一步法荧光定量rt-pcr检测罗氏沼虾野田村病毒的引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学检测病毒领域，尤其涉及一种一步法荧光定量RT-PCR检 测罗氏沼虾野田村病毒的引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 罗氏沼虫下野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus，MrNV)是罗氏沼 虫下白尾病（white tail disease，WTD)的重要病原，主要危害罗氏沼奸淡化苗，可导致病虫下 出现肌肉白浊、白斑或白尾症状，在短时间内大量死亡，虾池中累积死亡率一般为30 %~ 70%，严重时达90%以上。WTD最早于1987年由Nash等在泰国率先报道，随后逐渐波及到 中国台湾、法属瓜特罗普岛和安替列群岛以及中国大陆地区。在我国，WTD最早于1996年 前后出现在广东、广西一带，以后迅速传播到浙江、江苏、上海等地，2000年起在全国范围内 广泛流行，给罗氏沼虾养殖业的发展造成了极大的危害。目前，该病已被列为世界动物卫生 组织（OIE)必须申报的疫病和我国水生动物二类疫病。因此，开发MrNV检测技术对有效控 制WTD的发生与流行、保障罗氏沼虾养殖业的健康发展具有重要意义。
[0003] 针对MrNV的检测方法主要有原位杂交、ELISA、胶体金试纸条、RT-PCR及RT-LAMP 检测法等。但是，在实际检测工作中，原位杂交和ELISA检测所需时间长；胶体金试纸条 虽速度快捷、操作方便，但灵敏度较低；RT-PCR对潜伏感染样品难以检出；套式RT-PCR和 RT-LAMP虽灵敏、快速，但容易交叉污染，且不能定量。
[0004] 荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，把核酸扩增、杂交、光谱分析和 实时检测技术结合在一起，对整个PCR反应扩增过程进行了实时监测和连续分析扩增相关 荧光信号，监测到的荧光信号随反应变化可以绘制成一条曲线，最后通过标准曲线对未知 核酸模板进行定量分析。该法具有操作简单、灵敏高等优点。SYBR Green I荧光定量PCR 是在反应中加入能结合于双链DNA螺旋小沟的SYBR Green I，在激发光照射下产生荧光，通 过监测荧光强度而监测PCR物量，在病原体检测中广泛应用。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏快速、操作便捷的一步法荧光定量 RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物及试剂盒。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一步法荧光定量RT-PCR检测罗 氏沼虾野田村病毒的引物，包括上游引物MrNV-QFl和下游引物MrNV-QRl，它们分别具有以 下的碱基序列：
[0007] 上游引物 MrNV-QFl :5' -ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3'（序列表 SEQ. ID. No. 1)，
[0008] 下游引物 MrNV-QRl :5' -GTTGAGTTCTGTTGGTGGA-3'（序列表 SEQ. ID. No. 2)。
[0009] 一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒，包括含有上游引物 MrNV-QFl和下游引物MrNV-QRl的一步法荧光定量RT-PCR反应液，它们分别具有以下的碱 基序列：
[0010] 上游引物 MrNV-QFl :5' -ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3'，
[0011] 下游引物 MrNV-QRl : 5' -GTTGAGTTCTGTTGGTGGA-3'。
[0012] 该试剂盒含有以下试剂：
[0013] (1) 一步法荧光定量RT-PCR反应液（A液）；
[0014] (2)阳性对照（P液），含MrNV基因的RNA片段；
[0015] ⑶阴性对照（N液），不含MrNV基因的RNA片段；
[0016] (4)工作标准品；
[0017] 一 步法荧光定量 RT-PCR 反应液由 2XOne St印 SYBR? RT-PCR Buffer， PrimeScript I step Enzyme Mix，上、下游引物，ROX Reference Dye II(50X)，H2O 组成。
[0018] 一步法荧光定量RT-PCR反应液共2. 3mL，每剂反应液为23 μ L，由2X0ne Step SYBR? RT-PCR Buffer 12.5 μ L，PrimeScript I step Enzyme Mix 1.0 μ L，浓度为 10以111〇1/1的上、下游引物各1.(^1^1?(?1^作代1?^〇76 11(50父)0.5 41^!120 7.(^1^组 成。
[0019] 阳性对照和阴性对照各200 μ L。
[0020] 工作标准品包括含有 I X IO8 (BI 液）、I X IO7 (Β2 液）、I X IO6 (Β3 液）、I X IO5 (Β4 液）、I X IO4 (B5 液）、I X IO3 (B6 液）、I X IO2 (B7 液）、I X IO1 (B8 液）拷贝 / μ L 的标准品 RNA 各 200 μ L。
[0021] 针对目前缺乏对罗氏沼虾野田村病毒（MrNV)及其所致罗氏沼虾白尾病（WTD)进 行检测和诊断的有效可靠的技术，发明人研宄筛选了特异性的引物（上游引物MrNV-QFl和 下游引物MrNV-QRl)，据此建立了一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的检测 方法，并制备了相应的检测试剂盒。本发明检测方法及其试剂盒应用于MrNV的检测，无需 将反转录和PCR反应分开，操作便捷且灵敏快速，有利于快速检测MrNV及防控WTD。
【附图说明】
[0022] 图1是标准品RNA -步法荧光定量RT-PCR曲线，图中1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、 16-18、19-2U22-24 分别表示标准品 RNA 为 I X 108、I X 107、I X 106、I X 105、I X 104、I X 103、 IX IO2UX IO1Copies/μ L的扩增曲线；25:阴性对照；26:空白对照。
[0023] 图2是标准品RNA -步法荧光定量RT-PCR的标准曲线。
[0024] 图3是标准品RNA -步法荧光定量RT-PCR的融解曲线，图中1-24表示标准品 RNA(IXK)8~IXlO1拷贝/yL，每个浓度做3个平行）的溶解曲线；25:阴性对照；26:空 白对照
[0025] 图4是一步法荧光定量RT-PCR特异性试验结果图，图中扩增曲线分别为：l:MrNV ; 2: TSV ;3: WSSV ;4: IHHNV ;5:阴性对照；6:空白对照
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂 等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：
[0027] QIAamp Viral RNA Mini Kit 购自 QIAGEN 公司；One Step SYBR? PrimeSCriptTMRT-PCR Kit II购自宝生物工程（大连）有限公司；荧光定量PCR仪为安捷 伦公司的Mx3005P ;pGM-T载体购自北京天根生化科技有限公司；DNase I、T7体外转录试 剂盒购自Fermentas ;2XTaq PCR Master Mix、质粒小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶快速回收 DNA试剂盒购自北京艾德莱生物技术有限公司。
[0028] 罗氏沼虾野田村病毒（MrNV)记载在《罗氏沼虾诺达病毒套式RT-PCR检测方法的 建立及初步应用》，上海海洋大学学报，2012, 21 (1) :54-59,公众可从广西水产科学研宄院 获得。
[0029] 桃拉综合征病毒（TSV)记载在《对虾Taura综合征病毒RT-PCT检测方法的改进及 应用》，上海水产大学学报，2008,17 (5) :525-529，公众可从广西水产科学研宄院获得。
[0030] 白斑综合征病毒（WSSV)记载在《凡纳滨对虾白斑综合征病毒广西株变异区基因 的比较分析》，病毒学报，2014, 30 (I) :51-56，公众可从广西水产科学研宄院获得。
[0031] 传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV)记载在《广西凡纳滨对虾IHHNV感染情 况的调查与分析》，南方农业学报，2013,44 (12) :2089-2093,公众可从广西水产科学研宄院 获得。
[0032] 实施例1、引物设计与合成
[0033] 根据MrNV基因序列（GenBank No. HQ287005)的保守区域设计一对特异 性引物，上游引物 MrNV-QFl :5'-ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3'，下游引物 MrNV-QRl : 5' -GTTGAGTTCTGTTGGTGGA-3'，预期扩增片段大小为119bp，由宝生物工程（大连）有限公司 合成，用DEPC处理水稀释至20pmol/ μ 1，-20°C保存备用。
[0034] 实施例2、一步法荧光定量RT-PCR检测方法的建立
[0035] (1)样品的制备
[0036] 取50~IOOmg待检虾苗或成虾的鳃丝、肌肉组织，加500 μ I TN缓冲液（20mM 1'1^/!1(：1，0.4]\1恥(：1，？!17.4)匀浆，离心取上清。采用1?隱提取试剂盒（0^^111?￥1四11?隱 Mini Kit)按其说明书提取罗氏沼虾野田村病毒总R