专利名称：鲤鱼背肌中组织蛋白酶l的分离纯化方法
技术领域：
本发明属于酶分离纯化技术领域，涉及一种鲤鱼背肌中组织蛋白酶L的分离纯化 方法。
背景技术：
组织蛋白酶cathepsin是在各种动物组织的细胞内(特别是溶酶体部分)发现的 一类蛋白酶。此名源自希腊语的“消化”，为威尔斯达特(R.Willst0atter，1929)命名的。 它是广泛存在于病毒、细菌、真菌、原生动物及原虫、植物、哺乳动物和人的溶酶体内的一种 酶，属于胞内蛋白酶。弱酸性环境中易被活化，是一类在碱性和中性溶液中不稳定的糖蛋白 (除组织蛋白酶D、E、S外)。到目前为止，组织蛋白酶A到Z都有报道，基本是按照发现的 顺序命名的。按组织蛋白酶的催化活性中心可分为三种，丝氨酸蛋白酶(如A、G、R)、天冬 氨酸蛋白酶(如D、E)和半胱氨酸蛋白酶(如B、C、H、L、S等)。组织蛋白酶L(cath印sin L CL)属于木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白水解酶， 以酶原的形式贮存于生物体的溶酶体中，相对分子质量为30000。在正常情况下，大约10% 的酶原被生理性分泌至胞质，然后可被其他的蛋白水解酶水解或自身激活，切除N端和C端 多余的氨基酸残基形成相对分子质量为24000的活性形式，参与许多特殊的生理过程，如 激素原的激活、抗原呈递、组织器官的发育等。对于人类而言，在病理状态下，各种原因所致的细胞损伤(如病原微生物、炎症因 子、氧化应激等)，导致溶酶体膜稳定性降低，通透性增高甚至破裂，大量CL释放到胞质或 组织间隙，并被激活，可降解细胞成分或细胞间质基质成分，包括层粘素、IV型胶原纤维及 纤维连接素等，与人类许多疾病如肿瘤的浸润与转移、关节炎、骨质疏松、阿尔茨海姆病、多 发性硬化症及其他慢性炎症性疾病有关。纯化CL并研究其各种性质，有助于针对各类CL 相关病症研发专用药物。在鱼类的加工过程中，特别是鱼糜加工、贮运过程中，与其他组织蛋白酶相比，CL 活性高、稳定性强，能够降解鱼肉、鱼糜蛋白质的主要组成成分肌原纤维，导致鱼肉、鱼糜品 质劣化。为了有效抑制或消除CL的劣质影响，分离纯化出CL，充分研究其酶学性质，具有重 要的学术价值；对于实际生产中有效指导筛选其有效可食性抑制剂具有重要意义。另一方面，分离纯化出CL也有助于今后充分利用其高效蛋白水解性能，开发食品 嫩化剂、饲料酶制剂、洗涤日用酶制剂以及化妆领域专用酶制剂。目前国内外对于淡、海水鱼类内脏中的CL纯化已见报道，但是鱼类加工过程中内 脏一般都会去除，对肉质有影响作用的应该是肌肉中的CL。目前对于鲤鱼背肌中CL的分离 纯化尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种从鲤鱼背肌中分离纯化组 织蛋白酶L(CL)的方法。利用本发明的方法可以获得凝胶电泳检测单一组分的CL。
本发明包括如下步骤步骤(1)取鲤鱼背肌白肉a克，加入b毫升的20毫摩尔/升(mM) Tris-盐酸缓冲 液勻浆，在离心机转子温度为3 5°C、6000 X g 6500 X g条件下离心15 20min，得到上 清液；所述的Tris-盐酸缓冲液pH为6. 8 7. 5，a b = 1 5 10 ；步骤(2)将上清液于55 65°C条件下加热3 5min，置于冰水冷却，在离心机转 子温度为3 5°C、8000Xg 8500Xg条件下离心15 20min，获得粗酶液；步骤(3)将得到的粗酶液经过疏水性凝胶层析，收集具有活性的组分并合并；所 述的活性的组分由CL专一性底物(Z-Phe-Arg-MCA)活性测定方法得到；步骤(4)将合并后的活性的组分经过离子交换层析，再次收集具有活性的组分并 合并；步骤(5)加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到70%，离心获得沉淀；步骤(6)在得到的沉淀中加入的Macllvaine缓冲液复溶，得到高浓度的部分纯化 酶液；所述的Macllvaine缓冲液复溶pH为2. 5 3. 5 ；步骤(7)进行超滤浓缩，去除比CL分子量低的蛋白质；步骤(8)进行体积排阻高效液相(SEC-HPLC)分离，最终获得CL ；对获得的纯化酶进行了酶学性质检验，其催化底物选择性实验结果表明该纯化酶 只能催化水解CL的专一性底物Z-Phe-Arg-MCA ；最适pH为5. 5，最适温度为60°C ；能够被 CL的专一性抑制剂E-64完全抑制活性，被激活剂DTT、EDTA所激活；以上结果证实了按本 发明的操作步骤所获得的纯化酶为组织蛋白酶L(CL)。本发明与背景技术相比，具有的有益的效果是1.首先将样品进行热处理，使得热不稳定性的其他酶类变性，初步达到去除杂质 的效果，为下一步纯化提供了便利，是分离纯化良好的基础。2.通过酸化处理，将CL从其与天然抑制剂的复合体中成功分离，达到有效去除天 然抑制剂的目的，与以往的分离提取技术相比，分离效果好，获得的CL得率高、纯度好。3.充分利用了 CL的性质，除了热处理、酸化处理外，通过离子交换层析去除与CL 性质相近的其他组织蛋白酶类(如B、H型)，还采用超滤技术与体积排阻高效液相分别去 除低于和高于CL分子量的杂质蛋白质。采用的方法均比较温和，获得的CL不但纯度高，活 力保持亦较好。
具体实施例方式实施例1 取鲜活鲤鱼背部白色肉50g，加入500mL的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7. 0)，勻浆 后于3°C条件下6000 X g离心20min，获得上清液。将上清液置于60°C水浴4min后，冰浴冷 却，3°C条件下8000 X g离心20min，获得上清液。上清液作为粗酶液上样到已经洗脱液平衡 好的 Phenyl-S印harose 柱上(内径 1. 5cm,高度 20cm)，以 20mM Tris-HCl 缓冲液(ρΗ7· 5) 洗脱，流速为0.5ml/min。收集具有酶活性的洗脱液，合并，进一步以20mM Tris-HCl缓冲 液(PH7. 5)透析纯化。所得样品再上样到预平衡好的DEAE-Bio-Gel A柱上(内径1. 5cm, 高度15cm)，以20mM Tris-HCl缓冲液(pH7. 5)洗脱一夜，以0 300mM NaCl梯度洗脱 (总体积300ml)。收集具有酶活性的洗脱液，加入70%饱和浓度的硫酸铵，离心分离获得
4沉淀，以两倍体积的PH3. 0的MacIlvaine缓冲液(含ImM EDTA-ImM β -巯基乙醇作为 CL的保护剂)复溶，获得高浓度的部分纯化酶液，经Centricon 10超滤装置超滤去除低 分子量的蛋白组分和解离出的CL天然抑制剂。超滤获得的组分经排阻层析高效液相系统 SEC-HPLC (Superose 12HR 10/30 柱，Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden ；连 ^ Bio-Rad HPLC pump, Model 2700, Bio-Radlaboratories, Inc. ， Hercules, CA ；L UV 检测装置)，进样量为ΙΟΟμΙ (蛋白含量5-10mg)，以50mM磷酸缓冲液(pH7. 2)洗脱，流速 为0. 5ml/min,0. 5ml收集样品检测其活性，保留时间为23. 9min时检测到活性峰，与鱼肉提 取的上清液酶活相比，纯化倍数为54. 9倍。实施例2 取鲜活鲤鱼背部白色肉50g，加入250mL的20mM Tris-HCl缓冲液(pH6. 8)，勻浆 后于4°C条件下6200 X g离心15min，获得上清液。将上清液置于55°C水浴5min后，冰浴冷 却，4°C条件下8300Xg离心15min，获得上清液。上清液作为粗酶液上样到已经洗脱液平衡 好的 Phenyl-S印harose 柱上(内径 1. 5cm,高度 20cm)，以 20mM Tris-HCl 缓冲液(ρΗ7· 5) 洗脱，流速为0.5ml/min。收集具有酶活性的洗脱液，合并，进一步以20mM Tris-HCl缓冲 液(PH7. 5)透析纯化。所得样品再上样到预平衡好的DEAE-Bio-Gel A柱上(内径1. 5cm, 高度15cm)，以20mM Tris-HCl缓冲液(pH7. 5)洗脱一夜，以0_300mM NaCl梯度洗脱(总 体积300ml)。收集具有酶活性的洗脱液，加入70%饱和浓度的硫酸铵，离心分离获得沉 淀，以两倍体积的PH2. 5的MacIlvaine缓冲液(含ImM EDTA-ImM β -巯基乙醇作为CL 的保护剂)复溶，获得高浓度的部分纯化酶液，经Centricon 10超滤装置超滤去除低分 子量的蛋白组分和解离出的CL天然抑制剂。超滤获得的组分经排阻层析高效液相系统 SEC-HPLC (Superose 12HR 10/30 柱，Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden ；连 ^ Bio-Rad HPLC pump, Model 2700, Bio-Rad laboratories, Inc. ，Hercules, CA ；L UV 检测装置)，进样量为ΙΟΟμΙ (蛋白含量5-10mg)，以50mM磷酸缓冲液(pH7. 2)洗脱，流速 为0. 5ml/min,0. 5ml收集样品检测其活性，保留时间为23. Smin时检测到活性峰，与鱼肉提 取的上清液酶活相比，纯化倍数为50. 2倍。实施例3 取鲜活鲤鱼背部白色肉45g，加入360mL的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7. 5)，勻浆 后于5°C条件下6500 X g离心18min，获得上清液。将上清液置于65°C水浴3min后，冰浴冷 却，5°C条件下8500Xg离心17min，获得上清液。上清液作为粗酶液上样到已经洗脱液平衡 好的 Phenyl-S印harose 柱上(内径 1. 5cm,高度 20cm)，以 20mM Tris-HCl 缓冲液(ρΗ7· 5) 洗脱，流速为0.5ml/min。收集具有酶活性的洗脱液，合并，进一步以20mM Tris-HCl缓冲 液(PH7. 5)透析纯化。所得样品再上样到预平衡好的DEAE-Bio-Gel A柱上(内径1. 5cm, 高度15cm)，以20mM Tris-HCl缓冲液(pH7. 5)洗脱一夜，以0_300mM NaCl梯度洗脱(总 体积300ml)。收集具有酶活性的洗脱液，加入70%饱和浓度的硫酸铵，离心分离获得沉 淀，以两倍体积的PH3. 5的MacIlvaine缓冲液(含ImM EDTA-ImM β -巯基乙醇作为CL 的保护剂)复溶，获得高浓度的部分纯化酶液，经Centricon 10超滤装置超滤去除低分 子量的蛋白组分和解离出的CL天然抑制剂。超滤获得的组分经排阻层析高效液相系统 SEC-HPLC (Superose 12HR 10/30 柱，Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden ；连 ^ Bio-Rad HPLC pump, Model 2700, Bio-Radlaboratories, Inc. ， Hercules, CA ；L UV检测装置)，进样量为100 μ 1 (蛋白含量5-10mg)，以50mM磷酸缓冲液(ρΗ7· 2)洗脱，流速 为0. 5ml/min,0. 5ml收集样品检测其活性，保留时间为23. 9min时检测到活性峰，与鱼肉提 取的上清液酶活相比，纯化倍数为48. 5倍。
权利要求
鲤鱼背肌中组织蛋白酶L的分离纯化方法，其特征在于该方法包括如下步骤步骤(1)取鲤鱼背肌白肉a克，加入b毫升的20毫摩尔/升Tris-盐酸缓冲液匀浆，在离心机转子温度为3～5℃、6000×g～6500×g条件下离心15～20min，得到上清液；所述的Tris-盐酸缓冲液pH为6.8～7.5，a∶b＝1∶5～10；步骤(2)将上清液在55～65℃条件下加热3～5min，置于冰水冷却，在离心机转子温度为3～5℃、8000×g～8500×g条件下离心15～20min，获得粗酶液；步骤(3)将得到的粗酶液经过疏水性凝胶层析，收集具有活性的组分并合并；所述的活性的组分由组织蛋白酶L专一性底物活性测定方法得到；步骤(4)将合并后的活性的组分经过离子交换层析，再次收集具有活性的组分并合并；步骤(5)加入硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达到70％，离心获得沉淀；步骤(6)在得到的沉淀中加入的MacIlvaine缓冲液复溶，得到高浓度的部分纯化酶液；所述的MacIlvaine缓冲液pH为2.5～3.5；步骤(7)将高浓度的部分纯化酶液进行超滤浓缩，去除比组织蛋白酶L分子量低的蛋白质；步骤(8)进行体积排阻高效液相分离，最终获得纯化后的组织蛋白酶L。
全文摘要
本发明涉及一种组织蛋白酶L的分离纯化方法。本发明的组织蛋白酶L粗酶液先通过热处理游离出该酶，同时消除其他热不稳定性酶的影响，通过离心获得粗酶。随后经过疏水性凝胶层析，再经离子交换柱层析去除与组织蛋白酶L性质相近的其他组织蛋白酶如B、H、S型等，收集有酶活性的组分后通过70％硫酸铵沉淀。沉淀经缓冲液复溶，此过程同时可将组织蛋白酶L从其与其天然抑制剂形成的复合体中解离，经超滤净化去除低分子量的酶抑制剂并浓缩目标酶。浓缩液经体积排阻高效液相分离后获得组织蛋白酶L。本发明获得的CL不但纯度高而且活力保持亦较好。
文档编号C12N9/64GK101886065SQ20101021006
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月28日 优先权日2010年6月28日
发明者刘东红, 叶兴乾, 吴丹, 胡亚芹, 陈健初 申请人:浙江大学