专利名称：建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法
技术领域：
本发明属细胞生物学干细胞培养技术领域，具体涉及建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法。
背景技术：
关中奶山羊是一个优秀地方奶山羊品种，具有耐粗饲、抗病力强，个体大，产奶量高等特点，是理想的乳腺生物反应器。国内已有多家研究机构利用关中奶山羊胎儿成纤维细胞或成体皮肤成纤维细胞导入目的基因，将转有目的基因的成纤维细胞核作核供体，克隆转基因动物，以生产有重大经济价值的药用蛋白。然而，由于胎儿成纤维细胞及成体皮肤成纤维细胞均是高度分化的细胞，其甲基化程度高，通过核移植重构胚胎时，必须进行一系列去甲基化和甲基化过程，难以实现核基因的重新编程，胚胎不能正常发育至个体，这是当前克隆效率低及克隆动物易发生畸形的关键原因之一。而ES细胞是一种高度未分化的具有全能性的细胞(Evans et al 1981.Nature，292154-156)。在移植或把它注射到四倍体的囊胚后，能自主指导胚胎发育(Eggan et al，PNAS，2001，986201-6214，Wakayama et al.PNAS，1999，9614984-14989.Rideout et al.Nat Genet，2000，24109-110)。此外，ES细胞DNA甲基化程度低，故当ES细胞移植到去核的卵母细胞后，只需较少的去甲基化，或容易去甲基化，因而容易实现基因重新编程(Wakayama et al，PNAS，1999，9614984-14989.Rideout et al.NatGenet，2000，24109-110)。因此用ES细胞核作核供体能明显提高克隆动物的成功率。但哺乳动物ES细胞建系困难，限制了ES细胞用于克隆动物生产的应用。随着干细胞生物学研究的深入，越来越多的干细胞专家认为，在成体组织中，存在与胚胎干细胞相似分化潜能的干细胞(Watt et al.Science 2000，2871427-1430.Morrison，et al.CurrBiol 200111R7-R9.Anderson，et al Nat Med 2001；7393-395)，并已有学者从骨髓或皮肤中分离到与胚胎干细胞相似潜能的干细胞(Jianget al.Nature 2002.41841-49.Li et al.Stem cell and cellular therapy.1(4)9-10.Fang et al Stem cell and cellular therapy 1(4)11)。Liang等(2002)将成年鼠皮肤来源的表皮干细胞注入3.5d的鼠囊胚，发现表皮干细胞能随着胚胎发育，参与三个胚层分化。证明表皮干细胞具有与胚胎干细胞相似的分化潜能。因此，分离纯化关中奶山表皮干细胞，用于转基动物克隆，能提高克隆转基因动物的成功率。建立关中奶山羊皮肤表皮干细胞系，不仅可用于克隆转基因动物的研究和生产，而且可用于该品种的遗传特征研究与保种。然而，至今未见有建立关中奶山羊表皮干细胞系的方法的专利及文献报道。
发明内容
本发明的目在于，提供一种建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法，该方法所建立的成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系，若将其作为克隆动物和克隆转基因动物的供核细胞，可克服当前以高度分化的体细胞作核供体导致克隆效率低的缺点，有利于能生产有重要功能的药用蛋白的生物反应器的研究与应用。该细胞系的建立也可用于关中奶山羊的遗传特征研究与保种。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法，其特征在于，包括下列步骤1)将已脱离关中奶山羊耳中部的一块0.5cm×0.5cm大小的皮肤，在无菌问用生理盐水冲洗数遍，去血污及毛发；2)在解剖镜下将皮肤与软骨分离；并将该皮肤切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm的组织块，按表皮面朝上贴于玻璃或塑料平皿中，加培养基，培养基配方90％Medium199+10％FBS+10μg/mL insulin+10ng/mLLIF+0.5μg/ml氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；在37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱内培养，每2d换一次培养基；3)倒置显微镜下观察细胞生长情况3d～4d后，在组织块四周有上皮样细胞呈铺路石样生长，7d～12d后，在上皮样细胞层上可见有小圆形细胞聚集生长；该类细胞的胞体透亮、折光性强、体积小、核质比高、细胞呈球形，具有干细胞形态学特征；4)待这些干细胞增殖到直径约为100um～150um时，在解剖镜下将其挑选出来，用0.2％胰酶+0.02％EDTA进行离散成单个细胞，用移胚管将单个细胞移入3.5cm塑料皿中，塑料皿中铺有明胶；每皿接种5000～10000个细胞；5)用无血清培养基培养，3天后换液；此后每两天换液一次；无血清培养基培养配方为100％F12+(1～1.2％)BSA+(20～25ng/mL)EGF+(15～20ng/mL)IGF-1+20ng/mL LIF+0.05μg/mL氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；6)待干细胞增殖至70％～80％融合时，用0.2％胰酶+0.02％EDTA进行消化传代培养，直至传至25代，冷冻大量种子细胞，即为建立的成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系。
本发明带来以下的技术效果首先，采用组织块培养法和克隆筛选法，分离纯化了关中奶山羊表皮干细胞，并建立一种快速，有效，安全的表皮干细胞分离，纯化方法。
第二，本发明用无血清培养体系，不需滋养层细胞，实现了关中奶山羊表皮干细胞体外长期扩增，传25代冻存。目前已冻存2×108～2.5×108个种子细胞。该类细胞体外倍增时间为28～30小时，细胞直径9～13um之间；测定了其生长曲线和克隆形成率，结果本发明所建立的关中奶山羊表皮干细胞系在无血清无滋养层培养体系中呈指数增长，无明显的平台期。原代表皮干细胞的克隆形成率为58.9％，随传代次数增加，其克隆形成率逐渐下降，第5代克隆形成率最低为30.90％。经LSR法进行检验，各代之间细胞集落形成率无显著差异(P＞0.05)。
第三，经免疫组织化学法鉴定表明，所分离到表皮干细胞原代表现为Oct4阳性，证明其具有与ES细胞类似的分化潜能。传代后的表皮干细胞CK19(角蛋白19)，β1-integrin(整合素-β1)，P63阳性，具有表皮干细胞的典型特性。
第四，本发明对建立细胞的要求参照鄂征主编的《组织培养和分子细胞学技术》第37～38页关于细胞系及建立细胞系的要求初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。而建系的要求是组织来源明确，了解该类细胞的一般和特殊的生物学性状，如细胞的一般形态。
本发明的方法所获得的关中奶山羊表皮干细胞系于2004年9月14日送中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号C200412，该中心于2004年12月10日检测结果为存活。申请人提供该中心2006年3月9日提供的受理通知书。
综上所述，本发明的方法所获得的关中奶山羊表皮干细胞系是具有典型干细胞特性的细胞系，不仅可用于克隆转基因动物的研究和生产，而且可用于该品种的遗传特征研究与保种；同时也是组织工程皮肤研究的理想实验材料。
图1是原代关中奶山羊表皮干细胞克隆×200图2是原代关中奶山羊表皮干细胞Oct4阳性×100；图3是第二代关中奶山羊表皮干细胞β1-integrin阳性×100；图4是第二代关中奶山羊表皮干细胞CK19阳性×200；图5是第二代关中奶山羊表皮干细胞P63阳性×400；图6是第3、6、12关中奶山羊表皮干细胞生长曲线图7是第3代表皮干细胞在有血清和无血清培养基中培养其克隆形成率比较图。
以下结合附图对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式
在经正常屠宰死亡后(30分钟内)的关中奶山羊(2.5～3.5岁)耳中部血管相对较少处，刮毛消毒，用耳号钳剪下一块大小约0.5×0.5cm2的皮肤，置于含青链霉素各500U/mL的生理盐水中带回无菌间，用生理盐水冲洗数遍，去血污及毛发。在解剖镜下(Olmpus Tokyo 305047，Made In Japan)下将皮肤与软骨分开，将皮肤切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的小块，按上皮面朝上贴于直径为60mm玻璃平皿中，每皿3～4块，在37℃恒温台上放置15～20分钟后加培养基1～2mL，培养基的配方为90％Medium199(Gibco，Lot No.1129880)+10％FBS(新生牛血清，郑州市佰安生物工程有限公司，Lot1120193)+10μg/mLinsulin(胰岛素，购自北京鼎国生物技术有限责任公司，http//www.digguo.com，Sigma分装，原产品编号为15500)+10ng/mLLIF(StemCell Technologies，Lot 2A083629)+1～0.5μg/mL氢化可的松+100u/mL青霉素(购自哈药集团制药总厂，批号B01124412)+100U/mL链霉素(硫酸连霉素购自华北制药股份有限公司，批号010724)，置于CO2培养箱(5％CO2，饱和湿度，37℃)中培养，每两天换一次培养基。倒置显微镜下观察细胞生长情况3～4d后，在组织块四周会有上皮样细胞呈铺路石样生长，7d～12d后，在上皮样细胞层上可见有小圆形细胞聚集生长(图1)；该类细胞的胞体透亮、折光性强、体积小、核质比高、细胞呈球形，具有干细胞形态学特征；待这些干细胞克隆直径达约100～150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20％Trypsin适当处理，用玻璃针将这些干细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用自行设计的无血清培养基培养，100％F12(Initrogen CorporationLot1116568)+(1～1.2％)BSA(牛血清白蛋白Sigma，LOT 716H9310)+(20～25ng/ml)EGF(表皮细胞生长因子，Sigma，E-mailtechserv@sial.com，Product Number E 9644)+5ug/ml insulin(胰岛素)+(15～20ng/mL)IGF-1(胰岛素类生长因子-1，SigmaE-mailtechserv@sial.com，product Number I3769)+20ng/mLLIF(StemCell Technologies，Lot 2A083629)+0.05μg/mL氢化可的松+100U/mL青霉素(购自哈药集团制药总厂，批号B01124412)+100U/mL链霉素(硫酸连霉素购自华北制药股份有限公司，批号010724)，3天后换液。此后每两天换液一次。待干细胞增殖至70～80％融合时，用0.2％胰酶+0.02％EDTA进行消化传代培养，将关中奶山羊表皮干细胞传至25代，冷冻大量种子细胞。即为建立的成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系。
从传代培养的原代开始，即对所分离的表皮干细胞进行Oct4，β1-integrin(整和素β1)，CK19(角蛋白19)，P63等抗体免疫组织化学染色鉴定，和测定表皮干细胞生长曲线及克隆形成率。
免疫组织化学染色鉴定的具体操作按北京中山生物试剂有限公司免疫组化染色试剂盒(HistostainTMPius Kits)说明书进行。
表皮干细胞生长曲线及克隆形成率，按照司徒镇强、吴军主编，世界图书出版西安公司1996年4月第一版《细胞培养》介绍的方法进行。
上述测定结果表明，本发明所建立的关中奶山羊表皮干细胞系在无血清无滋养层培养体系中呈指数增长，无明显的平台期；原代表皮干细胞的克隆形成率为58.9％，随传代次数增加，其克隆形成率逐渐下降，第5代克隆形成率最低为30.90％，经LSR法进行检验，各代之间细胞集落形成率无显著差异(P＞0.05)。
本发明建立的关中奶山羊皮肤表皮干细胞系，将有广阔的应用前景不仅可用于克隆转基因动物的研究和生产，而且可用于该品种的遗传特征研究与保种；同时也是组织工程皮肤研究的理想实验材料。
权利要求
1.一种建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法，其特征在于，包括下列步骤1)将已脱离关中奶山羊耳中部的一块0.5cm×0.5cm大小的皮肤，在无菌间用生理盐水冲洗数遍，去血污及毛发；2)在解剖镜下将皮肤与软骨分离；并将该皮肤切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm的组织块，按表皮面朝上贴于玻璃或塑料平皿中，加培养基，培养基配方90％Medium199+10％FBS+10μg/mL Insulin+10ng/mLLIF+(1-1.5μg/mL)氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；在37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱内培养，每2d换一次培养基；3)倒置显微镜下观察细胞生长情况3d～4d后，在组织块四周有上皮样细胞呈铺路石样生长，7d～12d后，在上皮样细胞层上可见有小圆形细胞聚集生长；该类细胞的胞体透亮、折光性强、体积小、核质比高、细胞呈球形，具有干细胞形态学特征；4)待这些干细胞克隆增殖到直径约为100um～150um时，在解剖镜下将其挑选出来，用0.2％胰酶+0.02％EDTA进行离散成单个细胞，用移胚管将单个细胞移入塑料皿中，塑料皿中铺有明胶；每皿接种5000～10000个细胞；5)用无血清培养基培养，第3天后换一次无血清培养基；此后每两天换一次无血清培养基；无血清培养基培养配方为100％F12+(1％～1.2％)BSA+(20～25ng/mL)EGF+(15～20ng/mL)IGF-1+20ng/mL LIF+0.05μg/ml氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；6)待干细胞增殖至70％～80％融合时，用0.2％胰酶+0.02％EDTA进行消化传代培养，直至传至25代，冷冻大量种子细胞，即为建立的成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系。
全文摘要
本发明公开了一种建立成年关中奶山羊皮肤表皮干细胞系的方法，该方法将已脱离关中奶山羊体的耳中部一块0.5cm×0.5cm大小的皮肤，切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm的组织块，按表皮面朝上贴于玻璃或塑料平皿中，加培养基，在37℃、5％CO
文档编号C12N5/071GK1865434SQ200610041978
公开日2006年11月22日 申请日期2006年3月27日 优先权日2006年3月27日
发明者杨学义, 窦忠英 申请人:西北农林科技大学