专利名称：一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒学、分子生物学和生物制品领域，与病毒疫苗、病毒性疾病诊断及基因治疗有关。
目前，正在使用的汉坦病毒灭活疫苗主要有3种地鼠肾细胞灭活疫苗、沙鼠肾细胞灭活疫苗、纯化的鼠脑灭活疫苗。这些传统疫苗生产使用的都是原代细胞培养或动物器官接种的方法培养活病毒，再使用灭活剂灭活病毒后制成的。由于原代细胞或动物器官本身的不均一性，因此具有产量和质量不稳定的缺点。由于必须使用灭活剂灭活，会对病毒抗原性有影响。灭活疫苗的生产中必须使用活病毒，存在着工作人员被感染和环境污染的问题。疫苗生产中使用的灭活剂福尔马林或β-丙内酯均是致癌剂。开发新型疫苗的目的则是避免这些问题。
痘苗病毒作为载体表达汉坦病毒结构蛋白已有不少成功例子。美国陆军传染病研究所以痘苗病毒为载体，表达了汉坦病毒76-118株的M和S片段，构建了单独表达M和S及同时表达M加S的重组痘苗病毒，并用共表达M和S的重组痘苗病毒制备了疫苗。但由于痘苗病毒载体本身具有的缺点，如严重副反应等，使之难以广泛应用。以杆状病毒为载体表达全长M片段、全长S片段以及G1和G2亚单位也已获得成功，但目前从这种表达系统中纯化病毒蛋白到人用疫苗水平尚有大量工作要做。在本发明出现之前，尚未见有成功获得稳定表达汉坦病毒样颗粒的哺乳动物细胞系的报道。
开发一种方便、可靠的血清诊断方法来检测受感染个体血清内的抗汉坦病毒抗体不仅有利于病毒病的诊断，并且还可通过检测型特异性的抗体用于病毒型别的鉴定，这对于临床和流行病学都具有重要的意义。已经证明，汉坦病毒糖蛋白上的一些抗原表位与构象高度相关，在大肠杆菌中表达的糖蛋白由于不能进行翻译后加工，丧失了一些天然病毒的抗原性和免疫原性。本发明提供的这种在真核细胞中表达的核蛋白和糖蛋白，可以作为更具代表性的抗原或者更有效的免疫原。
基于当前汉坦病毒感染的研究现状和CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)已经用于疫苗生产的现实，建立通过这两种哺乳动物细胞系表达重组汉坦病毒结构蛋白和重组汉坦病毒样颗粒的方法将是非常有用的。该系统产生的重组汉坦病毒结构蛋白和汉坦病毒样颗粒具有天然蛋白的免疫学特性，这种具有天然构象的重组蛋白、重病毒样颗粒以及它们的不同组合，对于汉坦病毒病的预防、诊断和治疗是非常有用的。
发明详述本发明陈述的一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系及其用途，主要包括由引起肾综合症出血热(HFRS)的四种汉坦病毒型M和S基因整合入哺乳类细胞后所产生的不同汉坦病毒型别和基因组成的病毒样颗粒及其生产细胞系，该汉坦病毒样颗粒具有与天然汉坦病毒类似的免疫原性和抗原性。其主要用途将作为一类新型汉坦病毒基因工程疫苗，包括单价和多价疫苗。所陈述的细胞系将用于新型汉坦病毒基因工程疫苗的生产，所生产的疫苗将用于HFRS的预防，同时可用于诊断试剂和基因治疗中的新型载体的研发。
本发明陈述的一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系及其用途，主要内容包括以下几点1、一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于每种工程细胞系分别整合有汉坦病毒姬鼠型(HTN)、家鼠型(SEO)、棕背鲆型(PUU)、杜布洛瓦型(DOB)四个血清型汉坦型病毒的M片断和S片断基因或上述各型汉坦病毒单一的M片断基因。2、一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于工程细胞系分为两类，一类为可稳定表达各型汉坦型病毒M片断基因编码的汉坦病毒糖蛋白G1和G2和S片断基因编码的汉坦病毒核蛋白；另一类为单一稳定表达各型汉坦型病毒M片断基因编码的汉坦病毒糖蛋白G1和G2。3、一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于通过汉坦病毒糖蛋白和核蛋白在哺乳动物细胞内的共同持续稳定表达或汉坦病毒糖蛋白在哺乳动物细胞内的单一持续稳定表达，可在细胞内形成汉坦病毒样颗粒并分泌到细胞外，从而在细胞培养上清中可持续收获汉坦病毒样颗粒。4、一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于该组细胞系可持续生产权利要求(1)和(2)中所述四型汉坦病毒中的任何一型整合基因所决定的汉坦病毒样颗粒，其中包括汉坦病毒糖蛋白和核蛋白共同表达形成的病毒样颗粒和汉坦病毒糖蛋白单一表达形成的病毒样颗粒。5、权利要求(1-4)所述的一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征为该细胞系为中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，也可以为用于生产的任何一种可能的哺乳类动物细胞。6、根据权利要求(4)，一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系所生产的不同汉坦病毒型别和不同基因组成的汉坦病毒样颗粒，可根据今后实际应用的需要在体外单独或任意配伍组合使用。7、一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于该组细胞系生产的不同汉坦病毒型别和不同基因组成的汉坦病毒样颗粒，具有和天然汉坦病毒的糖蛋白和核蛋白类似的免疫原性，无论是单一型别重组汉坦病毒样颗粒或不同型别汉坦病毒样颗粒配伍使用，均可在动物或人体内诱导产生特异性中和抗体和其他相应的免疫反应。8、一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于该组细胞系生产的不同汉坦病毒型别和不同基因组成的汉坦病毒样颗粒，具有和天然汉坦病毒的糖蛋白和核蛋白类似的抗原特性，能与天然汉坦病毒结构蛋白诱导产生的多克隆和单克隆抗体发生特异性结合。9、根据权利要求(1-8)，一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系的用途，其特征在于该组细胞系生产的不同汉坦病毒型别和不同基因组成的汉坦病毒样颗粒，可以用于制备汉坦病毒疫苗，可以用单一型别汉坦病毒样颗粒或不同型别汉坦病毒样颗粒的不同组合制备汉坦病毒疫苗，这些疫苗在人群中使用后，能够预防不同型别的汉坦病毒感染。9、根据权利要求(1-8)，一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系的用途，其特征在于一组以哺乳动物细胞系表达的汉坦病毒重组核蛋白、重组糖蛋白、病毒样颗粒或它们的组合作为抗原组分构成汉坦病毒诊断试剂盒和汉坦病毒分型诊断试剂盒。10、根据权利要求(1-8)，一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系的用途，其特征在于通过各种分子生物学方法，在汉坦病毒样颗粒内部包装具有治疗作用的基因，这些基因可以是RNA或DNA，通过汉坦病毒样颗粒将这些基因转移到体内，作为基因治疗的转移载体。至今国内外任何一种形式的汉坦病毒基因工程疫苗尚未成功。本发明陈述的一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系及其用途，系国际上首次发明，对病毒基因工程疫苗的发展和病毒性疾病的预防均具有很重要的意义。病毒样颗粒疫苗的制备技术不仅可用于汉坦病毒样颗粒疫苗的制备，也可用于其他病毒样颗粒疫苗的制备。
以下的优先实施例对本发明作详细说明，担不意味着限制本发明的内容。在这些实施例中，为说明本发明，用于扩增各型汉坦病毒M片断和S片断基因的病毒株为本实验室保存，表达载体由梁米芳教授构建，专利申请号01102214.0。所用CHO细胞来源于本所遗传室。实施例1-4为一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系制备方法；实施例5-12为一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系及其产物应用性特征。
倍的形态。3、 图3为纯化后的汉坦病毒样颗粒经SDS-PAGE分离后，用考马氏亮蓝染色的结果。第1泳道样品为汉坦病毒糖蛋白和核蛋白共同形成的病毒样颗粒，电泳后显示糖蛋白G1、G2和核蛋白条带。第2泳道样品为汉坦病毒糖蛋白单独形成的病毒样颗粒，电泳后显示糖蛋白G1和G2条带。第3泳道为蛋白分子量标记。4、 图4为纯化后汉坦病毒样颗粒的蛋白印迹试验结果，第1泳道样品为汉坦病毒糖蛋白和核蛋白共同形成的病毒样颗粒，可以和抗汉坦病毒核蛋白的单克隆抗体反应，显示阳性条带。第2泳道样品为汉坦病毒糖蛋白单独形成的病毒样颗粒，可以和抗汉坦病毒核蛋白的单克隆抗体反应后，不出现阳性条带。5、 图5为汉坦病毒糖蛋白单独形成的病毒样颗粒和不同抗体的反应，该颗粒能够和多克隆血清和抗汉坦病毒糖蛋白单克隆抗体反应，不能和抗汉坦病毒核蛋白单克隆抗体反应。6、 图6为汉坦病毒糖蛋白和核蛋白共同形成的病毒样颗粒和不同抗体的反应，该颗粒能够和抗汉坦病毒多克隆血清、抗汉坦病毒糖蛋白单克隆抗体和抗汉坦病毒核蛋白单克隆抗体反应。
权利要求
1.一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于每种工程细胞系分别整合有汉坦病毒姬鼠型(HTN)、家鼠型(SEO)、棕背鲆型(PUU)、杜布洛瓦型(DOB)四个血清型汉坦型病毒的M片断和S片断基因或上述各型汉坦病毒单一的M片断基因。
2.一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于工程细胞系分为两类，一类为可共同稳定表达各型汉坦型病毒M片断基因编码的汉坦病毒糖蛋白G1和G2和S片断基因编码的汉坦病毒核蛋白；另一类为单一稳定表达各型汉坦型病毒M片断基因编码的汉坦病毒糖蛋白G1和G2。
3.一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于通过汉坦病毒糖蛋白和核蛋白在哺乳动物细胞内的共同持续稳定表达或汉坦病毒糖蛋白在哺乳动物细胞内的单一持续稳定表达，可在细胞内形成病毒样颗粒并分泌到细胞外，从而在细胞培养上清中可持续收获汉坦病毒样颗粒。
4.一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于该组细胞系可持续生产权利要求(1)和(2)中所述四型汉坦病毒中的任何一型整合基因所决定的汉坦病毒样颗粒，其中包括汉坦病毒糖蛋白和核蛋白共同表达形成的病毒样颗粒和汉坦病毒糖蛋白单一表达形成的病毒样颗粒。
5.权利要求(1-4)所述的一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征为该细胞系为中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)和非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)，也可以为用于生产的任何一种可能的哺乳类细胞。
6.根据权利要求(4)，一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系所生产的不同汉坦病毒型别和不同基因组成的汉坦病毒样颗粒，可根据今后实际应用的需要在体外单独或任意配伍组合使用。
7.一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于该组细胞系生产的不同汉坦病毒型别和不同基因组成的汉坦病毒样颗粒，具有和天然汉坦病毒的糖蛋白和核蛋白类似的免疫原性，无论是单一型别重组汉坦病毒样颗粒或不同型别汉坦病毒样颗粒配伍使用，均可在动物或人体内诱导产生特异性中和抗体和其他相应的免疫反应。
8.一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，其特征在于该组细胞系生产的不同汉坦病毒型别和不同基因组成的汉坦病毒样颗粒，具有和天然汉坦病毒的糖蛋白和核蛋白类似的抗原特性，能与天然汉坦病毒结构蛋白诱导产生的多克隆和单克隆抗体发生特异性结合。
9.根据权利要求(1-8)，一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系的用途，其特征在于该组细胞系生产的不同汉坦病毒型别和不同基因组成的汉坦病毒样颗粒，可以用于制备汉坦病毒疫苗，可以用单一型别汉坦病毒样颗粒或不同型别汉坦病毒样颗粒的不同组合制备汉坦病毒疫苗，这些疫苗在人群中使用后，能够预防不同型别的汉坦病毒感染。
9.根据权利要求(1-8)，一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系的用途，其特征在于一组以哺乳动物细胞系表达的汉坦病毒重组核蛋白、重组糖蛋白、病毒样颗粒或它们的组合作为抗原组分构成汉坦病毒诊断试剂盒和汉坦病毒分型诊断试剂盒。
10.根据权利要求(1-8)，一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系的用途，其特征在于通过各种分子生物学方法，在汉坦病毒样颗粒内部包装具有治疗作用的基因，这些基因可以是RNA或DNA，通过汉坦病毒样颗粒将这些基因转移到体内，作为基因治疗的转移载体。
全文摘要
本发明为一组生产汉坦病毒样颗粒的哺乳动物工程细胞系，工程细胞系分别整合有汉坦病毒姬鼠型(HTN)、家鼠型(SEO)、棕背型(PUU)、杜布洛瓦型(DOB)各型病毒的M和S基因或单一M基因，稳定表达上述汉坦病毒M基因编码的病毒糖蛋白G1和G2和S基因编码的病毒核蛋白，并形成由糖蛋白和核蛋白共同或由糖蛋白单独组成的汉坦病毒样颗粒及其不同型别颗粒的组合。本发明的用途在于汉坦病毒样颗粒可作为一种新型基因工程疫苗预防HFRS；可作为诊断制剂用于临床诊断；可作为基因治疗中基因转移的载体。
文档编号C12N7/01GK1442479SQ0210438
公开日2003年9月17日 申请日期2002年3月5日 优先权日2002年3月5日
发明者李德新, 梁米芳, 李川 申请人:中国预防医学科学院病毒学研究所