用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法和检测系统与流程

本发明属于生物技术及诊断研究领域，涉及一种用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法和检测系统。

背景技术：

结直肠癌也被称为大肠癌，发生在结肠(大肠)或直肠中，通常发展缓慢，是中国城镇第二高发癌症，40岁以上无症状人群中6％患有早期肠癌。随着食品结构和生活习惯的改变，以及环境问题的日益突出，导致大肠癌发生率快速增长，据《中国肿瘤登记年报》报道显示，肠癌是目前中国城市发病率仅次于肺癌的第二大癌症，主要包括结肠癌与直肠癌两大类。目前我国每年新增结直肠癌确诊病例44万例，每年死亡患者多达23万人。国家癌症早诊早治项目专家委员会2013年研究报告指出，中国40岁以上高危人群患进展期腺瘤和早期肠癌比率为6％。这些癌变病灶不及时切除，90％的情况下将会转化为恶性肠癌。由于大部分患者在早期并未发现重视并得到及时治疗，肠癌死亡率居高不下。对于在早期阶段被筛查到的患者，超过90％可以被治愈。

结直肠癌有许多共同特点：大多数肠癌形成之前已经以息肉(异常突起)或腺瘤(腺上皮良性肿瘤)的形式在发病部位缓慢发展多年，在此期间患者无任何不适。腺瘤是一种良性，非癌性肿瘤。随着时间的推移，部分腺瘤可转变为癌症。在癌变过程中，肿瘤细胞侵入肠壁，与血管或淋巴管融合，通过吸收患者养分迅速扩增。后期，癌细胞通过淋巴管侵入附近的淋巴结或身体的其它器官，如肝脏等，形成癌扩散。结直肠癌通常发展至晚期才有明显症状显现(如腹痛，便血等)。由于大多数中国患者没有进行癌症早筛查的意识，发现症状后才到医院检查，至结直肠癌确诊时，癌细胞已经扩散，后期疗效不明显，致使中国近半数肠癌患者生存期不超过五年。如果将肠癌早期筛查技术在中国进行普及推广，预计结直肠癌死亡率可从现有水平降低50％以上。

结直肠癌属于筛查效果明确的恶性肿瘤，通过筛查早期发现结直肠癌可有效提高患者生存率，降低死亡率；而对癌前腺瘤(直径≥1厘米)的早期诊断和随后的摘除手术则可降低结直肠癌的发病率。筛查对象可分为一般危险人群和高危人群。在西方发达国家，结直肠癌筛查是针对一般危险人群开展的普查项目，鼓励所有年龄大于50岁的人常规性地接受肠镜和粪便潜血试验(Fecal Occult Blood Test，FOBT)检查。而在我国，虽然在高危人群中开展过“伺机性筛查”，但是尚未有一个针对一般危险人群的结直肠癌筛查项目。随着社会经济的发展和人们健康意识的提高，我国结直肠癌筛查将会从“伺机性筛查”向系统性筛查过渡。结直肠癌筛查的目的将不仅仅是早期诊断结直肠癌，癌前腺瘤的早期发现也将会受到重视；因为结直肠腺瘤的癌变通常耗时10年左右，所以有足够的时间通过筛查和随后的腺瘤摘除手术阻断其癌变过程，达到预防肠癌的目的。

目前结直肠癌的筛查方法主要是结肠镜检查和粪便潜血试验。

纤维结肠镜是迄今为止最准确的结直肠癌筛查方法，肠镜加病理活检被认为是结直肠癌筛查和诊断的金标准。在美国和欧洲的有些国家，纤维结肠镜被广泛地用于结直肠癌的筛查，50岁以上的人每10年被要求做一次肠镜，但是因为肠镜的侵入性和肠道准备时的不适感，有超过半数的美国人不愿接受肠镜检查。在我国，适龄人群接受肠镜筛查手段的不足10％，致使我国发现肠癌多为中晚期，而发现后5年存活率不足50％，低于美国约20个百分点。另外，最近有研究表明肠镜对右侧结肠内常见的扁平息肉的诊断效果不好，肠镜筛查并不能降低右侧结肠癌的死亡率。另外，在我国还要考虑到是否有足够的医疗资源来支持采用肠镜筛查这一庞大的项目。

CT肠镜是一种新型的结直肠癌筛查方法，有研究表明其诊断敏感性可以接近肠镜；但是该法也要求患者做肠道整备，且价格昂贵，不适合普及使用。另外，CT肠镜作为一种筛查手段可能使整个人群受到X线辐射，有导致癌症或血液系统疾病发生的可能。

FOBT检测是唯一被应用于结直肠癌大系列人群筛查且得到循证医学证实可有效降低死亡率的方法，其以粪便中血红蛋白为检测靶标，相对其他方法，其可以做到无创性，不需要肠道准备，方便取材，以及更好的经济性。但也FOBT检测存在很多弊端：其检测的是肿瘤伴随症状—出血，可能出现因暂停出血或肿瘤早期无出血症状造成的漏诊，影响对肿瘤特别是肿瘤早期病变的检测敏感性，目前主流的FOBT检测技术对结直肠癌的敏感性为60-87％，而对进展期肿瘤敏感性为20-43％。

技术实现要素：

本发明针对上述缺点，提供了一种用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法和检测系统，通过取病人的粪便样本，联合DNA检测结果和粪便隐血结果，用于早期结直肠癌和癌前腺瘤的筛查，具有更高的灵敏度。

为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：

本发明提供一种用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒，包括核酸分离与纯化试剂，DNA亚硫酸盐转化试剂，KRAS基因突变检测试剂，BMP3和NDRG4基因甲基化检测试剂，粪便潜血检测试剂；

其中核酸分离与纯化试剂用于分离及纯化出粪便样本中的人源性DNA；

DNA亚硫酸盐转化试剂用于将纯化的部分人源性DNA进行亚硫酸盐转化，用于后续BMP3和NDRG4基因甲基化的检测。

进一步，所述试剂盒还包括样本收集试剂，所述样本收集试剂分为两种，分别用于供基因检测的样本和用于粪便隐血检测的样本。

进一步，其中KRAS基因突变检测试剂中包含1-3mM的MgCl2、0.1-1mM的dNTP、2.5-5U/反应的Taq酶、20-50mM的KCl、1-4mM的Tris、每种KRAS突变型0.4-0.9uM的引物、每种KRAS突变型10uM的的探针。

进一步，BMP3和NDRG4甲基化检测试剂中包含2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、2U/反应的Taq酶、20mM的Tris-HCl、50Mm的NH4+、每种甲基化突变0.75mM的引物、每种甲基化突变0.25mM的的探针。

本发明还提供一种上述用于早期结直肠癌辅助诊断的试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：

样本收集，分别收集用于基因检测和粪便隐血检测的样本；

样本的处理与检测，

核酸的分离与纯化，采用核酸分离与纯化试剂，通过磁珠法分离核酸，然后通过离心柱法纯化核酸；

纯化后的核酸，一部分用于检测KRAS基因突变，采用KRAS基因突变检测试剂检测样本中KRAS基因突变；

另一部分采用DNA亚硫酸盐转化试剂经过亚硫酸盐转化法对其DNA进行转化，然后检测样本中的BMP3和NDRG4基因甲基化；

粪便潜血检测，对样本章的血红蛋白进行检测。

进一步，上述使用方法还包括检测得到的参数关联计算方法，所述计算方法包括以下步骤：

以粪便为检测样本，以KRAS基因突变、BMP3和NDRG4基因甲基化以及血红蛋白为检测靶标，4项检测结果被赋予不同的权重，通过逻辑运算公式进行结果判定；

所述逻辑运算公式为：P＝e^K/(1+e^K)

K＝a*Ct₁+b*Ct₂+c*Ct₃+d*FOBT+X

上式中，P为结直肠癌综合指数；e为自然常数；a,b,c,d,X为常数；Ct₁为KRAS和内参基因Ct值差值；Ct₂为BMP3和内参基因Ct值差值；Ct₃为NDRG4和B2M基因Ct值差值；FOBT为血红蛋白测定值。

进一步，所述a,b,c,d,X通过临床测试数据分布确定。

进一步，所述P值为检测综合指数，根据临床分布确定的判定阈值，P值≥阈值时检测结果为阳性，p值＜阈值时为阴性。另外，Ct1，Ct2，Ct3中分别与在测试人群中分布的最高2.5％为阈值做对比，若Ct1，Ct2，Ct3中的一个或多个值位于最高的2.5％内，则得到阳性结果。

本发明还提供一种用于早期结直肠癌的筛查的检测系统，所述检测系统包括样本收集装置，靶标检测单元，差值计算单元，数据分析单元和数据输出单元；其中样本收集装置用于收集测试人群的粪便样本；

其中靶标检测单元用于检测测试人群粪便样本中的KRAS基因突变、BMP3和NDRG4基因甲基化、粪便血红蛋白；

差值计算单元用于分别计算测试人群的KRAS和内参基因Ct值差值、BMP3和

内参基因Ct值差值；NDRG4和内参基因Ct值差值；

数据分析单元，通过临床样本检测统计分析，以结直肠不同病程及无相关疾病样本经测定以上3类指标，形成与病理相关的趋势性分布，从而通过分布数据得出逻辑判定算法，建立检测数据与病理特征的关联公式：

所述逻辑运算公式为：P＝e^K/(1+e^K)

K＝a*Ct₁+b*Ct₂+c*Ct₃+d*FOBT+X

上式中，P为结直肠癌综合指数；e为自然常数；a,b,c,d,X为常数；Ct₁为KRAS和内参基因Ct值差值；Ct₂为BMP3和内参基因Ct值差值；Ct₃为NDRG4和B2M基因Ct值差值；FOBT为血红蛋白测定值；其中a,b,c,d,X通过临床测试数据分布确定；

数据输出单元，P值为检测综合指数，根据临床分布确定的判定阈值，P值≥阈值时检测结果为阳性，p值＜阈值时为阴性。另外，Ct1，Ct2，Ct3中分别与在测试人群中分布的最高2.5％为阈值做对比，若Ct1，Ct2，Ct3中的一个或多个值位于最高的2.5％内，则得到阳性结果。本发明的有益效果：

本发明的试剂盒通过检测粪便样本中的基因改变以及粪便潜血，达到筛查结直肠癌和癌前腺瘤的目的，实现了基于粪便的检测，完全无创，检测过程非侵入性，无需肠道准备、无症状人群对该检测接受度高；有相较于FOBT检测更高的特异性和敏感性，同时，不仅可以发现结直肠癌，也可以发现癌前腺瘤，为通过摘除癌前腺瘤而预防结直肠癌提供了可能性。相较于纤维肠镜，可以同时发现左右两侧结肠的肿瘤，全肠道检测，无检测盲区。

附图说明

图1是本发明试剂盒的检测步骤图。

图2是一个实施例中三个待测目标基因荧光定量PCR扩增曲线。

图3是一个实施例中BMP3和NDRG4甲基化检测的荧光定量PCR扩增曲线。

图4是一个实施例中粪便血红蛋白ELISA检测标准曲线。

具体实施方式

由于结直肠癌的生长特性，其首先向肠腔伸张，在其生长过程中，包括癌前腺瘤或癌症早期阶段，不断有大量肿瘤细胞经代谢脱落进入排泄系统随粪便一同排出，这些细胞中含有肿瘤发生密切相关的基因，反映肿瘤形成过程，通过检测粪便中的这些基因标记物，就可以发现肿瘤在肠壁上的存在。由于这些基因从肿瘤产生初期就存在，因而能够反映肿瘤最早期的过程。

本发明中使用的基因靶标为KRAS(v-Ki-ras2，Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)基因突变、BMP3(Bone Morphogenetic Protein 3)和NDRG4(N-Myc Downstream-Regulated Gene 4)基因甲基化。KRAS基因突变表现在超过35％的结直肠癌细胞中，其中2号外显子中的7种突变在结直肠癌细胞中更是高达98％。KRAS基因突变，在结直肠肿瘤的形成，包括肠癌及癌前病变中都具有较高程度的表现。NDRG4是癌基因N-myc下游调控基因之一，编码一种胞浆蛋白，这种蛋白在连续细胞周期中有重要作用，另外还和血管平滑肌细胞的有丝分裂调控有关。BMP3是细胞转化生长因子超家族的一员。基因启动子区域DNA序列的甲基化，引起基因表达的变化，BMP3和NDRG4的甲基化与结直肠癌和癌前病变有高度的关联。

申请人通过大量研究发现，KRAS突变和BMP3，NDRG4的甲基化对肠癌和癌变的标示具有互补性，联合起来使用可以有助于提高检测灵敏度。本发明中另一靶标为粪便潜血。因中晚期肠癌会有间断性肿瘤出血，所以粪便里检测到血红蛋白是对这个阶段癌症比较灵敏的标记物。

本发明一个实施例中，试剂盒的主要成分包括下表所述：

表1本发明一个实施例中试剂盒的主要成分

上述试剂中，除非下文中有具体说明的，否则均可以使用本领域常规试剂即可实现。

图1是本发明试剂盒的检测步骤图。如图1所示，所述试剂盒的使用方法包括：

样本收集，使用样本收集试剂收集分别用于基因检测和粪便潜血的样本。

样本处理与检测，包括：

核酸分离与纯化，磁珠法和离心柱法分离及纯化出粪便样本中的人源性DNA。

KRAS基因突变检测，荧光定量PCR法测定KRAS突变基因Ct值与内参基因Ct值的差值△Ct1，目标检测靶点为KRAS第12和13密码子的7种热点突变型；具体的，KRAS基因优选的检测引物和探针，已记载于申请人在先公开的专利申请ZL201510002856.7。

BMP3和NDRG4基因甲基化检测，经亚硫酸盐转化法对DNA进行转化，以荧光定量PCR法对基因甲基化进行MSP(Mehtylation-Specific PCR)法检测，分别测定BMP3和NDRG4甲基化Ct值与内参基因Ct值的差值△Ct2、△Ct3，目标检测靶点为BMP3和NDRG4各自基因启动子附近的11-13个CpG位点；BMP3和NDRG4甲基化优选的检测引物和探针，已记载于申请人在先公开的专利申请ZL 201510486088.7。

粪便潜血检测，ELISA法进行FIT(Fecal Immunochemical Test)检测，定量检测粪便血红蛋白含量。

逻辑运算及结果判定，根据上述测定值，4项检测结果被赋予不同的权重，通过逻辑运算公式运算，并根据设定临床阈值(Cut-off)进行结果判定。

所述逻辑运算公式为：P＝eK/(1+eK)

上式中，P为综合指数，K＝a*△Ct1+b*△Ct2+c*△Ct3+d*FIT+X，e为自然常数；a,b,c,d,X为临床常数。

当P值≥Cut-off时检测结果为阳性，p值＜Cut-off时为阴性。

以上公式中的a,b,c,d,X通过足够数量的临床研究数据分布确定，这个研究包括了有肠镜病理结果的不同病程分布的临床样本，包括结直肠癌、进展期腺瘤、非进展期腺瘤、息肉及无症状人群样本。对这些样品进行以上四项检测后，将单项检测结果与肠镜标准结果进行逻辑回归分析，分析结果给出不同阈值下的联合检测灵敏度和特异性。根据这个筛查手段的要求确定最适合的灵敏度和特异性后，就可确定这几个常数，以及相应的总分阈值。

另外，根据临床研究结果，上述4个单项检测中的结果也会和临床分布中对应的最高的2.5％为阈值进行对比，即当检测样本中的△Ct1、△Ct2、△Ct3及FIT中任一个或多个结果高于这个阈值，结果也判定为阳性，以保证单项因子有很高数值时确定为检测阳性。最终检测的结果指数综合了各项因子经回归系数权重相乘后的得分和单项是否属于最高2.5％的得分而算出最后指数。

因此本发明提供一种试剂盒，实现定性检测粪便样本中的KRAS基因突变、BMP3和NDRG4基因甲基化以及粪便潜血共4个靶标的技术。同时，该试剂盒提供一种联合检测的逻辑运算方法，将4个单项检测的结果进行综合，得出样本最后总分以及检测结果。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不仅限于下述实施例。所述实施例中所涉及的实验方法，如无特殊说明，均为本领域内常规方法。本实施例所用试剂盒为本发明的所得试剂盒。

粪便样本的具体检查流程：

(1)样本收集，使用样本收集试剂收集分别用于基因检测和粪便潜血的样本。

其中，用于核酸提取的样本用量为1-5g，用于便潜血检测的样本为10mg，样本收集试剂保证样本收集和储存的稳定性。样本收集试剂中的样本稳定剂只要能维持样本成分相对稳定便于检验即可，本发明中所述样本稳定剂可以选用现有的，也可以选用发明人在先专利申请文件CN104073564A中公开的稳定剂。

(2)样本处理与检测，包括：

1)核酸分离与纯化，磁珠法和离心柱法分离及纯化出粪便样本中的人源性DNA。

为了获得最优的分离纯化效果，本发明使用两级分离和纯化装置，样本裂解后的核酸先使用磁珠法富集分离，再进行离心柱法进一步纯化，保证核酸质量。其中，要求使用分光光度计法测定DNA的OD260/280应在1.8-20.之间，浓度应在10-500ng/ul之间。

2)KRAS基因突变检测，荧光定量PCR法测定KRAS突变基因Ct值与内参基因Ct值的差值△Ct1，目标检测靶点为KRAS第12和13密码子的7种热点突变型。

为了获得足够高的检测灵敏度，本发明使用了突变扩展阻滞系统(amplification refractory mutation system,ARMS)技术，使用的PCR反应体系及反应程序中的各因素经过了优化，通过拟合因素和因变量之间的函数关系，得到最佳的反应体系和反应程序。

为了使本试剂盒的使用更加方便，本发明同时使用了多重PCR技术，7种目标突变型检测以及内参基因检测被放入同一反应管，可以实现一次反应完成检测。

优化之后，KRAS基因突变检测的具体反应体系为：1-3mM的MgCl₂、0.1-1mM的dNTP、2.5-5U/反应的Taq酶、20-50mM的KCl、1-4mM的Tris(Ph8.0)、0.4-0.9uM的引物(每种突变型)、10uM的的探针(每种突变型)。

进一步，具体的反应程序为：95℃，5min；95℃，25sec，64℃，20sec，72℃，20sec，15cycles；93℃，25sec，60℃，35sec，72℃，20sec，45cycles；

图2是本实施例中KRAS突变检测的荧光定量PCR扩增曲线。

3)BMP3和NDRG4基因甲基化检测，经亚硫酸盐转化法对DNA进行转化，以荧光定量PCR法对基因甲基化进行MSP(Mehtylation-Specific PCR)法检测，分别测定BMP3和NDRG4甲基化Ct值与内参基因Ct值的差值△Ct2、△Ct3，目标检测靶点为BMP3和NDRG4各自基因启动子附近的11-13个CpG位点。

本发明提供了一种DNA亚硫酸盐转化的试剂，DNA经亚硫酸盐处理，经过硫化、脱氨基、脱硫化学反应，使没有甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，该化学反应通过亚硫酸盐离子亲核反应结合到胞嘧啶上，而发生甲基化的胞嘧啶则不会发生转化，基于此，特异性针对甲基化序列的探针被设计，用于专一性检测基因甲基化序列。

具体地，优选的，本发明中的亚硫酸盐转化液成分包括：NaOH、NaHSO₃、(NH4)₂SO₃.H₂O、NH₄HSO₃。

为了获得足够高的检测灵敏度，本发明使用Taqman荧光探针技术，使用的PCR反应体系及反应程序中的各因素经过了优化，通过拟合因素和因变量之间的函数关系，得到最佳的反应体系和反应程序。

为了使本试剂盒的使用更加方便，本发明同时使用了多重PCR技术，2个目标甲基化基因和内参基因被放入同一反应管，两个基因被不同的荧光染料区分，可以实现一次反应完成检测。

优化之后，BMP3和NDRG4甲基化检测的具体反应体系为：2mM的Mg²⁺、0.2mM的dNTP、2U/反应的Taq酶、20mM的Tris-HCl(Ph8.0)、50Mm的NH4⁺、0.75mM的引物(每种突变型)、0.25mM的的探针(每种突变型)。

进一步，具体的反应程序为：95℃，2min；95℃，20sec，60℃，60sec，50cycles。

图3是本实施例中BMP3和NDRG4甲基化检测的荧光定量PCR扩增曲线。

4)粪便潜血检测，ELISA法进行FIT(Fecal Immunochemical Test)检测，定量检测粪便血红蛋白含量。

相较于市场上使用的胶体金定性血红蛋白检测法，本发明使用了ELISA双抗夹心法进行血红蛋白定量检测。

本发明中的粪便血红蛋白检测灵敏度为10ng/ml。

图4为本实施例中粪便血红蛋白ELISA检测标准曲线。

为了验证本发明的有益效果，本实施例还进行了临床验证试验，通过本发明的检测方法和逻辑运算公式及判定方法，以胶体金法FOBT检测为对照，以检测灵敏性和特异性为指标进行性能对比。

临床试验共选取临床样本总计384人份，入选人进行肠镜检查之前收集粪便样品并进行上述指标检测。

试验中的病理分类又肠镜检查得出，共分为5个类别：

a，结直肠癌(I～IV期)；

b，进展期腺瘤，指满足以下一项或多项标准的腺瘤：a)直径＞10mm；b)含有绒毛成分；c)有重度异型增生或高级别上皮内瘤变。

c，非进展期腺瘤(归为阴性)

d，息肉(归为阴性)

e，阴性(结肠镜和病理组织检查都无症状)

其中c、d、e类统计为病理阴性，a、b类统计为病理阳性。

数据分析采用了SAS 9.4and JMP 11.1.1(64-bit)软件(SAS Institute).公式的建立将四个变异数因子△Ct1、△Ct2、△Ct3及FIT检测结果与病理分类进行了逻辑回归分析，得到的结果决定了每个因子在公式中的临床系数。另外，单项结果也与其在测试人群中分布的最高2.5％为阈值做对比。如果单项结果属于最高的2.5％以内，则足够以单项结果促成检测阳性结果。最终检测的结果指数综合了各项因子经回归系数权重相乘后的得分和单项是否属于最高2.5％的得分而算出最后指数。

所述逻辑运算公式为：P＝e^K/(1+e^K)

上式中，P为综合指数，K＝a*△Ct1+b*△Ct2+c*△Ct3+d*FIT+X，e为自然常数；a,b,c,d,X为临床常数。

当P值≥Cut-off时检测结果为阳性，p值＜Cut-off时为阴性。

具体临床试验结果如下(见表2)

表2临床试验结果对比

注：

灵敏度(也称真阳性率，sensitivity)＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％。

指正确判断病人的程度，也即实际有病而被正确诊断的百分比。

特异度(也称真阴性率，specificity)＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％。

指正确判断非病人的程度，也即实际无病而被正确诊断为无病的百分比。

显而易见的，本发明中的检测试剂盒及相应检测方法，作为一种非侵入性检测方式，可以实现相较于FOBT(胶体金法)更高的检测灵敏度，特别对于腺瘤的检出率有显著提高，特别是对于进展期腺瘤具有更高的检出率，虽然在特异性参数上有所降低，但对于群体筛查提高敏感性更有实际意义，对于通过摘除癌前腺瘤而预防结直肠癌提供了可能。

本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。