专利名称：一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法
技术领域：
本发明属生物医学工程中人类和哺乳动物成体干细胞分离纯化技术领域，具体涉及一种人类和哺乳动物皮肤表皮干细胞的分离纯化、扩增等方法。
背景技术：
表皮干细胞(Epidermal stem cells，EpiSCS)是具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，它的正常增殖和分化是维持皮肤及其附属器(汗腺毛发、皮脂腺)结构和功能完整性的基本要求。在生理条件下，表皮干细胞通过不对称分裂方式分化为一个干细胞和一个短暂扩充细胞(transit amplifying cellsTA细胞)，TA细胞再经过多次分裂后分化为有丝分裂后细胞(Post-mitotic cells)及终末分化细胞(terminally-differentiated cells)，以补充表皮细胞不断更新的需要。研究表明表皮干细胞不仅能在体外长期传代培养，并保持其增殖分化潜能(Dunnwald et al，Exp Dermatol，2001，1045-54.Papini et al.stemcells，2003，21481-494)，而且，在一定环境条件下还表现出与胚胎干细胞相似的分化潜能[Liang et al，stem cells，20022021-31]。因此，获得纯化的表皮干细胞不仅可为构建有生理功能的人工皮肤提供种子细胞，而且可用于基因治疗和转基因动物的生产。然而，分离纯化表皮干细胞至今仍是一个难题。国内外学者普遍采用酶消化法，获得含有表皮干细胞的混合细胞群。根据表皮干细胞对特异底物的粘附性[Jones.et al.cell.1993，73(4)713-724；Bickenbach et al，Exp cellRes.1998.224(1)184-185]，或用一些表皮干细胞的相关标志物或特殊染色剂对表皮干细胞进行标记，用流式细胞仪进行分选[Li et al，PNAS，1998，95(7)，3902-3907，Tani et al，PNAS，2000，97(20)10960-10965。Dunnwald et al，Exp Dermatol 2001，1045-54]。由于还没有找到一种能精确反映表皮干细胞的特异性分子标记，上述分离方法很难将表皮干细胞与TA细胞完全分开。探索一种有效安全的分离纯化表皮干细胞的方法仍是本领域的技术人员面临的一大难题[AlonsoL and Fuchs E，www.PNAS.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1734203100]。
发明内容
为了克服现有技术中采用的组织块培养法和酶消化法获得的是混合细胞群的缺点，根据表皮干细胞克隆性生长的特性，本发明的目的是提供一种采用组织块培养法与克隆筛选法相结合，不借助任何化学试剂及复杂仪器而达到安全有效分离纯化表皮干细胞的方法。
为了实现上述目的，本发明采取如下的技术解决方案一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤1)首先将已脱离人或动物的皮肤，置于含青链素各500U/ml的生理盐水中带回实验室，在超净工作台上用生理盐水冲洗，去血污及毛发；2)在解剖镜下将皮肤与皮下组织分开，将皮肤切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小块，按上皮面朝上贴于直径为60mm玻璃平皿中，每皿3-4块，加培养基；所述培养基的配方为90％Medium199+10％FBS+10μg/mlinsulin+10ng/mL LIF+1～1.5μg/mL氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；3)置于CO2培养箱中培养，培养箱内的条件为5％CO2，饱和湿度，37℃，每两天换液一次；4)经3～4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7～12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长，待这些克隆直径达约100～150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20％Trypsin处理，用玻璃针将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用无血清培养基培养；无血清培养基的配方为100％F12+(1％～1.2％)BSA+(20～25ng/ml)EGF+5ug/ml insulin+(15～20ng/ml)IGF-1+20ng/mL LIF+0.05μg/mL氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；5)待细胞增殖达70～80％融合时，用0.2％Trypsin+0.02％EDTA进行消化，传代培养，即用上述无血清培养基将关中奶山羊表皮干细胞传25代冻存，或用上述无血清培养基将人类表皮干细胞传15代冻存；6)对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测CK19，β1-integrin-P63，α6-integrin均为阳性，即证明所分选的是纯化的表皮干细胞。
本发明在皮肤组织块培养过程中采用自行设计的培养基能有效抑制成纤维细胞的生长，从组织块四周生长出均一的上皮样细胞，诱发表皮干细胞迁移出原来的微环境，在新生成的上皮样细胞层上重新聚集生长。这类克隆性生长的细胞与其依赖的饲养层细胞有明显形态学上的差别。借助解剖镜和玻璃针就能将其挑选出来，进行单独扩增培养。
本发明克服了传统酶消化法的缺点，直接利用干细胞的生物学行为获得纯化的表皮干细胞，是一种有效安全的分离纯化表皮干细胞的方法，可用于人类和哺乳动物表皮干细胞的分离纯化。
图1是组织块培养获得关中奶山羊原代表皮干细胞克隆，X200；图2是第二代关中奶山羊表皮干细胞α6-integrin阳性，x100图3是第二代关中奶山羊表皮干细胞β1-integrin阳性，X200；图4是第二代关中奶山羊表皮干细胞CK19阳性，X100；图5是第二代关中奶山羊表皮干细胞P63阳性X400。
以下结合实施例对本发明作进一步的描述。
具体实施例方式
本发明是基于发明人在长期实验研究中发现皮肤组织在申请人设计的培养基中培养7～12天后，从皮肤组织中迁移出来一些体积小、核质比高、折光性强的球形细胞，在铺路石样生长的上皮细胞层上增殖形成克隆，其形态特征和生长方式与分化的上皮细胞有明显差别，因此而发明的一种新的分离纯化表皮干细胞的方法，具体包括下列步骤1)首先将从医院或屠宰场收集的人或动物的皮肤，置于含青链素各500U/mL的生理盐水中带回实验室，在超净工作台上用生理盐水冲洗，去血污及毛发；2)在解剖镜下(Olmpus Tokyo 305047，Made In Japan)将皮肤与皮下组织分开，将皮肤切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小块，按上皮面朝上贴于直径为60mm玻璃平皿或塑料皿中，每皿贴3～4块，在37℃恒温台上放置15～20分钟后加培养基1～2mL；培养基的配方为90％Medium199(Gibco，Lot No.1129880)+10％FBS(胎牛血清，郑州市佰安生物工程有限公司，Lot1120193)+10μg/ml insulin(胰岛素，购自北京鼎国生物技术有限责任公司，http//www.digguo.com，Sigma分装，原产品编号为15500)+10ng/mL LIF(白血病抑制因子，Stem CellTechnologies，Lot 2A083629)+1～1.5μg/mL氢化可的松+100U/mL青霉素(购自哈药集团制药总厂，批号B01124412)+100U/mL链霉素(硫酸连霉素购自华北制药股份有限公司，批号010724)；3)置于CO2培养箱(WTB CO2培养箱，美国)中培养，培养箱内的条件为5％CO2，饱和湿度，37℃，每两天换液一次。
4)经3～4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7～12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长，待这些克隆直径达约100μm～150μm时，在解剖镜(Olympus Tokyo，305047，Made in Japan)下用玻璃针将这些细胞克隆与其下面的滋养层细胞分离，用吸胚管将细胞克隆移到盛有0.5mL 0.20％Trypsin(胰蛋白酶)的检胚杯中处理3～5分钟后，用培养液中和。在解剖镜下用玻璃针将克隆离散成单个细胞或小细胞团。用吸胚管将细胞吸入铺有明胶(Sigma，Lot50K02505)的3.5cm塑料皿(CELLSTAR Lot 02030151)中，用无血清培养基培养；无血清培养基的配方为100％F12(Initrogen CorporationLot1116568)+(1％～1.2％)BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT 716H9310)+(20～25ng/ml)EGF(表皮细胞生长因子，Sigma，E-mailtechserv@sial.com，Product Number E 9644)+5ug/ml insulin(胰岛素)+(15～20ng/ml)IGF-1胰岛素类生长因子-1，SigmaE-mailtechserv@sial.com，product Number I3769)+20ng/mLLIF(StemCell Technologies，Lot 2A083629)+0.05μg/ml氢化可的松+100U/mL青霉素(购自哈药集团制药总厂，批号B01124412)+100U/mL链霉素(硫酸连霉素购自华北制药股份有限公司，批号010724)；5)待细胞增殖达70～80％融合时，用0.2％Trypsin(胰蛋白酶1∶250，华美生物工程公司)+0.02％EDTA(乙二胺四乙酸，Invitrogen，LOT1120193)进行消化，传代培养。
6)对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测CK19(角蛋白19，Sigma，sigma-aldrich.com，Product Number C6930)，β1-integrin(整合素-β1Product Number I 8638)，p63(SantaCruz Biotechnology，Inc.4A4sc-8431)，α6-integrin(整合素-α6，Sigma，CD49f，VLA-6a，Product Number I6653)均为阳性，证明所分选的是纯化的表皮干细胞。
本发明的方法所获得的关中奶山羊表皮干细胞系于2004年9月14日送中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号C200412，该中心于2004年12月10日检测结果为存活。申请人提供该中心2006年3月9日提供的受理通知书复印件。
以下是发明人给出的具体实施例。
实施例1关中奶山羊表皮干细胞的分离纯化扩增在经正常屠宰死亡后(30分钟内)的关中奶山羊(2.5-3.5岁)耳中部血管相对较少处，刮毛消毒，用耳号钳剪下一块大小约0.5×0.5cm2的皮肤，置于含青链素各500μ/ml的生理盐水中带回无菌间，用生理盐水冲洗数遍，去血污及毛发。在解剖镜下将皮肤与软骨分开，将皮肤切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小块，按上皮面朝上贴于直径为60mm玻璃平皿中，每皿3-4块，在37℃恒温台上放置15～20分钟后加培养基1～2mL，培养基的配方为90％Medium199(Gibco，LotNo.1129880)+10％FBS(新生牛血清，郑州市佰安生物工程有限公司，Lot1120193)+10μg/ml insulin(胰岛素，购自北京鼎国生物技术有限责任公司，http//www.digguo.com，Sigma分装，原产品编号为15500)+10ng/mL LIF(StemCell Technologies，Lot 2A083629)+(1～1.5μg/ml)氢化可的松+100u/mL青霉素(购自哈药集团制药总厂，批号B01124412)+100u/mL链霉素(硫酸连霉素购自华北制药股份有限公司，批号010724)，置于CO2培养箱(5％CO2，饱和湿度，37℃)中培养，每两天换液一次。3～4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7～12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长(图1)，待这些克隆直径达约100～150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20％Trypsin适当处理，用玻璃针将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用自行设计的无血清培养基培养，100％F12(InitrogenCorporation Lot1116568)+(1～1.2％)BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT716H9310)+(20～25)ng/ml EGF(表皮细胞生长因子，Sigma，E-mailtechserv@sial.com，Product Number E 9644)+5ug/ml insulin(胰岛素)+(15～20)ng/ml IGF-1胰岛素类生长因子-1，SigmaE-mailtechserv@sial.com，product Number I3769)+20ng/mLLIF(StemCell Technologies，Lot 2A083629)+0.05μg/ml氢化可的松+100U/mL青霉素(购自哈药集团制药总厂，批号B01124412)+100U/mL链霉素(硫酸连霉素购自华北制药股份有限公司，批号010724)；待细胞增殖达70～80％融合时，用0.2％Trypsin+0.02％EDTA进行消化，传代培养，用无血清培养基将关中奶山羊表皮干细胞传25代冻存，干细胞鉴定采用免疫组织化学法检测β1-integrin(整合素β1)，CK-19(角蛋白19)，p63，α6integrin，具体操作按北京中山生物试剂有限公司免疫组化染色试剂盒(HistostainTMPius Kits)说明书进行，结果表明所得到的干细胞β1-integrin，CK-19，p63，α6-integrin均为阳性(图2-5)。
图1是采用本发明的方法中组织块培养获得关中奶山羊原代表皮干细胞克隆，X200；图2是原代关中奶山羊表皮干细胞α6integrin阳性，X100；图3是第一代关中奶山羊表皮干细胞β1-integrin阳性，X200；图4是第二代关中奶山羊表皮干细胞CK-19阳性，X100；图5是第二代关中奶山羊表皮干细胞p 63阳性X400。
实施例2人类表皮干细胞的分离纯化扩增取医院小儿包皮环切术后废弃的一块大小约0.5×0.5cm2的皮肤，置于含青链霉素各500U/ml的生理盐水中带回无菌间，用生理盐水冲洗数遍，去血污。在解剖镜下将皮肤与皮下组织分开，将皮肤切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小块，按上皮面朝上贴于直径为60mm玻璃平皿中，每皿3-4块，在37℃恒温台上放置15～20分钟后加培养基1～2mL，培养基的配方为Medium19990％+10％FBS(新生牛血清，郑州市佰安生物工程有限公司，Lot1120193)+10μg/ml insulin(胰岛素，购自北京鼎国生物技术有限责任公司，http//www.digguo.com，Sigma分装，原产品编号为15500)+10ng/mL LIF(StemCell Technologies，Lot2A083629)+1-1.5μg/ml氢化可的松+100u/mL青霉素(购自哈药集团制药总厂，批号B01124412)+100u/mL链霉素(硫酸连霉素购自华北制药股份有限公司，批号010724)，置于CO2培养箱(5％CO2，饱和湿度，37℃)中培养，每两天换液一次。3～4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7～12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长(图1)，待这些克隆直径达约100～150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20％Trypsin适当处理，用玻璃针(自制)将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用自行设计的无血清培养基培养，无血清培养基的配方为F12100％(Initrogen CorporationLot1116568)+(1～1.2％)BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT 716H9310)+(20～25ng/ml)EGF(表皮细胞生长因子，Sigma，E-mailtechserv@sial.com，Product Number E 9644)+5ug/ml insulin(胰岛素)+(15～20ng/ml)IGF-1胰岛素类生长因子-1，SigmaE-mailtechserv@sial.com，product Number I3769)+20ng/mLLIF(StemCell Technologies，Lot 2A083629)+0.05μg/ml氢化可的松+100U/mL青霉素(购自哈药集团制药总厂，批号B01124412)+100U/mL链霉素(硫酸连霉素购自华北制药股份有限公司，批号010724)；待细胞增殖达70～80％融合时，用0.2％Trypsin+0.02％EDTA进行消化，传代培养，用无血清培养基将成人包皮来源的表皮干细胞传15代冻存，干细胞鉴定采用免疫组织化学法检测β1-integrin(整合素β1)，CK19(角蛋白19)，P63，α6integrin，具体操作按北京中山生物试剂有限公司免疫组化染色试剂盒(HistostainTMPius Kits)说明书进行，结果表明本发明所得到的干细胞β1-integrin，CK19，P63，α6-integrin均为阳性。
权利要求
1.一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤1)首先将已脱离人或动物的皮肤，置于含青链素各500U/ml的生理盐水中带回实验室，在超净工作台上用生理盐水冲洗，去血污及毛发；2)在解剖镜下将皮肤与皮下组织分开，将皮肤切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小块，按上皮面朝上贴于直径为60mm玻璃平皿中，每皿3～4块，加培养基；所述培养基的配方为90％Medium199+10％ FBS+10μg/mlinsulin+10ng/mL LIF+1～1.5μg/mL氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；3)置于CO2培养箱中培养，培养箱内的条件为5％CO2，饱和湿度，37℃；，每两天换液一次；4)经3～4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7～12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长，待这些克隆直径达约100～150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20％Trypsin处理，用玻璃针将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用无血清培养基培养；所述的无血清培养基的配方为100％F12+(1％～1.2％)BSA+(20ng/mL～25ng/mL)EGF+5ug/mL Insulin+(15ng/ml～20ng/mL)IGF-1+20ng/mL LIF+0.05μg/mL氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；5)待细胞增殖达70～80％融合时，用0.2％Trypsin+0.02％EDTA进行消化，传代培养，即用上述无血清培养基将关中奶山羊表皮干细胞传25代冻存，或用上述无血清培养基将人类表皮干细胞传15代冻存；6)对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测CK19，β1-integrin，P63，α6-integrin均为阳性，即证明所分选的是纯化的表皮干细胞。
全文摘要
本发明公开了一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法，在皮肤组织块培养过程中采用自行设计的培养基能有效抑制成纤维细胞的生长，从组织块四周生长出均一的上皮样细胞，诱发表皮干细胞迁移出原来的微环境，在新生成的上皮样细胞层上重新聚集生长。这类克隆性生长的细胞与其共生的上皮样细胞有明显形态学上的差别。借助解剖镜和玻璃针就能将其挑选出来，进行单独扩增培养。对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测CK19，β
文档编号C12N5/071GK1865436SQ20061004197
公开日2006年11月22日 申请日期2006年3月27日 优先权日2006年3月27日
发明者杨学义, 窦忠英 申请人:西北农林科技大学