一种番茄黄曲叶病毒lamp检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检测领域，具体地说，本发明涉及一种番茄黄曲叶病毒LAMP检 测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 番茄是常见的可食用植物，其营养丰富、风味特别，具有减肥瘦身、消除疲劳、增进 食欲、促进蛋白质消化等功效，原产南美洲，在我国广泛栽培。然而，1964年Cohen等首次报 道了在以色列发生的番茄黄曲叶病毒病。在之后的几十年间，该病迅速地扩散到中东、地中 海沿岸、东亚、南亚、非洲、欧洲、美国、中美洲、澳大利亚等众多国家和地区。2002年传入我 国南部省份，首先在广西大面积暴发，同年传入江浙一带，随后在各个省份相继发现、连续 暴发，给我国的番茄生产造成重大损失。
[0003] 番前黄曲叶病毒病的病原体是番前黄曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)，是对番茄产量影响最严重的病害之一，主要由烟粉虱传播。番茄植株感染该 病毒后，最典型的症状是病株生长迟缓或停滞，节间变短，严重矮化，枝条直立丛簇，叶片明 显变小、增厚、皱缩，叶质脆硬，向上卷曲呈杯、盘状，植株顶部形似菜花;病叶边缘至叶脉区 域黄化，植株上部叶片症状尤其明显;大部分花穗凋萎，结果稀少，果实变小，膨大速度慢， 成熟期的果实不能正常转色。番茄在开花以前遭受TYLCV侵染，危害极其严重，果实产量和 商品价值均大幅度下降，严重时造成的损失可达100%。
[0004] 番前黄曲叶病毒病的症状并不是一成不变的，而是随着病毒株系、番前品种、植株 年龄以及侵染时间的不同而改变，难以鉴别。此外，番茄病毒病的种类很多，经常是多种病 毒同时发生，如黄瓜花叶病毒(CMV)、番茄花叶病毒(ToMV)等，构成混合侵染，因此田间症状 往往十分复杂，不易辨认。目前检测番茄黄曲叶病毒多使用血清学测定或PCR法，然而这两 种方法均存在不足:前者须制作抗血清，非特异反应多，易产生假阳性或假阴性结果，而PCR 灵敏度和特异性不高，导致检测结果的准确性较低。因此，有必要开发一种快速、准确的 TYLCV检测方法，以满足产业需求。
[0005] 环介导恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法（见文献Notomi T，0kayama H，Masubuchi Η, Yonekawa T,ffatanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000Jun 15;28(12):E63)。该技术不仅能够在恒温条件下对 目的序列进行快速扩增，且与常规PCR相比，无需高端的仪器设备，可以通过在扩增产物中 加入荧光染料进行直接判断或者通过观察扩增曲线变化判断扩增结果，因此具有特异性 强、灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。目前LAMP技术已经应用于多种动植物病毒的 快速检测，并随着该技术的成熟，使用范围也越来越广。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒及检测方法。
[0007] 为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种番前黄曲叶病毒LAMP检 测试剂盒，其包括特异性引物、反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述引物的核 苷酸序列如下所示：
[0008] 外引物F3:TGAAGAATGAITTGCGGGATA(SEQ ID N0:1)
[0009] 外引物B3:GCATGCGTACATGCCATA(SEQ ID NO:2)
[0010] 内引物FIP: CCTGTTCCTTCATTCCAGAGGG-TTCAAGTGA
[0011] TGAGGAAATTTCATG(SEQ ID NO:3)
[0012] 内引物BIP: ACGTAACTTATAATCATCAGGAGGC-CAATAA
[0013] CAAGGCGTTTTCAGT(SEQ ID N0:4)〇
[0014] 优选地，所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为5pmolAU，所述内引物FIP和所 述内引物BIP的浓度均为40pmolAU。
[0015] 优选地，所述反应缓冲液由l〇mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和 50mM MgS〇4组成。
[0016] 优选地，所述核酸染料为SYBR Green I。
[0017]优选地，所述番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒进一步包括DNA提取试剂以及阳性 对照和阴性对照。
[0018]在另一个方面中，本发明还提供一种番茄黄曲叶病毒LAMP检测方法，其包括以下 步骤：
[0019] (1)提取待测样品DNA:向待测样品中加入CTAB抽提缓冲液，按照常规CTAB法提取 DNA；
[0020] (2)设计并合成引物，其中所述引物的核苷酸序列如下所示：
[0021] 外引物F3:TGAAGAATGATTTGCGGGATA(SEQ ID N0:1)
[0022] 外引物B3:GCATGCGTACATGCCATA(SEQ ID NO:2)
[0023] 内引物FIP: CCTGTTCCTTCATTCCAGAGGG-TTCAAGTGA
[0024] TGAGGAAATTTCATG(SEQ ID NO:3)
[0025] 内引物BIP: ACGTAACTTATAATCATCAGGAGGC-CAATAA
[0026] CAAGGCGTTTTCAGT(SEQ ID NO:4)；
[0027] (3)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μ1的LAMP反应体系，其包括5pmolAU的 外引物 F3 1μ1、5ρηιο1/μ1 的外引物 Β3 1μ1、40ρηιο1/μ1 的内引物 FIP 1μ1、40ρηιο1/μ1 的内引 物BIP ΙμL、反应缓冲液2.5yl、8U Bst DNA聚合酶ΙμL、模板DNA 2μ1，加水补充至25μ1，并以 番茄黄曲叶病毒基因组DNA作为阳性对照，以lOOmM Tris-HCl ρΗ8.0和50mM EDTA作为阴性 对照；
[0028] (4)LAMP反应:将步骤(3)中PCR管于63°C恒温反应60min;
[0029] (5)结果判读:在反应产物中加入核酸染料，如反应液为橙色，表示结果为阴性，绿 色表示结果为阳性。
[0030] 优选地，所述反应缓冲液由10mM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和 50mM MgS〇4组成。
[0031] 优选地，所述核酸染料为SYBR Green I。
[0032] 本发明的番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒及检测方法针对病毒保守区域设计，获 得特异性和灵敏度高的四条引物，假阳性率低;扩增在30-60min内即可完成，快速、高效且 产率高;通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需高端的仪器设备以及繁锁的电泳和紫 外观察等步骤，鉴定简便，较传统的PCR检测方法优势显著。
【具体实施方式】
[0033]以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。
[0034]实施例1本发明的番茄黄曲叶病毒LAMP检测试剂盒的制备
[0035] 1.1试剂
[0036]引物由天根生化科技(北京)有限公司合成;Bst DNA聚合酶和lOXThermoPol