一种郁金香碎色病毒rt-lamp检测试剂盒及检测方法
【专利说明】-种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法
[0001 ] 本发明是申请号为201510435866.X、申请日为2015年7月22日、发明名称为"一种 郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法"的专利的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及微生物检测领域，具体地说，本发明设及一种郁金香碎色病毒RT-LAMP 检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0003] 郁金香是国际名花之一，W高贵、典雅为世界人民所宠爱，是欧亚等地区近20个国 家的国花。近年来，我国各地相继举办了郁金香花展，获得了较好的效益。虽然郁金香在我 国很早就有少量栽培，但大部分仍从荷兰等国家进口。20世纪80年代中后期W来，我国从国 外引进郁金香商品种球数量逐年成倍增长，其携带的一些有害生物也随之传入，包括真菌、 细菌、线虫和病毒等，潜在危害性很大。郁金香碎色病是种球常见感染之一，其造成种球退 化，严重影响了郁金香的生产。
[0004] 引起郁金香碎色病的病原体是郁金香碎色病毒(Tulipa breaking virus,TuBV)， 病毒粒子大小为700nmX(12-13)nm。感染化BV的主要症状是叶片出现浅绿色或灰白色条 斑，有时形成花叶，在红花和紫花品种上产生碎色花，花瓣上形成大小不等浅色斑点或条 斑，严重时植株生长不良，还可危害百合类花弁。
[0005] 目前检测郁金香病毒多使用抗血清的化ISA法或RT-PCR法，然而运两种方法均存 在不足:ELISA法须制作抗血清，非特异反应多，易产生假阳性或假阴性结果，而RT-PCR灵敏 度和特异性不高。因此，有必要开发一种快速、准确的化BV检测方法，W满足产业需求。
[0006] 环介导恒溫核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 近些年发展起来的一种新型的核酸扩增方法（见文献Notomi T，0kayama H，MasubucM Η, Yonekawa T,Watanabe Κ,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res.2000 Jun 15;28(12):E63)。与常规PCR相比，LAMP无需模板的 热变性、溫度循环、电泳及紫外观察等过程，短时间内即可实现大量拷贝数的核酸扩增，且 无需高端的仪器设备，具有特异性强、灵敏度高、易于判读、可定性定量等优势。
[0007] 逆转录环介导等溫扩增技术(RT-LAMP)是基于LAMP建立的RNA检测技术，其灵敏度 是普通RT-PCR的100倍。RT-LAMP扩增原理与LAMP相同，但在反应体系中增加了逆转录酶，使 RNA的逆转录和cDNA的LAMP扩增在同一试管中一步完成。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。
[0009] 为了实现本发明的目的，在一个方面中，本发明提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP 检测试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核酸染料，其中所述 引物的核巧酸序列如下所示：
[0010] 外引物F3:TTAGCCATGCACTACTCTT(沈Q ID N0:1)
[0011] 外引物B3:CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQ ID N0:2)
[0012] 内引物FIP: CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT
[0013] GTTAAATCTGGAGTGT(沈Q ID N0:3)
[0014] 内引物BIP:ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCC
[0015] AACTGCTCG(SEQ ID N0:4)〇
[0016]优选地，所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为SpmolAil，所述内引物FIP和所 述内引物BIP的浓度均为40ρπιο1/μ1。
[0017] 优选地，所述反应缓冲液由lOmM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和 50mM MgS〇4组成。
[0018] 优选地，所述Bst DM聚合酶的浓度为8υ/μ1。
[0019] 优选地，所述核酸染料为SYBR Green I。
[0020] 优选地，本发明的试剂盒进一步包括RNA提取试剂W及阳性对照和阴性对照。
[0021] 在另一个方面中，本发明还提供一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测方法，其包括W 下步骤：
[0022] (1)利用TIANamp病毒RNA提取试剂盒提取待测样品RNA;
[0023] (2)设计并合成引物，其中所述引物的核巧酸序列如下所示：
[0024] 外引物F3:TTAGCCATGCACTACTCTT(沈Q ID N0:1)
[002引 外引物B3:CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQ ID N0:2)
[0026] 内引物FIP: CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT
[0027] GTTAAATCTGGAGTGT(沈Q ID NO:3)
[0028] 内引物BIP:ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCCAACTGCTCG(SEQ ID N0:4);
[0029] (3)在PCR管中制备25μ1的RT-LAMP反应体系，其包括SpmolAU的外引物F31μ1、 5ρπιο1/μ1的外引物Β3化1、40ρπιο1/μ1的内引物ΡΙΡ1μ1、40ρπιο1/μ1的内引物BIP化1、反应缓 冲液2.化1、211 AMV逆转录酶化1、8U Bst DNA聚合酶化1、模板DNA化1，加水补充至25μ1，并 W郁金香碎色病毒基因组DNA作为阳性对照，WlOOmM化is-HCl pH 8.0和50mM抓ΤΑ作为 阴性对照；
[0030] (4)LAMP反应:将步骤(3)中PCR管于63°C恒溫反应60min;
[0031] (5)分析判断反应产物结果:在(4)中所得反应产物中加入化1核酸染料，如反应液 颜色为澄色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
[0032] 优选地，所述反应缓冲液由lOmM dNTP、10 X化ermo化1反应缓冲液、5mM甜菜碱和 50mM MgS〇4组成。
[0033] 优选地，所述核酸染料为SYBR Green I。
[0034] 本发明的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒和检测方法针对病毒保守区域设计 特异性和灵敏度高的四条引物，且一步完成逆转灵和扩增步骤，假阳性率低、快速、高效，且 通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，无需电泳和紫外观察等步骤，鉴定简便，较传统的检 测方法优势显著。
【具体实施方式】
[0035] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0036] 实施例1本发明的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒的制备
[0037] 1.1 试剂
[0038] 引物由天根生化科技(北京)有限公司合成;Bst DNA聚合酶和lOXThermoPol反应 缓冲液购自肥B;AMV逆转录酶购自Promega公司；SYBR Green I购自Invi化ogen;其余PCR试 剂和配制CTAB抽提缓冲液所需的试剂购自Sigma。
[0039] 1.2试剂盒的制备：
[0040] 反应缓冲液，按照W下配方配制：lOmM dNTP、10 X化ermoPol反应缓冲液、5mM甜菜 碱、50mM MgS〇4;
[0041 ]引物：外引物F3,其核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示；外引物B3,其核巧酸序列如 569 10^:2所示；内引物尸1口，其核巧酸序列如569 10^):3所示，内引物81口，其核巧酸序 列如SEQ ID NO: 4所示。其中外引物F3和外引物B3的浓度为5pmolAU，内引物FIP和内引物 BIP 的浓度为 40ρπιο1/μ1。
[0042] 2U的AMV逆转录酶；
[0043] 8U的Bst DNA聚合酶；
[0044] 核酸染料:1000 XSYBR Green I;
[004引阳性对照:郁金香碎色病毒基因组DNA;
[0046] 阴性对照：100mM Tris-HCl(pH 8.0)和50mM EDTA。
[0047] 实施例2郁金香碎色病毒特异性检测 [004引 2.1 RT-LAMP特异性检测
[0049] 待测样品包括从郁金香栽培基地获得的5株郁金香碎色病毒W及甜菜花叶病毒、 洋葱黄矮病毒和烟草蚀纹病毒各1株。
[0050] 使用实施例1制备的试剂盒按照W下步骤对郁金香碎色病毒进行检测：
[0051 ] (1)利用TIANamp病毒RNA提取试剂盒提取待测样品RNA;
[0052] (2)建立LAMP反应体系：在PCR管中制备25μ1反应体系，其中四种引物各化1、反应 缓冲液2.扣1、2U AMV逆转录酶化1、8U Bst DNA聚合酶化1、步骤（1)所得模板DNA化1，加水 补充至25μ1，并W郁金香碎色病毒基因组DNA作为阳性对照，WlOOmM Tris-肥1 pH 8.0和 50mM邸ΤΑ作为阴性对照；
[0053] (3)LAMP反应:将步骤(2)中PCR管于63°C恒溫反应60min;
[0054] (4)分析判断反应产物结果:在(3)中所得反应产物中加入化1 1000 XSYBR Green I，如反应液颜色为澄色，表示结果为阴性，如反应液颜色为绿色，表示结果为阳性。
[00巧]2.2检测结果
[0056] 5株郁金香碎色病毒的PCR管中均呈现绿色，而甜菜花叶病毒、洋葱黄矮病毒和烟 草蚀纹病毒的显色结果均为澄色，表明引物具有很强的特异性。
[0057] 实施例3郁金香碎色病毒灵敏度检测 [005引 3.1 RT-LAMP灵敏度检测
[0059] 按照实施例2的步骤（1)提取郁金香碎色病毒RNA，并W10倍浓度系列稀释法稀释 成 lOOng、lOng、Ing、lOOpg、lOpg、Ipg、lOOfg共 7 个梯度。
[0060] RT-LAMP反应体系和反应条件W及结果分析同实施例2的步骤(2)-(4)。
[0061] 3.2检测结果
[0062] 除了DM浓度为lOOfg的PCR管显示澄色之外，其余浓度的PCR管中均呈现绿色，表 明本发明的检测方法的最低检测极限达到Ipg DNA，灵敏度很高。
【主权项】
1. 一种郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst DNA聚合酶和核酸染料。2. 根据权利要求1所述的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒，其中所述引物的核苷酸 序列如下所示： 外引物F3:TTAGCCATGCACTACTCTT(SEQ ID N0:1) 外引物B3:CTTCGTAGTTCGTGAGTCA(SEQ ID NO:2) 内引物FIP: CATCCCCATTGACAAAGTAACGG-TACACAT GTTAAATCTGGAGTGT(SEQ ID NO:3) 内引物BIP: ATTACTGGCTGTGCATCCTGA-TTCAAACCC AACTGCTCG(SEQ ID N0:4)〇3. 根据权利要求1所述的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒，其中所述反应缓冲液由 10mM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液、5mM甜菜碱和50mM MgS〇4组成。4. 根据权利要求1所述的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒，其中所述核酸染料为 SYBR Green 1〇5. 根据权利要求1-3任一项所述的郁金香碎色病毒RT-LAMP检测试剂盒，其进一步包括 RNA提取试剂以及阳性对照和阴性对照。
【专利摘要】本发明涉及一种郁金香碎色病毒(Tulipa？breaking？virus,TuBV)RT-LAMP检测试剂盒，其包括引物、反应缓冲液、AMV逆转录酶、Bst？DNA聚合酶和核酸染料。本发明还涉及郁金香碎色病毒RT-LAMP检测方法。使用本发明的试剂盒能够对郁金香碎色病毒进行快速、高效、简便的分子生物学检测。
【IPC分类】C12Q1/68, C12R1/94, C12Q1/70
【公开号】CN105506178
【申请号】CN201511002790
【发明人】孔涛
【申请人】孔涛
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年7月22日
【公告号】CN104988244A