合格后将Ⅰ型疫苗液和Ⅱ型疫苗液配制成双价疫苗(1∶1比例)，加氢氧化铝佐剂至0.5mg/ml。上述疫苗为半成品，经无菌试验、病毒滴定、抗原量测定、残余牛血清蛋白含量测定，病毒灭活安全试验，效力试验等检定合格后，进行分装，每支1.2毫升，分装后进行成品检定，成品检定包括无菌试验，外观检查，PH值，氢氧化铝含量、游离甲醛含量、硫柳汞含量、毒性试验等，成品检定合格后即为流行性出血热双价疫苗。
实施例二时间1998年6月29日-10月30日制备地鼠肾细胞和感染病毒同实施例一．感染病毒的细胞置33～35℃旋转培养2天，弃去感染液，换入维持液1000ml，维持液为199综合培养液含2～4％小牛血清，将细胞瓶置33～35℃旋转培养，8天后收获培养液，再加入相同的维持液，33～35℃继续培养4天，第二次收获，两次收获的疫苗原液抽样后，按液量加入福尔马林至1,4000，如实施例一方法进行灭活后，按JR-C-1疫苗原液和PS6疫苗原液占50％，L99疫苗原液占50％的比例合并配成多价疫苗原液。之后，经7000rpm40分钟离心去掉细胞碎片，按1/5M浓度加入醋酸锌，2-8℃盐析30分钟后，3000rpm离心30分钟，将沉淀用饱和EDTA溶解，再用3MTris液调PH7.6-7.8,3000rpm离心30分钟，上清液经超滤浓缩透析后(透析液PH7.2 0.2MPB)上Sepharose gel柱进行层析纯化，以A280nm监测，PH7.2 0.2MPB为洗脱液，收集第一峰。经0.2μm孔径滤器除菌过滤后，留样，加硫柳汞防腐(1,20000)放4℃保存，纯化的样品进行无菌试验，抗原量测定，残存牛血清蛋白含量测定，总蛋白量测定，热原质试验等检定合格后，将纯化的疫苗进行适当稀释，加入AL(OH)3至0.5mg/ml，进行效力检定，合格后，分装，进行成品检定，经过无菌试验，外观检查，PH值，氢氧化铝含量、游离甲醛含量，硫柳汞含量，动物安全试验等检定合格后，即为流行性出血热多价纯化疫苗，
权利要求
1．一种安全有效的适合各EHF疫区使用的流行性出血热原代地鼠肾细胞多价纯化疫苗，该疫苗制备方法包括应用对EHF病毒敏感的金黄地鼠肾细胞(GHKC)作为感染病毒的细胞基质，分别感染JR-C-1、PS6和L99毒株，制备疫苗半成品，之后，按一定比例配制成多价疫苗，并对疫苗进行纯化，其特征在于该疫苗用上述的三个病毒株制备。
2．根据权利要求1的方法，其中所说的GHKC是指取10-14日龄金黄地鼠肾脏，用胰酶消化后，制成细胞悬液，在细胞培养瓶内旋转培养，制备的单层细胞。
3．根据权利要求1的方法，其中所说的制备疫苗半成品，是指在一次制备的细胞培养瓶中，用一定配方的维持液达到两次收获病毒原液的方法。
4．根据权利要求1的方法，其中所说的对疫苗进行纯化，是指将疫苗半成品经高速离心后，用盐析方法沉淀病毒抗原，经超滤浓缩透析后，再经Sepharose gel柱层析纯化。
全文摘要
本发明流行性出血热原代地鼠肾细胞多价纯化疫苗属于生物制药领域。该疫苗以三个适应于GHKC的EHF病毒株L99、PS
文档编号A61K39/12GK1236646SQ9910798
公开日1999年12月1日 申请日期1999年6月9日 优先权日1999年6月9日
发明者韩亮, 王琪, 惠连, 赵丽红, 王晓宏, 冉姝, 郝富勇, 王伟, 回良杰, 赵健, 姜惠贤, 马军 申请人:卫生部长春生物制品研究所