一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法

一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法
【专利摘要】本发明涉及一种绵羊精原干细胞的分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法，包括制备各种溶液，然后从3-4月龄的绵羊睾丸中取2-3g曲细精管组织块，经过两步酶解消化制备单细胞悬液，进而用差别贴壁法分离纯化精原干细胞，使用SSCM培养液实现绵羊精原干细胞的传代长期培养，对传代长期培养的绵羊精原干细胞进行冻存和复苏的方法。本发明提供的技术方案实现了不需使用特定的绵羊精原干细胞抗体就能获得纯度较高的绵羊精原干细胞，建立了绵羊精原干细胞传代长期培养体系、成功地建立了液氮冷冻法长期保存绵羊精原干细胞的方法。使用本发明提供的方法分离纯化并且传代的绵羊精原干细胞至少已经培养达40代以上，如果加上冻存时间，最长的培养期已达4年。
【专利说明】一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及家畜种质资源保存和优良品种繁育、组织器官再生等生物【技术领域】，具体涉及一种绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法。
【背景技术】
[0002]精原干细胞(SSCs)是最重要的成体干细胞之一。精原干细胞不仅有传宗接代的遗传功能，近来研究显示，精原干细胞很容易通过退分化产生多能干细胞，这使得精原干细胞操作技术得到生命科学、农业科学和医学各路专家的垂青。自从精原干细胞移植技术建立以来，精原干细胞的研究开始加速，2000年后，建立了小鼠和大鼠精原干细胞的体外长期培养方法，精原干细胞基础研究和应用研究都得到了迅速的发展。一方面，培养的精原干细胞经过遗传修饰再移植到受体睾丸，通过精子发生过程产生转基因的精子，进而繁殖出转基因动物。另一方面，培养的精原干细胞通过退分化产生生殖多能干细胞，用于再生医学研究，将能够应用于损伤的组织器官的再生修复。因此精原干细胞在生殖生物学研究、转基因动物技术研究、退分化诱导产生多能干细胞研究、动物种质资源保存研究及组织器官康复临床医疗研究上具有重要意义。
[0003]在遗传育种领域，父系的遗传性状是通过精原干细胞分化产生的精子通过受精传给后代的。以前绵羊繁殖及绵羊品种改良的体外研究(或称试管研究)集中在卵母细胞上。随着近十多年来对精原干细胞研究的进展，绵羊精原干细胞增殖和分化研究在绵羊繁殖及绵羊品种改良研 究中的作用和意义越来越明显。通过精原干细胞移植将为绵羊杂种遗传优势的利用提供新的技术路线。因为杂交育种技术的实际应用往往存在一些实际困难，比如必须首先形成和保留大量的各自独立的种群(品种或品系)，这需要大量的工作和成本，但如果采用优良性状突出的公绵羊的精原干细胞做为品种资源，那么就把问题简化了。只要用这头公绵羊睾丸制备精原干细胞，进行增殖并冷冻保存，这就是一个很好的绵羊品种。需要时就将它复苏培养，再对受体公绵羊进行精原干细胞移植，就会产生出我们需要的优良绵羊的精子。只要保留优良公绵羊的精原干细胞，就保留了一个优良的绵羊品种，省去了耗时费力的保留大量种群的工作。另外，杂交育种工作的另一个难题是，本地品种和外来优良品种之间的自然条件或饲养条件相差很大，难以进行杂交育种，但是如果在本地绵羊品种中制备受体，用外来优良品种制备精原干细胞，然后将外来优良绵羊品种的精原干细胞注入本地绵羊受体睾丸，由本地受体公绵羊产生出外来优良品种的精子，用于与本地品种母绵羊进行杂交，预期能获得性状优良的绵羊杂种后代。
[0004]但是，绵羊精原干细胞的分离纯化和长期培养至今仍然是世界难题。精原干细胞研究最著名的专家Brinster带领的研究组2008年曾经发表论文说过大动物精原干细胞长期培养方法的建立还需要5至10年的研究。虽然鼠类的精原干细胞长期培养方法已经建立，由于种族差别、基因库差别、市售抗体不能通用等多种因素的存在，绵羊精原干细胞的长期培养方法不能照搬鼠类的方法。鉴于绵羊精原干细胞长期培养技术意义重大，不仅具有理论价值，在农牧业和医学上还具有经济应用价值和社会价值，美、欧、日、澳、韩等国均有科研组织致力于绵羊精原干细胞长期培养的研究，曾有绵羊精原干细胞的纯化、鉴定方面的报道，但是也存在分离纯化技术复杂，分离到的精原干细胞少，纯度不高的问题，特别是整套的绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的技术操作体系还没有成功的报道。
[0005]另外，目前的精原干细胞分离纯化方法主要有:隐睾手术富集法、酶解法、Percoll密度梯度离心法、流式细胞术分选法、免疫磁珠分选法、差异贴壁法等方法等。流式细胞术分选法和免疫磁珠分选法在鼠类精原干细胞中应用效果较好，但是两种方法都需要有与所研究物种的精原干细胞表面抗原特异性很好结合的抗体，而目前适用于绵羊精原干细胞的抗体并不常见，因此在绵羊精原干细胞的研究中并不适于使用流式细胞术分选法和免疫磁珠分选法。而隐睾手术富集法和Percoll密度梯度离心法都不能得到高纯度的精原干细胞，而且在实践中发现Percoll密度梯度离心法对精原干细胞的活力有影响，至今为止在成功的精原干细胞培养技术中还没有采用这两种方法的报道。
[0006]目前已有本领域技术研究人员使用酶解法+差异贴壁法成功分离精原干细胞的报道，但是使用酶解法+差异贴壁法的关键在于制备的单细胞悬浮液中含有的精原干细胞要纯度高、数量多、活性好，而不同动物睾丸生精上皮细胞的组织结构各有差异，使用酶解法消化周边组织、释放支持细胞和精原干细胞时，消化酶的种类和浓度、作用强度(转速)、消化时间、缓冲液成分等都是影响消化程度的因素，任何一个因素不合适，都影响生精上皮的消化和释放精原干细胞，导致单细胞悬浮液中的精原干细胞数量少质量差，最后通过差异贴壁法纯化也不能获得足够数量的活力好的精原干细胞；就算制备了高质量的单细胞悬浮液，在纯化精原干细胞的操作过程中，分离顺序、分离时间、冲洗次数、冲洗力度等具体操作方法又都是影响最后收集的精原干细胞数量和质量的因素，掌握不好时照样不能获得高活力的精原干细胞。因此，虽然酶解法+差异贴壁法从原理上看比较简单，使用的器械和试剂也都比较常用，但是由于物种不同、各个操作环节的要求不同、实验人员的操作习惯不同，会直接影响精原干细胞的分离纯化效果。可见每一步的操作细节都是很重要的，差之毫厘失之千里，细节决定成败。正是因为没有抓住细节，致使用酶解法+差异贴壁法成功分离纯化绵羊精原干细胞的方法还没有成功的报道。在目前国内外已报道的使用酶解法+差异贴壁法分离纯化某个物种精原干细胞的科技文献中，只强调酶解法和差异贴壁法的作用机理，而忽视各个操作细节，但是精原干细胞是有生物活性的细胞，任何外在因素都会对细胞的分离释放、保持活性或者死亡等有直接影响，因此参考这些科技文献，往往进行多次试验，也很难成功地分离纯化出精原干细胞。

【发明内容】

[0007]为解决上述问题，本发明提出一种细化的绵羊精原干细胞分离纯化、传代长期培养、冻存及复苏的方法，旨在提供一种不需要特定的绵羊精原干细胞抗体，使用酶解法+差异贴壁法分离纯化绵羊精原干细胞的方法体系，从中获得的精原干细胞纯度高、数量多、活力好、易于培养，在这个基础上对绵羊精原干细胞进行传代长期培养、冻存及复苏，从而建立起一整套操作技术体系。
[0008] 本发明的一种绵羊精原干细胞分离纯化的方法，包括以下步骤:[0009]第一步:配制溶液:
[0010]I)将体积百分比为0.1%的抗菌-抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液A，两周内使用；
[0011]2)将IV型胶原酶以20mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液中制成IV型胶原酶储备液，_20°C保存；
[0012]3)将透明质酸酶以10mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液中制成透明质酸酶储备液，_20°C保存；
[0013]4)将DnaseI以5mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液，再加入体积百分比为20%的甘油，制成DnaseI储备液，_20°C保存；
[0014]5)将体积百分比为0.5%的Trypsin和浓度为2mM EDTA溶于PBS缓冲液中制成Trypsin/EDTA 储备液，_20°C保存；
[0015]6)将体积百分比为10%的胎牛血清和0.1 %的抗菌-抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液C，两周内使用；
[0016]7)将体 积百分比为5.5%的马血清、2.4%的胎牛血清和0.1 %的抗菌-抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液B，两周内使用；
[0017]8)将30 μ M的巯基乙醇加入培养液C中，过滤灭菌制成培养液D，现配现用；
[0018]9)将体积百分比为0.52%的牛血清白蛋白溶于PBS缓冲液中，过滤灭菌制成PBS-BSA溶液，现配现用；
[0019]第二步:利用绵羊睾丸组织制备单细胞悬浮液，无菌条件下操作步骤依次如下:
[0020]I)从3-4月龄的绵羊睾丸中取2_3g曲细精管组织块，放入载有2.5ml培养液A的100mL培养皿中，用镊子除去曲细精管组织块上的睾丸白膜和较大的血管；
[0021]2)将所剩的组织块放入20ml小瓶中，用眼科直剪刀剪碎，持续剪3分钟；
[0022]3)将剪碎的组织块转移到一个100mL带盖的大口瓶中，补加培养液A至7.5ml ；
[0023]4)进行第一步酶消化，具体操作如下:在上述100mL带盖的大口瓶中加入0.63ml的IV型胶原酶储备液，置于37 °C水浴摇床中，以90rpm的转速摇荡40min ;随后加入0.825ml的透明质酸酶储备液和0.125ml的DnaseI储备液，继续置于37°C水浴摇床中，以90rpm的转速摇荡20min，用IOml移液管温和地上下吸吹悬浮物5次；此操作先用胶原酶消化40min，再加入透明质酸酶，两种酶共同作用20min，能得到良好的消化效果，既能使曲细精管的膜蛋白得到较大限度的消化，又不会对管内细胞造成较大的损伤；
[0024]5)从水浴摇床中取出100mL带盖的大口瓶中，用IOml移液管温和地上下吸吹悬浮物5次；
[0025]6)将上述100mL带盖的大口瓶中的悬浮液转入50ml离心管，以2000rpm的转速离心6min,除去上清液；
[0026]7)在步骤6)所述离心管中加入12ml的PBS缓冲液，摇匀使沉淀物重新悬浮，以2000rpm的转速离心6min,除去上清液；
[0027]8)重复步骤7的操作一次；
[0028]9)在步骤8)所述离心管中加入0.75ml的培养液A重新悬浮沉淀物，再加入1ml的Trypsin/EDTA储备液和0.25ml的DNaseI储备液，置于37°C水浴摇床中，以90rpm的转速摇荡lOmin，用IOml移液管温和地上下吸吹悬浮物5次；Trypsin/EDTA可以消化细胞外粘附蛋白，DNaseI可以除去长链DNA分子，降低细胞悬浮液的粘度，这两种溶液共同作用有利于形成单细胞悬浮液；
[0029]10)立即在步骤9)所述离心管中加入IOml的培养液C，用IOml移液管温和地上下吸吹悬浮物直到明显的块状物消失；培养液C中的胎牛血清可以终止酶消化反应，阻止细胞膜受损，维持生殖细胞活力；
[0030]11)将步骤10)所述离心管以2000rpm的转速离心6min,除去上清液,然后用2ml
培养液C重悬细胞；确保消化反应彻底终止,保证生殖细胞活力；
[0031]12)先用200目然后用300目尼龙过滤器分别过滤步骤11)所述细胞悬浮液；除去没有消化完全的组织碎片和细胞团；
[0032]13)将步骤12)所述的过滤后的细胞悬浮液用IOml移液管温和地吸吹5_10次，进行细胞计数，然后加入培养液C调整细胞密度至1.25xl06细胞/ml，制成单细胞悬浮液；此时的单细胞悬浮液中主要是体细胞和生殖细胞；
[0033]第三步:从第二步所述分离培养的单细胞悬浮液中纯化精原干细胞，操作步骤依次如下:
[0034]I)将IOml第二步步骤13)所述的单细胞悬浮液铺于直径为IOOmm的明胶包被培养皿，放在32.50C ,5.5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中，培养2天半到3天半； [0035]2)用5ml移液管从步骤I)中所述培养皿中温和地移除所有培养液；
[0036]3)先用培养液A洗细胞:从培养皿的边缘缓慢加入4ml预热的培养液A，温和地来回晃动培养皿I次，然后用移液管移除培养液；此操作用于洗去培养皿中的死细胞；
[0037]4)再用PBS缓冲液洗细胞两次:从培养皿的边缘缓慢加入4ml预热的PBS缓冲液，温和地来回晃动培养皿I次，立即用移液管移除上清液，再重复操作一次；此操作继续洗去培养皿中的死细胞；此时体细胞被明胶吸附，而生殖细胞则吊在体细胞上；
[0038]5)加4ml培养液A至培养皿中，用移液管吸吹培养液A轻轻冲洗培养皿整个表面大约2遍；通过培养液A对生殖细胞的冲洗力，可以将吊在体细胞上的生殖细胞冲洗到冲洗液中，所以，此时体细胞仍被明胶吸附，而冲洗液里大部分是生殖细胞；
[0039]6)将步骤5)所述培养皿中的冲洗液转移到无菌的50ml离心管中；
[0040]7)将步骤6)所述离心管于2000rpm离心6min，移去上清液，保留细胞沉淀；
[0041]8)在步骤7)所述离心管中加入4ml的培养液B重悬细胞；
[0042]9)在collagen I包被的培养皿中加入4ml培养液B，再铺上步骤8)所述细胞悬浮液，然后将培养皿放进32.5°C、5.5 % CO2、饱和湿度的细胞培养箱中孵育2小时；
[0043]10)从培养箱中取出培养皿，用5ml移液管温和地在培养皿表面反复吸吹5-10次，使细胞混合，再将培养皿放回培养箱中继续培养2小时；
[0044]11)从培养箱中取出培养皿后，用5ml移液管在培养皿中温和地吸吹细胞悬浮液，直至冲洗过整个培养皿表面，再用5ml移液管从培养皿中收集collagen I不吸附的细胞悬浮液，全部转移到50ml离心管中；这时被collagen I吸附的细胞大部分是分化的生殖细胞，细胞悬浮液中未被吸附的大部分是精原干细胞；
[0045]12)将步骤11)所述离心管在2000rpm下离心6min,沉淀细胞,除去上清液,用4ml培养液D悬浮细胞，然后吸取细胞悬浮液通过200目尼龙过滤器，用50ml试管收集滤液；培养液D中加入了 β_巯基乙醇，具有抗氧化作用，对精原干细胞有保护作用；[0046]13)迅速地将步骤12)得到的滤液用5ml移液管温和的吸吹4_5次，然后将混合好的滤液按每孔Iml铺入Laminin包被的12孔培养板，其中所述培养板预先准备好，临用时先移除每个孔中的上清液，再加入1ml培养液A清洗，移除所有培养液A后才铺入上述滤液；此步骤操作必须迅速才能更好地保护分离得到的精原干细胞；
[0047]14)将步骤13)所述培养板置于32.5°C，5.5 % CO2，饱和湿度的细胞培养箱中孵育20-40分钟，然后取出，用Iml微量移液管非常温和的吸吹所述培养板的培养孔表面一遍，使孔中的细胞悬浮液上下层混合，然后迅速放回培养箱中继续孵育10-30分钟；孵育时间非常关键，或长或短都会直接影响最后纯化获得的精原干细胞的数量和质量；
[0048]15)将步骤14)所述培养板取出，用Iml微量移液管吸吹一次，使孔中细胞悬浮液混合均匀，此时悬浮液中的细胞为Laminin不粘附细胞，将这些细胞悬浮液从培养孔中移走，然后，立即在培养孔中加入1ml新鲜配制的培养液D洗培养孔表面一遍，然后移走培养孔中的培养液D，立即再次向孔中加入1ml新鲜配制的培养液D。培养液D要温和且均匀地滴加在孔的整个表面，孔中粘附的细胞为Laminin粘附细胞；此时Laminin粘附细胞就是精原干细胞，而移走的Laminin不粘附细胞为分化了的生殖细胞；
[0049]16)用Iml微量移液管从步骤15)所述培养孔中移走培养液D，然后立即向培养孔内加入1ml PBS-BSA溶液，然后将培养板放入32.5°C，5.5 % CO2,饱和湿度的细胞培养箱内，孵育3-6分钟，同时在一个50ml的无菌试管中加入4ml培养液D备用；
[0050]17)将步骤16)所述培养板取出，立即用Iml移液管在培养孔中温和的吹吸PBS-BSA溶液5-10次，使Laminin粘附细胞从培养孔上脱壁，收集含有Laminin粘附细胞的PBS-BSA溶液，将含有Laminin粘附细胞的PBS-BSA溶液转移到含有培养液D的50ml离心管中；PBS-BSA溶液可以从Laminin平板上洗脱粘附的精原干细胞；
[0051]18)将步骤17)所述离心管在2000rpm转速下离心6min,移除上清液,倒转试管，温和地除去剩余的液体；
[0052]19)在步骤18)所述离心管中加入1ml培养液D重新悬浮细胞，用细胞计数板测定细胞浓度；
[0053]20)通过免疫荧光细胞染色法鉴定步骤19)所述细胞悬浮液中的细胞就是绵羊精原干细胞。
[0054]只要严格按照上述绵羊精原干细胞分离纯化方法进行操作，任何细胞实验室的研究人员都能成功分离纯化出精原干细胞，而且经过不同实验室不同操作人员，包括教授及普通研究生的操作实践表明，采用以上方法均能成功分离纯化出绵羊精原干细胞，制备的绵羊精原干细胞纯度可达90%以上。
[0055]对上述绵羊精原干细胞的传代长期培养方法，包括以下步骤:
[0056]第一步:配制溶液:
[0057]I)将体积百分比为7%的胎牛血清加入DMEM/F12培养液中制成STO细胞培养液；
[0058]2)将体积百分比为20%的胎牛血清、10%的二甲基亚砜加入DMEM/F12培养液中制成STO细胞冻存液；
[0059] 3)在ImlSSCB溶液中，分别添加20ng/μ I的胶质细胞源性神经营养因子储备液I μ 1-2μ l,20ng/y I的碱性成纤维细胞生长因子储备液I μ IUOOng/μ I的胶质细胞系源性神经营养因子受体α I样蛋白抗体储存液I μ l、100kU/ml的青霉素储存液I μ 1、100mg/ml的链霉素储存液I μ 1、2.5mg/ml的抗真菌剂储存液I μ 1，混合均匀制成SSCM培养液；SSCM是专门为家畜精原干细胞制备的培养液，长期实践证明能有效培养精原干细胞；
[0060]其中所述I升SSCB溶液所包含的组分为:
[0061]
【权利要求】
1.一种绵羊精原干细胞分离纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤: 第一步:配制溶液: . 1)将体积百分比为0.1 %的抗菌-抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液A，两周内使用； .2)将IV型胶原酶以20mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液中制成IV型胶原酶储备液，-20°C保存； . 3)将透明质酸酶以10mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液中制成透明质酸酶储备液，_20°C保存； .4)将DnaseI以5mg/ml的浓度加入DMEM低糖培养液，再加入体积百分比为20%的甘油，制成DNaseI储备液，_20°C保存； . 5)将体积百分比为0.5 %的Trypsin和浓度为2mM EDTA溶于PBS缓冲液中制成Trypsin/EDTA 储备液，_20°C保存； . 6)将体积百分比为10%的胎牛血清和0.1%的抗菌-抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液C，两周内使用；. 7)将体积百分比为5.5%的马血清、2.4%的胎牛血清和0.1 %的抗菌-抗真菌剂加入DMEM/F12培养液中制成培养液B，两周内使用； 8)将30μ M的β-硫基乙醇加入培养液C中，过滤灭菌制成培养液D，现配现用； 9)将体积百分比为0.52%的牛血清白蛋白溶于PBS缓冲液中，过滤灭菌制成PBS-BSA溶液，现配现用； 第二步:应用两步酶解法制备绵羊睾丸组织单细胞悬浮液，无菌条件下操作步骤依次如下: . 1)从3-4月龄的绵羊睾丸中取2-3g曲细精管组织块，放入载有2.5ml培养液A的.100mL培养皿中，用镊子除去曲细精管组织块上的睾丸白膜和较大的血管； .2)将所剩的组织块放入20ml小瓶中，用眼科直剪刀剪碎，持续剪3分钟； .3)将剪碎的组织块转移到一个100mL带盖的大口瓶中，补加培养液A至7.5ml ； . 4)进行第一步酶消化，具体操作如下:在上述100mL带盖的大口瓶中加入0.63ml的IV型胶原酶储备液，置于37°C水浴摇床中，以90rpm的转速摇荡40min ;然后加入0.825ml的透明质酸酶储备液和0.125ml的DNaseI储备液，继续置于37°C水浴摇床中，以90rpm的转速摇荡20min。 . 5)从水浴摇床中取出100mL带盖的大口瓶，用IOml移液管温和地上下吸吹悬浮物5次； . 6)将步骤5)所述100mL带盖的大口瓶中的悬浮液转入50ml离心管，以2000rpm的转速离心6min,除去上清液； . 7)在步骤6)所述离心管中加入12ml的PBS缓冲液，摇匀使沉淀物重新悬浮，以.2000rpm的转速离心6min,除去上清液； .8)重复步骤7的操作一次； . 9)进行第二步酶解，在步骤8)所述离心管中加入0.75ml的培养液A重新悬浮沉淀物，再.加入1ml的Trypsin/EDTA储备液和0.25ml的DNaseI储备液，置于37°C水浴摇床中，以.90rpm的转速摇荡lOmin，用IOml移液管温和地上下吸吹悬浮物5次；10)在步骤9)所述离心管中加入IOml的培养液C，用IOml移液管温和地上下吸吹悬浮物直到明显的块状物消失； 11)将步骤10)所述离心管以2000rpm的转速离心6min,除去上清液,然后用2ml培养液C重悬细胞； 12)先用200目尼龙过滤器然后用300目尼龙过滤器分别过滤步骤11)所述细胞悬浮液； 13)将步骤12)所述的过滤后的细胞悬浮液用IOml移液管温和地吸吹5-10次，进行细胞计数，然后加入培养液C调整细胞密度至1.25xl06细胞/ml，制成单细胞悬浮液； 第三步:从第二步所述单细胞悬浮液中纯化精原干细胞，操作步骤依次如下: 1)将IOml第二步步骤13)所述的单细胞悬浮液铺于直径为IOOmm的明胶包被培养皿，放在32.50C ,5.5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中，培养2天半至3天半； 2)用5ml移液管从步骤I)中所述培养皿中温和地移除所有培养液； 3)先用培养液A洗细胞 :从培养皿的边缘缓慢加入4ml预热的培养液A，温和地来回晃动培养皿I次，然后用移液管移除培养液； 4)再用PBS缓冲液洗细胞两次:从培养皿的边缘缓慢加入4ml预热的PBS缓冲液，温和地来回晃动培养皿I次，立即用移液管移除上清液，再重复操作一次； 5)加4ml培养液A至培养皿中，用移液管吸吹培养液A轻轻冲洗培养皿整个表面大约2遍； 6)将步骤5)所述培养皿中的冲洗液转移到无菌的50ml离心管中； 7)将步骤6)所述离心管于2000rpm离心6min,移去上清液,保留细胞沉淀； 8)在步骤7)所述离心管中加入4ml的培养液B重悬细胞； 9)在collagenI包被的培养皿中加入4ml培养液B，再铺上步骤8)所述细胞悬浮液，然后将培养皿放进32.5°C、5.5 % CO2、饱和湿度的细胞培养箱中孵育2小时； 10)从培养箱中取出培养皿，用5ml移液管温和地在培养皿表面反复吸吹5-10次，使细胞混合，再将培养皿放回培养箱中继续培养2小时； 11)从培养箱中取出培养皿后，用5ml移液管在培养皿中温和地吸吹细胞悬浮液，直至冲洗过整个培养皿表面，再用5ml移液管从培养皿中收集collagen I不吸附的细胞悬浮液，全部转移到50ml离心管中； 12)将步骤11)所述离心管在2000rpm下离心6min,沉淀细胞,除去上清液,用4ml培养液D悬浮细胞，然后吸取细胞悬浮液通过200目尼龙过滤器，用50ml试管收集滤液； 13)迅速地将步骤12)得到的滤液用5ml移液管温和的吸吹4_5次，然后将混合好的滤液按每孔Iml铺入Laminin包被的12孔培养板，其中所述培养板预先准备好，临用时先移除每个孔中的上清液，再加入1ml培养液A清洗，移除所有培养液A后才铺入上述滤液； 14)将步骤13)所述培养板置于32.5°C,5.5 % CO2，饱和湿度的细胞培养箱中孵育20-40分钟，然后取出，用Iml微量移液管非常温和的吸吹所述培养板的培养孔表面一遍，使孔中的细胞悬浮液上下层混合，然后迅速放回培养箱中继续孵育10-30分钟； 15)将步骤14)所述培养板取出，用Iml微量移液管吸吹一次，使孔中细胞悬浮液混合均匀，此时悬浮液中的细胞为Laminin不粘附细胞，将这些细胞悬浮液从培养孔中移走，然后，立即在培养孔中加入1ml新鲜配制的培养液D，再用Iml微量移液管吸吹培养孔表面一遍，然后移走培养孔中的培养液D，立即再次向孔中加入1ml新鲜配制的培养液D。培养液D要温和且均匀地滴加在孔的整个表面，孔中粘附的细胞为Laminin粘附细胞； 16)用Iml微量移液管从步骤15)所述培养孔中移走培养液D，然后立即向培养孔内加入Iml新鲜配制的PBS-BSA溶液，然后将培养板放入32.5°C，5.5 % CO2,饱和湿度的细胞培养箱内，孵育3-6分钟，同时在一个50ml的无菌试管中加入4ml培养液D备用。 17)将步骤16)所述培养板取出，立即用Iml移液管在培养孔中温和的吹吸PBS-BSA溶液5-10次，使Laminin粘附细胞从培养孔上脱壁，收集含有Laminin粘附细胞的PBS-BSA溶液，将含有Laminin粘附细胞的PBS-BSA溶液转移到含有培养液D的50ml离心管中； 18)将步骤17)所述离心管在2000rpm转速下离心6min,移除上清液,倒转试管,温和地除去剩余的液体； 19)在步骤18)所述离心管中加入1ml培养液D重新悬浮细胞，用细胞计数板测定细胞密度； 20)通过免疫荧光细胞染色法鉴定步骤19)所述细胞悬浮液中的细胞就是绵羊精原干细胞。
2.通过权利要求1所述绵羊精原干细胞分离纯化方法制备的绵羊精原干细胞。
3.对权利要求2所述绵羊精原干细胞的传代长期培养方法，包括以下步骤: 第一步:配制 溶液: 1)将体积百分比为7%的胎牛血清加入DMEM/F12培养液中制成STO细胞培养液； 2)将体积百分比为20%的胎牛血清、10%的二甲基亚砜加入DMEM/F12培养液中制成STO细胞冻存液； 3)在ImlSSCB溶液中，分别添加20ng/μ I的胶质细胞源性神经营养因子储备液Iμ 1-2μ l,20ng/y I的碱性成纤维细胞生长因子储备液I μ IUOOng/μ I的胶质细胞系源性神经营养因子受体α I样蛋白抗体储存液I μ l、100kU/ml的青霉素储存液I μ 1、100mg/ml的链霉素储存液I μ 1、2.5mg/ml的抗真菌剂储存液I μ 1，混合均匀制成SSCM培养液； 第二步:制备滋养层细胞，依次如下操作: 1)滋养层细胞的预制:用STO细胞培养液培养STO细胞，细胞汇合度达到70%-80%时，按终浓度15μ g/ml加入丝裂霉素，放入细胞培养箱，在37°C、5% CO2、饱和湿度的条件下培养2小时，然后移走含有丝裂霉素的培养液，并用IOmlPBS洗三次，再用Iml权利要求1所述Trypsin/EDTA消化液使细胞脱壁，并用5ml权利要求1所述培养液C终止Trypsin的消化作用，收集消化后的细胞，2000rpm离心5min，取沉淀的细胞，按浓度为6 X IO5细胞/mL的浓度加入STO细胞冻存液，液氮保存； 2)制备滋养层细胞:将步骤I)所述丝裂霉素处理过的STO细胞，以2XIO5细胞/mL的终浓度将细胞接种在事先由明胶处理过的12孔细胞培养板中，在37°C，5% CO2，饱和湿度的条件下培养12-24小时； 第三步:传代长期培养绵羊精原干细胞，操作步骤如下: I)精原干细胞的原代培养:移除第二步步骤2)所述12孔细胞培养板中STO滋养层中的含血清培养液,并用PBS缓冲液洗两次，然后将权利要求2所述分离纯化好的精原干细胞用SSCM培养液重悬，以2-5 X IO4细胞/mL的密度接种到铺好STO滋养层的12孔细胞培养板中，然后将培养板放在37°C、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，第二天换一次SSCM培养液，以后每隔2天换一次SSCM培养液； 2)精原干细胞的传代长期培养:将步骤I)所述原代培养的精原干细胞培养6-9天，取出培养板，移除SSCM培养液，除去漂浮的细胞，在培养孔内加入1ml新鲜配置的SSCM培养液，并用ImL移液管轻轻吹吸，使精原干细胞从滋养层细胞上脱离，将精原干细胞悬浮液转移到50ml离心管，重复操作1-2次，将装有精原干细胞悬浮液的离心管用2000rpm离心5min，弃上清，用SSCM培养液重悬细胞，接种到新的STO滋养层细胞上，在原代培养后的前三次传代以1:1或者1: 1.5的比例进行，之后传代以1:2-1:3的比例进行，每隔2天换一次SSCM培养液，培养好的精原干细胞根据需要进行冻存、利用或继续传代培养。
4.对权利要求3所述传代长期培养的绵羊精原干细胞进行冻存的方法，包括以下步骤:将权利要求3所述传代长期培养的精原干细胞，用ImL吸液管温和地轻轻吹打，使精原干细胞从STO滋养层细胞上脱离，收集精原干细胞至50ml离心管，进行细胞计数，然后2000rpm离心5min，弃上清，用无血清细胞冻存液重悬细胞并调整浓度至5 X 104_2 X IO5细胞/ml，分装到冻存管内，4°C放置30min，_80°C放置24h，之后转入液氮罐中长期保存。
5.对权利要求4所述冻存的绵羊精原干细胞进行复苏的方法，包括以下步骤:将权利要求4所述冻存管从液氮罐中取出，在37°C水浴中快速融化3分钟，在超净工作台中将细胞转入含有IOml SSCM培养液的50ml离心管中，2000rpm离心6分钟，弃上清液，将沉淀物重悬于l_3mlSSCM培养液中，转移到12孔培养板，每孔1ml，置于37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中，隔2天换一次SSCM培养液，培养2-3天。
6.根据权利要求3所述绵羊精原干细胞的传代长期培养方法，其特征在于，其中所述I升SSCB溶液所包含的组分为:
【文档编号】C12N5/071GK104004708SQ201410265999
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月16日 优先权日:2014年6月16日
【发明者】吴应积, 罗奋华, 张岩, 刘林洪, 萨初拉 申请人:内蒙古大学