用于rt-lamp法检测番茄斑萎病毒的试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病毒检测领域，具体涉及用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试 剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 番前斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV)是布尼亚病毒科 (Bunyaviridae)，番前斑萎病毒属（Tospovirus)代表性成员之一，病毒粒子近似球形，寄 主植物十分广泛，现可侵染84个科，1090多种植物，主要包括番茄、烟草、花生、辣椒、莴苣、 大豆等蔬菜作物和数以千计的观赏植物。番茄斑萎病毒感染的寄主植物在早期会出现严重 矮化、叶脉坏死、叶面皱缩、整株变黄或产生褪绿斑点等典型症状，从而导致产量下降，除叶 片上出现同心环纹斑或镶嵌的坏死斑点外，坏死条纹延伸到芽茎末端，花器上也会出现死 斑，产生畸形花，受感染的果实出现坏死斑点和轮纹，成熟的果实出现黄色斑点同心环或坏 死条纹同时存在。不仅叶片上症状明显，茎杆和根部也会出现坏死现象。严重时会导致整 株死亡，造成严重的经济损失。
[0003] 番前斑萎病毒是一种RNA病毒，直径约为80-110nm，其中外膜为20~25nm，核壳 体为60nm，具有膜包被的三分体单链RNA(L RNA，M RNA，S RNA)基因组，包含4种结构蛋白。 其中，L RNA(~8. 9kb)为负义RNA，包含一个开放阅读框（open reading frame，0RF)，编 码病毒RNA的依赖性聚合酶蛋白（RdRp);而M RNA (~4. 8kb)和S RNA (~2. 9kb)为双义 RNA，其中M RNA包含有2个开放阅读框，互补编码非结构蛋白NSm(病毒的运输蛋白：MP)， 病毒链编码Gl，G2两个前体糖蛋白；S RNA病毒包含有2个开放式阅读框，病毒链编码结 构蛋白NSs，互补链编码外壳蛋白，又称核壳体蛋白（Nucleocapsid protein, N)。TSWV三 个RNA片段末端8个核苷酸（3'序列为UCUCGUUA-，5'端为AGAGCAAU…）高度保守，每个 RNA片段末端约65个核苷酸系列互补，区域互补从而形成假环状结构（Pseudo circular structure)〇
[0004] 1906年番茄斑萎病毒引起的病症第一次被观察到，Brittlebank等人（1915年） 在澳大利亚首次描述该病症，从发现到现在已有近百年的历史，目前在世界多个国家和地 区广泛分布，在夏威夷的生菜、番前和胡椒上损失达60 %~70 %;在法国和西班牙等欧洲国 家和地区，曾因该病毒大量扩散而引起番茄、辣椒等作物的严重病害，造成毁灭性损失，重 病地块损失达100 % ;20世纪90年代末期，TSWV在日本的菊花上发生严重。TSWV以其广泛 的寄主范围和造成的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。我国首次 于1984年在广州发现TSWV，并得到其分离物。张仲凯等人2000在云南晒烟区发现番茄斑 萎病毒已广泛分布，局部地区损失已达60%以上。2006年，我国首次将TSWV列为全国农业 植物检疫性有害病毒；2008年，在云南蝴蝶兰上检测到TSWV ;2009-2010年，董家红等在云 南昆明的多个地区检测到TSWV ;2012年广州检验检疫中心首次在美国进境生菜种子中截 获TSWV ;李飞等2012年在北京检测到TSWV。
[0005] 常规的检测技术对仪器、检测环境要求较高，且耗时较长。Notomi等于2000年 开发了一种新型的核酸扩增方法--环介导恒温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，该方法不需要昂贵的仪器设备，在等温条件下即可高效、快速、特 异、灵敏地扩增靶序列，且操作简单、适合多种检测环境。因此，自开发以来，该方法已经在 国内外医学病原物检测、食品安全检测及基因芯片等方面有广泛的应用且效果良好，近些 年也逐渐渗透到植物病原检测领域。该方法针对靶基因6个特异区域（3'端的F3c，F2c， Flc区以及5'端的Bl，B2, B3区）设计4条特异引物，即上游内部引物（FIP)、上游外部引 物（F3)、下游内部引物（BIP)、下游外部引物（B3)。为提高引物的特异性，可以再在引物组 合内添加2条环状引物，上游环状引物（LF)和下游环状引物（LB)，引物的位置均有一定的 顺序性。该技术是利用Bst DNA聚合酶的链置换活性提供反应的动力，在恒温条件下短时 间（30~60min)内完成靶DNA的高效扩增，整个反应分为两大阶段，即初反应物哑铃状模 板的合成，基因循环扩增、延伸和再循环阶段。反应第一阶段：在具有链置换活性DNA聚合 酶的作用下，内引物FIP与模板DNA结合形成互补链；随后，新合成链在外引物F3的作用下 被置换，而被置换的单链在5'末端形成环状结构。然后，内引物BIP与该单链结合，在延伸 过程中同时打开环状结构，形成双链DNA。最后，外引物B3与该双链DNA的B3c结合，随着 引物B3的不断延伸，两侧分别为FIB和BIP的完整单链被置换。由于该单链两端存在互补 序列，于是形成"哑铃状"循环扩增的起始结构。在第二阶段，在哑铃状结构中，以3'端Fl 区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，F2与F2c结合，启动新一轮链 置换反应，使Fl区段新合成的链解离，解离出的单链再形成环状结构。该环状结构一方面 以Bl为引物进行延伸，使F2合成链解离，解离链进而形成哑铃状结构，重复上述过程；另一 方面，BIP引物上的B2与环上的B2c结合，启动新一轮扩增，再经过链解离、环状结构形成、 环状结构自身扩增、单链置换等过程，最后形成大小不一的茎环结构、多环花椰菜样结构的 DNA片段混合物，使得琼脂糖凝胶电泳条带呈现梯形。
[0006] 在检测番茄斑萎病毒方面，方法主要包括生物学检测、电子显微镜检测、血清学检 测以及分子生物学检测。生物学检测依靠寄主植物上的典型症状来判断，该方法直观便 捷，但对其他具有类似症状的病毒较难分辨。电镜检测可以直接观察病毒的形态结构变 化，但该方法对于病毒分分类和归属较难判定。血清学检测是将免疫反应和酶的高效催化 反应有机结合的方法，目前该方法广泛被用于植物病毒检测，1977年，Clark和Adams采用 TAS-ELISA的方法检测出TSWV，INSV和WSM0V。分子生物学检测主要包括常规PCR、免疫捕 捉RT-PCR和qRT-PCR。分子生物学检测灵敏度较高。Roberts等应用qRT-PCR技术从植物 叶片总RNA中检测到TSWV，灵敏度可达500fg，不同方法在使用成本、操作难易和灵敏度方 面均存在差异。赵巍巍等比较了番茄斑萎病毒qRT-PCR、常规PCR、DAS-ELISA、快速检测试 纸条等检测方法，快速检测试纸条是一种简便快捷的胶体金免疫层析技术，适合基层推广 使用，该方法由于检测灵敏度和定量水平低的缺点，只适合在病毒浓度较高的情况下才能 检测出来；DAS-ELISA技术目前是我国进出口检验检疫检测病毒的主要方法，也是病毒诊 断与检测的一种常规手段，该方法具有方法简便，成本低，能批量检测等优点，但是检测时 间较长且存在非特异性颜色反应干扰，容易出现假阳性高特异性和高灵敏度等需要；常规 PCR和qRT-PCR比快速检测试纸条和DAS-ELISA特异性和灵敏度更高，但常规PCR不能准确 定量，也易出现交叉污染，产生假阳性；qRT-PCR检测灵敏度远高于常规PCR，为常规PCR的 近125倍，qRT-PCR灵敏度和准确度高，但是由于该技术对核酸要求高，仪器设备昂贵等影 响其广泛应用。
[0007] 发明人设想采用RT-LAMP方法检测番茄斑萎病毒，其灵敏度应该会远远高于常规 PCR、DAS-ELISA、快速检测试纸条等检测方法，而且与qRT-PCR相比不需要特殊仪器且检测 时间短。Aichi Prefecture等根据日本TSWV核酸序列（GenBank:AB010996)设计了一组 LAMP引物用于菊科植物TSWV病毒的检测。但是，发明人验证了目前已知的检测TSWV的 LAMP引物和方法，发现无法与国内毒源获得特异性检测结果。采用RT-LAMP方法检测番茄 斑萎病毒，需要开发出特异引物和方法。
【发明内容】
[0008] 根据上述领域的需求和空白，本发明提供用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试 剂盒及检测方法，能够高效、快速、特异、灵敏地检测待测样品中是否存在番茄斑萎病毒，操 作简单，适用于多种检测环境。本发明请求保护的技术方案如下：
[0009] 用于RT-LAMP法检测番茄斑萎病毒的试剂盒，其特征在于：包括独立包装或混装 在一起的特异引物，所述特异引物的核苷酸序列如下：
[0010] F3 :5' -TCTGTTTTTTAACCCCGAAC-3' ；
[0011] B3 :5 ' -CAAAGAAGTATGACACCAGG-3 ' ；
[0012] FIP :5' -AGCTCCAGCAATCCTAATGCTAAGTTAAGAGTTTCACTGTAATGTTCC-3' ；
[0013] BIP :5' -GCATACTCTTTCCCTTTCTTCACCCCTTAGGAAAAGTTTGCACTG-3' ；
[0014] LOOP-F :5' -CTTCATTCATTTCAATGC-3' ；
[0015] LOOP-R : 5，-AGTTCTATGAA-3，。
[0016] 番茄斑萎病毒的RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：
[0017] (1)提取待测样品的总RNA ;
[0018] (2)采用权利要求1所述的试剂盒中的特异引物，以步骤⑴获得的样品RNA为模 板进行RT-LAMP反应，得到扩增产物；
[0019] (3)采用以下至少一种方法检测步骤⑵得到的扩增产物：
[0020] 琼脂糖凝胶电泳检测：出现预期带型的样品的为阳性，即待测样品中含有番茄斑 萎病毒；所述预期带型指梯状条带，主条带大小为213bp ;
[0021] 目测浑浊度：出现浑浊的反应管为阳性，即待测样品中含有番茄斑萎病毒；
[0022] 在反应管中添加染料：目测出现染色信号的样品为阳性，即待测样品中含有番茄 斑萎病毒。
[0023] 所述 RT-LAMP 反应的体系为：IOmM dNTP Mix 3. 5 μ I，IOOmM MgS04 L 5 μ 1， 10XThermoPolBuf?er2·5μl，8000U/mlBst