汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒及检测方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术检测领域，特别涉及汉坦病毒核酸检测试剂盒。
【背景技术】
[0003] 虫媒病是一类重要的传染病。近20年来，全球新发现的30多种传染病中，许多是 由病媒生物传播的。目前我国法定的传染病有36种，其中鼠疫、肾综合征出血热、疟疾、登 革热与登革出血热等13种疾病为虫媒病。这类疾病在我国每年传染病总发病病例中约占 5%-10%，死亡数占传染病总死亡数的30%-40%。
[0004] 汉坦病毒（Hantavirus)是引起肾综合征出血热（HFRS)和汉坦病毒肺综合征 (HPS)的病原体，属布尼亚病毒科（Bunyaviridae)汉坦病毒属（Hantavirus)单股负链RNA 病毒。目前，全球已有40多种不同分型的汉坦病毒，其中22个型的汉坦病毒可引起人类疾 病。汉滩型汉坦病毒（HTNV)和汉城型汉坦病毒（SEOV)是引起我国HFRS的主要病原体，啮 齿动物是汉坦病毒的主要宿主。
[0005] 近半个世纪以来，肾综合征出血热严重危害我国人民健康和生命安全。20世纪50 年代共发生3568例、60年代23164例、70年代143949例、80年代696074例、90年代488330 例。病死率从1980年的6. 4%降至1993年的1.6%。该病至今仍在我国东北及环渤海地区 广泛流行，尚无特殊的治疗方法及特效药。
[0006] 随着国际贸易和旅游业的发展，病媒生物及其携带的病原体可借助交通工具、集 装箱、货物等在国际间传播。使原本局限于一定地域内的虫媒病突破国境或自然地理的界 限，在全球范围内广泛传播与流行，对输入国的卫生安全特别是口岸地区的卫生安全造成 极大的威胁。
[0007] 鼠类是出入境交通工具中常见的媒介生物之一，可随飞机、轮船等载体在国境口 岸之间扩散。历史上多次发生由于鼠类入境造成疫病暴发流行的事例。1898年，一艘汽船 将染有鼠疫耶尔森菌的褐家鼠 （Rattus norvegicus)从印度带到了马达加斯加岛，褐家鼠 在该岛大量繁殖，使当地鼠疫频繁发生。近年来，我国卫生检疫机构在北京、上海、宁波、成 都等口岸的入境飞机、轮船、集装箱中查获大量的鼠类。鼠类的输入对我国国境口岸的卫 生安全构成严重威胁。
[0008] 加强对啮齿动物等，尤其是输入性鼠类进行汉坦病毒检测是对汉坦病毒进行预 防、控制的基础和前提，汉坦病毒检测方法主要有血清学检测和核酸检测，血清学检测主要 有免疫荧光测定（IFA)、酶联免疫吸附试验（ELISA)、免疫层析试纸条等。随着分子生物学 技术的不断发展，核酸检测技术被越来越多的应用到病原检测中来，该技术具有较高的敏 感性，尤其适合于病毒载量低的样品。
[0009] 核酸检测主要包括引物设计、反应体系和反应条件优化、核酸扩增、电泳凝胶检测 和结果分析等。如果没有预先的储备，一名熟练的实验室工作人员从接收样品到准备、检测 和分析，需一周左右的时间。如果无法及时获取阳性样品对反应组成、反应条件进行探索， 上述时间将明显延迟或根本进行检测。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是解决汉坦病毒检验检疫问题，提供一种汉坦病毒集成式核酸检测 试剂盒，试剂盒简单实用，特异性强，敏高性高，使用者只需将处理后的样品加入反应管中， 即可进行扩增反应。
[0011] 本发明汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒，包括汉坦病毒巢式PCR第一轮及巢式 PCR第二轮反应体系，其中PCR第一轮反应体系包括一对通用引物HTV - MFO、HTV - MRO ; PCR第二轮反应体系包括汉城型引物SEO-MF、SEO-MR和汉滩型PCR引物HMF、HMR，引物序列 如下：
所述PCT第一轮为RT-PCR反应体系，总体积为50 μL，包括Enzyme Mix 2.0 μL， 2XBuffer 25.0 μL，模板 RNA 2-14 μL，引物 HTV -MFO (20 μΜ) 2.0 μL，引物 HTV -MRO (20 μΜ) 2.0 μL，补充 RNase Free H2O 使总体积达到 50 μι; 所述PCR第二轮汉城型反应体系总体积为50 μL，包括DNA Polymerase (IU/ μ 1) 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 PL，4XdNTP 5.0 μL，模板 4.0 μL (RT-PCR)，引物 SEO-MF (2〇μΜ) 2· 0 μL，引物 SEO-MR (20 μΜ) 2.0 μL，补充 ddH20 30.0 μL，使总体积达到 50 ? ； 所述PCR第二轮汉滩型反应体系总体积为50 μL，包括DNA Polymerase (lU/μυ 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 μL，4XdNTP 5.0 μL，模板4.0 μL，引物HMF (2〇μΜ) 2.0 μL，弓丨 物 HMR (2〇μΜ)2·0 μL，补充 ddH20 30.0 μL，使总体积达到 50 μL。
[0012] 本发明汉坦病毒集成式核酸检测方法， (1)汉坦病毒核酸检测引物的设计与合成：以汉坦病毒M片段设计并合成RT-PCR通用 外引物HTV - MFO、HTV - MRO，扩增片段大小为445 bp ;汉城型PCR引物SEO-MF、SE〇-MR，扩 增片段大小为417 bp;汉滩型PCR引物HMF、HMR，扩增片段大小为382 bp，引物序列如下：
(2) PCR反应体系的建立： RT-PCR 反应体系为 50 μL，包括 Enzyme Mix 2.0 μL，2XBuffer 25.0 μL，模板 RNA 2-14 μL，引物 HTV -MFO (20 μΜ) 2.0 μL，引物 HTV -MRO (20 μΜ)2·0 μL，补充 RNase Free H2O使总体积达到50 μL ;将RT-PCR反应体系的混合液，模板RNA除外，分装至200 μL PCR管中并置于冰箱中，-20 °C及以下冷冻3 h以上，将PCR管置于冻干机内进行真空干燥 处理3h，保存于-20°C冰箱中待用； PCR第二轮汉城型反应体系为50 μL，包括DNA Polymerase (1U/μ 1) 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 PL，4XdNTP 5.0 μL，模板 4.0 μL (RT-PCR)，引物 SE0-MF(2(^M)2.0 μL，引物 SEO-MR (20 μΜ) 2.0 μL，补充ddH20 30. 0 μL，使总体积达到50 μι;将PCR第二轮汉城型反 应体系的混合液，模板除外，分装至200 PL PCR管中并置于冰箱中，-20 °C及以下冷冻3 h 以上，将PCR管置于冻干机内进行真空干燥处理3h，保存于-20°C冰箱中待用； PCR第二轮(汉滩型）反应体系为50 μL，包括DNA Polymerase (lU/μυ 2.0 μL， 10XPCR Buffer 5.0 μL，4 XdNTP 5.0 μL，模板 4.0 μL，引物 HMF (20ΜΜ) 2.0 μL，引物 HMR (2〇μΜ)2. 0 μL，补充CldH2O 30. 0 μL，使总体积达到50 μι;将PCR第二轮汉滩型反应体系的 混合液，模板除外，分装至200 PL PCR管中并置于冰箱中，-20 °C及以下冷冻3 h以上，将 PCR管置于冻干机内进行真空干燥处理3h，保存于-20°C冰箱中待用； (3) 实时荧光定量PCR反应：RT-PCR反应条件包括50°C 30min;94°C 3min，94°C 20 s，54°C 30s，72°C 30s，40 cycles ;72°C 5min; PCR 第二轮汉城型反应条件包括 94°C 3min ;94°C 15 s，53°C 25s，70°C 25s，38 cycles ；70°C 5min ； PCR 第二轮汉滩型反应条件包括 94°C 3min;94°C 15 s，56°C 25s，72°C 25s，35 cycles ；72 °C 5 min〇
[0013] 本发明对汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒进行评价，包括敏感性、特异性、重复性 及稳定性评价： 所述敏感性评价采用的方法及结果是：将RT-PCR反应体系用RNase Free H2O复溶，或 根据加入模板RNA的情况减少RNase Free H2O加入量，使反应总体系为50 μΜ将待检模板 用RNase Free H2O作10倍系列稀释，按原反应组成、反应条件进行检测试验；以能够检出 阳性样品的最低浓度为该试剂盒的检测下限，即敏感度； 所述特异性评价采用的方法及结果：用本发明的汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒检测 登革病毒（I型)、登革病毒（II型)、登革病毒(III型)、登革病毒(IV型)、西尼罗病毒、流行性 乙型脑炎病毒； 所述重复性评价采用的方法及结果：从同批次制备的试剂盒中，分别随机抽取20套装 有混合试剂的PCR管，各平分为两组，分别检测阳性样品和阴性样品，进行3批次试验； 所述稳定性评价采用的方法及结果：在不同的温度条件下(常温、4°C和-20°C)保存试 剂盒，一定时间后检测同一浓度的阳性和阴性样品并与原检测结果比对，观察试剂盒的稳 定性；将检测试剂盒在常温、4°C和-20°C条件下分别保存7天、30天和1年，试剂盒对相应 样品的检测结果没有明显的变化。
[0014] 本发明汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒，充分考虑国境口岸卫生检疫工作的实际 需要，在试剂盒中按比例优化整合了核酸扩增所需要的引物、酶、dNTPs、缓冲液等多种试 剂，并进行真空干燥处理，便于长期保存和运输。使用者只需将处理后的媒介样品加入反应 管中，即可进行扩增反应，简便实用。
【附图说明】
[0015] 图1为汉城型汉坦病毒扩增电泳图。
[0016] 图2为汉滩型汉坦病毒扩增电泳图。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本发明更容易被理解而不是限制本发明，下面具体结合实施例阐述本发 明。
[0018] 实施例1 汉坦病毒集成式核酸检测试剂盒，包括汉坦病毒巢式PCR第一轮及巢式PCR第二轮反 应体系，其中PCR第一轮反应体系包括一对通用引物HTV - MFO、HTV - MRO ;PCR第二轮反 应体系包括汉城型引物SEO-MF、SEO-MR和汉滩型PCR引物HMF、HMR，引物序列如下：
所述PCT第一轮为RT-PCR反应体系，总体积为50 μL，包括Enzyme Mix 2.0 μL， 2XBuffer 25.0 μL，模板 RNA 2-14 μL，引物 HTV -MFO (20 μΜ) 2.0 μL，引物 HTV -MRO (20 μΜ) 2.0 μL，补充 RNase Free H2O 使总体积达到 50 μι; 所述PCR第二轮汉城型反应体系总体积为50 μL，包括DNA Polymerase (IU/ μ 1) 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 PL，4XdNTP 5.0 μL，模板 4.0 μL (RT-PCR)，引物 SEO-MF (2〇μΜ) 2· 0 μL，引物 SEO-MR (20 μΜ) 2.0 μL，补充 ddH20 30.0 μL，使总体积达到 50 ? ； 所述PCR第二轮汉滩型反应体系总体积为50 μL，包括DNA Polymerase (lU/μυ 2.0 μL，10XPCR Buffer 5.0 μL，4XdNTP 5.0 μL，模板4.0 μL，引物HMF (2〇μΜ) 2.0 μL，弓丨 物 HMR (2〇μΜ)2