NA，用核酸蛋白测定仪测定病毒RNA纯 度及浓度，保存于-80 °C备用。
[0037] (2)标准品的制备
[0038] 以事先构建保存的质粒为模板扩增出MrNV衣壳蛋白基因片段，克隆入pGM-T载 体，经鉴定阳性后提取质粒DNA单酶切线性化，纯化回收产物按T7体外转录试剂盒说明进 行体外转录获得阳性模板RNA。测定RNA浓度和纯度，换算成拷贝数是3. 2 X IOltl拷贝/ μ L， 并稀释成IX IO8~IX 10 1拷贝/ μ L 8个梯度作为标准品。
[0039] (3)引物浓度确定
[0040] 以相同浓度的标准品RNA为模板，将引物终浓度在0. 1~0. 8 μmol/L之间进行 一步法荧光定量RT-PCR，当引物终浓度为0· 4 ymol/L时，一步法SYBR Green I荧光定量 RT-PCR对标准品RNA的检测可获得较小的Ct值且无非特异性扩增，确定反应体系中引物终 浓度为 〇· 4 μ mol/L。
[0041] (4)标准曲线建立（图1-3)
[0042] 以已知拷贝数的标准品RNA (I X IO8~I X 10 1拷贝/ μ L)为模板进行一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR，每个梯度做三个平行，25yL体系中加入：2X0ne St印SYBR? RT-PCR Buffer 12.5 μ L，PrimeScript I step Enzyme Mix 1.0 μ L，上下游引物（10 μ mol/ L)各 1.0 μ L，ROX Reference Dye II (50Χ) 0.5 μ L，RNA 2.0 μ L，H2O 7.0 μ L，同时设以健康 无 MrNV罗氏沼虾肌肉组织RNA和灭菌DEPC水为模板的阴性对照和空白对照。反应条件参 照试剂说明进行一步法，反转录反应：42°C 15min，95°C IOs ;PCR反应：40个循环，95°C 5s， 60°C 45s ;融解曲线分析：95°C lmin，55°C 30s，然后以0. 〇rC /秒逐渐升温到95°C并全程 采集荧光信号，最后95°C 30s结束，根据融解曲线判断反应的特异性。
[0043] 结果，一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR对标准品RNA (I X IO8~I X 10 1拷贝 / μ L)的扩增曲线呈现明显的s型，而阴性对照和空白对照均没有出现扩增，反应动力学范 围达8个数量级，标准品RNA为IX IO8拷贝时，Ct值最小，为10. 5 ;标准品RNA为10拷贝 时，Ct值约为34. 5,灵敏度较高，可检测到相当于10个拷贝数的病毒粒子。利用仪器数据 分析软件进行分析可得标准曲线：Y = -3. 391XL0G(X)+37. 98，Eff.(扩增效率）和RSq(相 关系数方值）分别为97. 2 %和1. 000,起始模板浓度的对数与Ct值之间呈良好的线性关 系。融解曲线只有单一的波峰，产物Tm值均一，在81. 17~81. 25°C之间，未见有引物二聚 体形成及其他非特异扩增，引物具有很好的特异性。可见，建立的标准曲线能够准确地反映 目的产物的扩增。
[0044] 检测中以Ct值34为界限，若检测样品有"S"型扩增曲线，且Ct值< 34,则检测样 品可判断为MrNV阳性，否则样品判断为MrNV阴性。
[0045] (5)特异性试验（图4)
[0046] 以MrNV、TSV、WSSV及IHHNV 4种病毒的核酸为模板，并设以健康无 MrNV罗氏沼虾 肌肉组织RNA和灭菌DEPC处理水为模板的阴性对照和空白对照，相同条件下同时进行一步 法SYBR Green I荧光定量RT-PCR，结果只有MrNV出现阳性扩增曲线，而TSV、WSSV及IHHNV 3种病毒未出现扩增曲线，具有MrNV检测特异性。
[0047] 实施例3、检测试剂盒的组装
[0048] 根据实施例1和2的研宄结果，组装检测试剂盒以方便使用。该试剂盒含有以下 试剂：
[0049] (1) 一步法荧光定量RT-PCR反应液（A液）：共2. 3mL，每剂反应液为23 μ L，由 2 X One Step SYBR? RT-PCR Buffer 12. 5 μ L? PrimeScript I step Enzyme Mix 1.0uL? 浓度为 l〇ymol/L 的上、下游引物各 1.0yL，R0X Reference Dye II(50X)0.5yL，H20 7. OyL组成。
[0050] (2)阳性对照（P液）：含MrNV基因的RNA片段，200 μ L ;
[0051] ⑶阴性对照（Ν液）：不含MrNV基因的RNA片段，200 μ L ;
[0052] (4)工作标准品：包括含有 IX 108(Β1 液）、1Χ 107(Β2 液）、IX 106(Β3 液）、 I X IO5 (Β4 液）、I X IO4 (Β5 液）、I X IO3 (Β6 液）、I X IO2 (Β7 液）、I X IO1 (Β8 液）拷贝 / μ L 的 标准品RNA各200 μ L。
[0053] 按25 yL体系计算，试剂盒含量可用于100份样检测，以单样份计量，25 yL体系中 含有的反应液（A液）23 μ L，使用时25 μ L体系取A液23 μ L加入2 μ L RNA。
[0054] 试剂盒的稳定性
[0055] 将试剂盒保存于_20°C，选取Β3液、Β4液和Β5液三个浓度的标准品RNA分别在间 隔10天和第20天进行一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR试验，每个浓度做3个重复， 计算Ct值的变异系数，验证试剂盒的稳定性和重复性，经过数据分析得到组内及组间的变 异系数，组内试验Ct值变异系数为0. 15 %~0. 83%，组间实验Ct值变异系数为0. 56 %~ 0. 95%，一步法SYBR Green I荧光定量RT-PCR试剂盒具有良好的重复性和稳定性。
[0056] 表1试剂盒的稳定性试验结果
【主权项】
1. 一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物，其特征在于包括上游引 物MrNV-QFl和下游引物MrNV-QRl，它们分别具有以下的碱基序列： 上游引物MrNV-QFl:5' -ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3'， 下游引物MrNV-QRl:5'-GITGAGTTCTGITGGTGGA-3'。2. -步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒，其特征在于包括含有 上游引物MrNV-QFl和下游引物MrNV-QRl的一步法荧光定量RT-PCR反应液，它们分别具有 以下的碱基序列： 上游引物MrNV-QFl:5' -ATTTAGATTGGGTCTGTGGA-3'， 下游引物MrNV-QRl: 5'-GITGAGTTCTGITGGTGGA-3'。3. 根据权利要求1所述的一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒， 其特征在于该试剂盒含有以下试剂： (1) 一步法荧光定量RT-PCR反应液； (2) 阳性对照，含MrNV基因的RNA片段； (3) 阴性对照，不含MrNV基因的RNA片段； (4) 工作标准品。4. 根据权利要求3所述的一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒， 其特征在于：所述一步法荧光定量RT-PCR反应液由2XOneSt印SYBR?RT-PCRBuffer， PrimeScriptlstepEnzymeMix，上、下游引物，ROXReferenceDyeII(50X)，H2C^ii成。5. 根据权利要求4所述的一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒， 其特征在于：所述一步法荧光定量RT-PCR反应液共2. 3mL，每剂反应液为23yL，由2XOne StepSYBR?RT-PCRBuffer12.5tiL，PrimeSc;riptlstepEnzymeMix1.0yL，浓度为 lOymol/L的上、下游引物各 1.0yL，R0XReferenceDyeII(50X)0.5yL，H207.0yL组成。6. 根据权利要求3所述的一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂盒， 其特征在于：所述阳性对照和阴性对照各200yL。7. 根据权利要求3所述的一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的试剂 盒，其特征在于：所述工作标准品包括含有1X108、1X107、1X106、1X105、1X104、1X103、 1X102、1X101 拷贝 /yL的标准品RNA各 200yL。
【专利摘要】本发明公开了一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的引物，包括上游引物MrNV-QF1和下游引物MrNV-QR1，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1和序列表SEQ.ID.No.2的碱基序列。发明人据此建立了一步法荧光定量RT-PCR检测罗氏沼虾野田村病毒的检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。本发明检测方法及其试剂盒应用于MrNV的检测，无需将反转录和PCR反应分开，操作便捷且灵敏快速，有利于快速检测MrNV及防控WTD。
【IPC分类】C12Q1/70, C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/93
【公开号】CN104946797
【申请号】CN201510322871
【发明人】童桂香, 韦信贤, 黎小正, 吴祥庆, 杨琼, 李旻
【申请人】广西壮族自治区水产科学研究院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月12日