专利名称：从人干细胞中分离高活性干细胞的方法及由此分离的高活性细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及从人干细胞中分离高活性干细胞的方法、由该方法分离得到的干细胞 以及含有该干细胞的细胞治疗剂和特定的培养基。
背景技术：
干细胞能够分化成构成有机体组织的各种细胞，其通常指从胚胎、胎儿和成人组 织中获得的未分化细胞。干细胞因特定的分化刺激(环境)而分化为特定的细胞；与已经 停止细胞分裂的分化细胞不同，干细胞能够通过细胞分裂(自我更新)产生相同的细胞进 行增殖(扩增)；其特点是分化的可塑性，即它们能在不同的环境或分化刺激下可分化为其 他细胞。干细胞主要分为胚胎干细胞(ES细胞)和多能性多能成体干细胞；胚胎干细胞从 胚胎中获得，其属于多能干细胞，能够分化为所有类型的细胞；多能性多能成体干细胞从组 织中获得。胚胎发育早期胚囊期的内细胞群将来发育为胎儿，而从内细胞群中分离出的胚 胎干细胞理论上具有全能性，能够分化为构成有机体的每一种组织的细胞。也就是说，与成 体干细胞不同，胚胎干细胞是未分化的细胞，其能够无限增殖，可分化为所有细胞种类，而 且可通过形成生殖细胞而遗传给下一代。人胚胎干细胞是通过分离和培养人胚囊的内细胞群而制备，全世界所有人胚胎 干细胞的制备都源自经无菌处理后冷冻保存的胚胎。由于其具备可分化为所有细胞的多 能性，这类细胞的特点为其可分化为每一种类型组织的细胞，而且可通过形成生殖细胞 而遗传给下一代(Thomson 等.，Science，282 1145-1147，1998 ；及 Reubinoff 等，Nat. Biotechnol.，18 :399_404，2000)。使用多能性人胚胎干细胞作为细胞治疗剂的各种方法仍然均未完全克服如致癌 作用和免疫排斥等问题。最近报道，间充质干细胞具有免疫调节作用并可成为解决这类问题的替代物。间 充质干细胞是多能性细胞，可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌 细胞等，据报道其具有调节免疫反应的作用。它们可从多种组织中分离，但是，根据其来源 它们的能力和细胞表面标记彼此不同。因此，间充质干细胞目前确定能够分化为骨细胞、软 骨细胞、肌细胞、螺旋状细胞，及SH2 (+)、SH3 (+)、CD34 (-)和CD45 (-)的基本细胞表面标记。细胞治疗或细胞再生药物中必需的最小细胞数目为约1X109。然而，还需要另外 数量的细胞以进行实验确定条件和建立一个标准。就现有各种来源的间充质干细胞的情 况，获得这个细胞数量至少需要转代培养10代。那么，这些细胞就会老化和改变，如此会使 得它们不足以用于治疗。这是当前间充质干细胞培养系统所涉及的问题之一。此外，甚至 当使用这些细胞确定了条件和标准后，在用于治疗之前这些细胞就被耗尽了。这种情况下， 除了使用其他间充质干细胞外，就别无选择了，而使用不同的细胞还需要另外进行实验。因 此，人们需要新方法以便有可能使用现有间充质干细胞作为治疗剂来解决上述问题。
韩国专利公开No. 2008-3418教导了一种诱导胚胎干细胞成为胰细胞的方法，韩 国专利No. 10-593397公开了一种含有间充质干细胞和/或P物质的愈伤或促愈伤制剂，或 细胞治疗剂。发明概述因此，本发明的设计满足上述需求，其目的是提供一种制备用于细胞治疗和细胞 再生药物的细胞，该方法克服了以前离体培养扩增人干细胞的局限，保持对老化细胞恢复 活力，应用于具有各种遗传背景的细胞。根据本发明的一个方面，其提供用于从人干细胞中分离高活性干细胞的方法。进一步地，根据本发明的另一个方面，其提供所述方法分离的高活性干细胞。此外，根据本发明的另一个方面，其提供包含所述干细胞的细胞治疗剂。再进一步地，根据本发明的另一个方面，其提供一种用于从人干细胞中分离高活 性干细胞的特定培养基。根据本发明，由于该方法可用于以前建立的间充质干细胞，以及目前提供的作为 间充质干细胞来源的、其他不同条件培养的各种来源人间充质干细胞，该方法在研制细胞 治疗剂方面非常有用。
结合附图分别所示，通过以下描述，本发明的上述及其他目的和特征将更加明 显图1 该照片显示由本发明方法产生的干细胞球。图2 对本发明方法分离的干细胞，通过荧光激活细胞分选法(FACS)做细胞周期 测定，其证实了表明旺盛增殖的S(合成)期增长。图3 本发明方法分离的干细胞的细胞因子分泌测定，其显示IL-6、GM_CSF、VEGF、 HGF、IL-8、IFN-g 和 bGFG 的大幅增长。图4 通过本发明方法增强干细胞特性，其显示0CT-4和E-钙粘连蛋白作为多能 细胞标记的增长。图5 该图示出本发明方法的过程。发明详述以下详述本发明。为实现本发明目的，本发明提供一种从人干细胞中分离高活性干细胞的方法，其 包括培养人干细胞以形成干细胞球。更特别地，该方法包括如下步骤(a)培养人干细胞以形成干细胞球；以及(b)将所述干细胞球与其他未形成球的细胞分离。在本发明方法中，步骤(a)可以使用低吸附皮氏培养皿在无牛血清培养基中实 施。所述无牛血清培养基可优选含有无牛血清DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基， Dulbecco's Modified Eagle's Medium)和20% SR(血清替代物)。所述低吸附皮氏培养 皿是导致其吸附贴壁生长细胞时吸附效率小于5%的皮氏培养皿。优选地，步骤(a)可通过用蛋白质酶处理人干细胞和将处理过的细胞悬浮于含有 无牛血清DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基)和20% SR的培养基中20 28h来实施，优选使用低吸附皮氏培养皿培养24h。所述蛋白质酶为，但不限于，胰蛋白酶。步骤(b)可通过使用，但不限于，过滤器来将所述干细胞球与其他未形成球的细 胞分离。所述干细胞优选为间充质干细胞。本文所用术语“干细胞”是指主细胞(master cell)，其可无限增殖以形成组织和 器官的特化细胞。干细胞是多能性或多能细胞。一个干细胞分裂为两个子干细胞，或分裂 为一个子干细胞和一个过渡细胞，并不断增殖成为一个成熟、完全的组织类型细胞。本文所用术语“间充质干细胞”是指其可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和其 他细胞，特征为其漩涡形状和其标准细胞表面标记SH2 (+)、SH3 (+)、CD34 (-)和CD45 (-)的 表达量。本发明方法包括使用吸附率的皮氏培养皿在无牛血清培养基中培养人干细胞以 形成干细胞球。在所述步骤中，所述用于形成干细胞球的无牛血清培养基是DMEM标准培养 基和血清替代物(SR)的组合。本领域技术人员可以理解，根据情况多种细胞因子可以被加 入其中。本发明方法使用的血清替代物(SR)被用于替代FBS，在人胚胎干细胞培养中其目 的是去除源自动物的因素。在本发明中，SR用于提供营养和悬浮细胞，而FBS是有助于贴 壁细胞的吸附率。本发明还提供由所述方法分离的高活性干细胞。所述分离的干细胞表现出增强的 细胞因子分泌，以及增强的干细胞基因表达、细胞存活和细胞生长(参见图2 4)。荧光激活细胞分选法(FACS)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和实时PCT扩增证实，本 发明方法分离的干细胞与不同来源的干细胞显示相似的结果。进一步地，本发明提供包含有本发明方法分离的干细胞的细胞治疗剂。特别地，所述细胞治疗剂可用于产生脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细 胞、心肌细胞和其他细胞。本发明所用术语“细胞治疗剂”是指包含经分离、培养和特定操作制备的人细胞 或组织并用于治疗、诊断和预防(美国FDA指南)的药物；更特别地，是指任何方法制备的 用于治疗、诊断和预防的药物，该方法包括在体外对自体、同源或异源的细胞进行增殖或分 选，或修改细胞的生物学特性以恢复细胞或组织的功能。根据其分化水平，细胞治疗剂主要 分为体细胞治疗剂和干细胞治疗剂，而本发明涉及一种干细胞治疗剂。本发明还提供一种含有SR等的、用于从干细胞中分离高活性干细胞的培养基。所 述培养基优选地可含有无牛血清DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基)和20% SR。所述 干细胞优选为间充质干细胞。本领域技术人员可以理解，所述培养基还可含有其他支持性组分以从所述干细胞 中分离高活性干细胞。本发明由下列实施例进一步说明。可以理解，这些实施例辅以图示的方式展示的 仅为本发明的优选实施方式，并非旨在限制本发明的范围。实施例干细胞球的形成将离体培养维持的人干细胞用蛋白质酶(0.25%胰蛋白酶/EDTA)处理，并悬浮 于使用低吸附皮氏培养皿(SPL)、含有无牛血清DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基)和 20% SR(GIBCO)的培养基中 24h。干细胞球的分离使用过滤器将通过悬浮所述细胞24h形成的干细胞球与其他未形成球的干细胞 分离。分离细胞的特件测定1)用实时PCT扩增进行基因表达量测定从分离细胞的总RNA合成了 cDNA，使用与干细胞基因相关的引物进行实时PCT扩增。2)通过抗原_抗体反应进行细胞因子测定在分离细胞的培养基中使用抗体测定各种细胞因子分泌能力。3)通过荧光激活细胞分选法(FACS)进行细胞周期测定通过细胞核染色确定分离细胞的细胞周期。实施例1 从源自人脐带血的间充质干细胞分离高活件干细胞根据本发明方法，高活性的间充质干细胞分离自源于人脐带血的间充质干细胞。 将离体培养维持的所述干细胞用蛋白质酶(0. 25%胰蛋白酶/EDTA)处理，并悬浮于使用 低吸附皮氏培养皿(SPL)、含有无牛血清DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基)和20% SR(GIBCO)的培养基中24h。使用过滤器将通过悬浮所述细胞24h形成的干细胞球与其他 未形成球的干细胞分离。从分离细胞的总RNA合成了 cDNA，使用与干细胞基因相关的引物 进行实时PCT扩增，测定与所述干细胞标记相关的基因表达的水平。在分离细胞的培养基 中使用抗体测定各种细胞因子分泌能力，并通过细胞核染色确定分离细胞的细胞周期。结果发现，在干细胞球形成后与干细胞相关基因表达的水平增加了，在S(合成) 期与干细胞相关基因表达的水平也大大增加了。同样与血管生成和生长相关的细胞因子也 大大增加了。实施例2 从源自人胚胎干细胞的间充质干细胞分离高活性干细胞根据本发明方法，高活性的间充质干细胞分离自源于人胚胎干细胞的间充质干细 胞。将离体培养维持的所述干细胞用蛋白质酶(0.25%胰蛋白酶/EDTA)处理，并悬浮于使 用低吸附皮氏培养皿、含有无牛血清DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基)和20% SR的 培养基中24h。使用过滤器将通过悬浮所述细胞24h形成的干细胞球与其他未形成球的干 细胞分离。从分离细胞的总RNA合成cDNA，使用与干细胞基因相关的引物进行实时PCT扩 增，测定与所述干细胞标记相关的基因表达的水平。在分离细胞的培养基中使用抗体测定 各种细胞因子分泌能力，并通过细胞核染色确定分离细胞的细胞周期。结果发现，在干细胞球形成后与干细胞相关基因表达的水平增加了，在S(合成) 期与干细胞相关基因表达的水平也大大增加了。同样与血管生成和生长相关的细胞因子也 大大增加了。尽管本发明已通过上述特定实施方式针进行了描述，但应能理解，本领域技术人 员可对本发明做出各种修改和变化，其也应落入本发明所附权利要求书所限定的保护范围。
权利要求
1.一种从人干细胞中分离高活性干细胞的方法，其包括步骤(a)培养人干细胞以形成干细胞球；以及(b)将所述干细胞球与其他未形成球的细胞分离。
2.根据权利要求1的方法，其中，步骤(a)是通过利用低吸附皮氏培养皿在无牛血清培 养基中实施的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述无牛血清培养基含有无牛血清的DMEM和 20% SR (血清替代物)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)是通过利用低吸附皮氏培养皿，用蛋白 质酶处理人干细胞及将处理过的细胞悬浮于含有无牛血清的DMEM和20% SR的培养基中 20 28h来实施的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述干细胞为间充质干细胞。
6.通过权利要求1 5中任一项所述方法分离的高活性干细胞。
7.用于产生脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞或心肌细胞的细胞治疗剂， 其包含权利要求6所述的高活性干细胞。
8.用于由人干细胞中分离高活性干细胞的培养基，其含有无牛血清的DMEM和20%SR。
全文摘要
本发明涉及从人干细胞中分离高活性干细胞的方法、通过该方法分离得到的干细胞、含有该干细胞的细胞治疗剂，以及用于由含有特定细胞因子的干细胞中分离高活性干细胞的培养基。根据本发明，该方法可用于从各种来源的间充质干细胞中分离高活性干细胞。此外，由于本发明的方法可应用于在不同条件下培养的、各种来源的干细胞，其在开发高活性的细胞治疗剂方面非常有用。基于体外数次转代培养增加的老化干细胞可被有效地挑选出来，因而本发明的方法可用于活化干细胞。
文档编号C12N5/0775GK102112599SQ200980129793
公开日2011年6月29日 申请日期2009年7月17日 优先权日2008年7月28日
发明者姜炫在, 李银珠, 金孝洙 申请人:首尔大学医院