一种hiv-1基因型和耐药突变位点的检测试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种HIV-I基因型和耐药突变位点的检测试剂盒及其应用，属于生物
技术领域。
【背景技术】
[0002] 自1981年美国首先发现艾滋病（AIDS)由人类免疫缺陷病毒（HIV)感染引起以 来，艾滋病已在全球迅速蔓延开来。据联合国艾滋病计划署和世界卫生组织联合发布的全 球艾滋病流行情况的报道中显示：截止到2009年，全世界感染总人数3340万人，新增感染 人数约为270万人，死亡人数200万人，210万年龄小于15岁的感染者，全世界每天有超过 7400例新增感染者。而我国HIV感染人数每年以3%的速度增长，流行发展趋势严峻。根 据卫生部2011年发布的中国艾滋病疫情估计报告显示，截止到2011年底，中国存活艾滋病 病毒感染者和艾滋病病人（PLHIV) 78万人。其中AIDS病人15. 4万人。
[0003] 20世纪90年代以来，抗艾滋病病毒药物有了突飞猛进的发展。自1987年第一个 抗艾滋病毒药物齐多夫定上市以来，已发展到18个品种，目前向美国FDA申请的新药有100 个之多。抗艾滋病病毒药物大致可以分为核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制 剂及蛋白酶抑制剂三大类。随着高效抗逆转录病毒联合疗法（HAART)的开展，对于延长艾 滋病感染者的寿命，提高生存质量起到了积极作用。在我国，自从2004年以来已有多个地 区对艾滋病患者实施免费的高效抗逆转录病毒治疗，为我国艾滋病患者带来了福音。然而， HIV耐药病毒株的出现和传播给艾滋病的抗病毒治疗带来了极大的困难，已经成为影响艾 滋病治疗效果的重要原因。对耐药性HIV毒株进行研宄及检测，已经成为艾滋病临床治疗 中非常重要的一个环节，对于减缓耐药株的产生及传播，以及指导患者个体化临床用药有 着重要现实意义。
[0004] 目前，HIV耐药检测主要有两种方法：表型耐药检测和基因型耐药检测。而基因 型耐药检测最常用，也是最早用于HIV耐药检测的方法之一。基因型耐药检测主要是通 过PCR扩增的方法对HIV基因组中与耐药相关的突变的进行检测，其中基于测序的方法 对耐药突变位点进行分析的方法较为流行。HIV-I耐药位点的研宄主要集中于Pol基因 的蛋白酶基因区、逆转录酶基因区和整合酶基因区。其中，对于蛋白酶基因区和逆转录酶 基因区的耐药位点研宄较为深入，蛋白酶基因区对应蛋白酶抑制剂耐药位点（protease inhibitor resistance mutations, Pis)，逆转录酶基因区对应核苷类逆转录酶抑制剂耐 药位点（nucleoside RT inhibitor resistance mutations, NRTIs)和非核苷类逆转录酶 抑制剂耐药位点（non-nucleoside RT inhibitor resistance mutations, NNRTIs)。现有的 基于测序的HIV基因型耐药检测体系主要有三大类，包括了雅培公司的ViroSeq? HIV分型 系统、Bayer公司的TRUGENE? HIV-I基因分析系统以及国内外一些大学或研宄机构建立的 In-house方法。这些检测方法的原理大致相同，主要方法是提取HIV核酸，通过单套或多套 引物系统对病毒基因组中包含蛋白酶和部分逆转录酶的基因片段进行RT-PCR，对PCR产物 进行测序分析。前两者已经出现商业化检测试剂盒，并被美国FDA批准上市，已经成功应用 于HIV耐药检测相关临床研宄。然而，这两种检测系统主要是针对欧美流行的B亚型病毒株 进行建立的，对于中国主要流行的CRF01_AE亚型、B亚型、B'亚型、CRF07_BC亚型、CRF08_ BC亚型或C亚型以及其它流行重组型病毒株的耐药检测效果并不理想。此外，这两款商业 化的耐药检测试剂盒价格昂贵，不利于在我国大规模临床应用。而国内一些研宄机构自建 的In-house方法，虽然对国内的HIV耐药检测起到了一定的作用，但是这些In-house方法 操作繁琐，更重要的是操作过程和分析方法不统一，难以真正有效的用于大规模的临床检 测。基于以上原因，研制开发一种适用于我国HIV耐药检测的方法迫在眉睫。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种检测待测HIV-I基因组的基因型或耐药突变位点 的成套引物。
[0006] 本发明提供的检测待测HIV-I基因组的基因型或耐药突变位点的成套引物由序 列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物2、序列表中序列3所示的引物3、 序列表中序列4所示的引物4、序列表中序列5所示的引物5、序列表中序列6所示的引物 6、序列表中序列7所示的引物7和序列表中序列8所示的引物8组成。
[0007] 本发明提供的检测待测HIV-I基因组的基因型或耐药突变位点的成套引物由扩 增引物对和测序引物组组成；
[0008] 所述扩增引物对由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2 组成；
[0009] 或所述扩增引物对由序列表中序列1所示的引物1、序列表中序列2所示的引物 2、序列表中序列3所示的引物3和序列表中序列8所示的引物8组成；
[0010] 所述测序引物组由序列表中序列3所示的引物3、序列表中序列4所示的引物4、 序列表中序列5所示的引物5、序列表中序列6所示的引物6、序列表中序列7所示的引物 7和序列表中序列8所示的引物8组成。
[0011] 上述成套引物中，所述基因型为CRF01_AE亚型、B亚型、B'亚型、CRF07_BC亚型、 CRF08_BC亚型或C亚型；
[0012] 所述耐药突变位点位于HIV-I基因组的Pol基因，包含蛋白酶基因区1-99位氨基 酸编码子和逆转录酶基因区1-300位氨基酸编码子；
[0013] 所述耐药突变位点为 I84V、A62V、A71V、A71T、K101E、K101H、L10I、L10V、L74V、 V75M、V90I、V106M、V106I、V179D、V179E、V179D/V、Q58E、Q58E/Q、F227F/L、M184V、D67N、 G190S、G190A、T69A/T 或 T69D/N。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种检测Hiv-I基因组的基因型或耐药突变位点的 试剂盒。
[0015] 本发明提供的检测HIV-I基因组的基因型或耐药突变位点的试剂盒为1)或2):
[0016] 1)包括上述成套引物；
[0017] 2)包括RT-PCR扩增试剂A、RT-PCR扩增试剂B、RT-PCR扩增试剂C和测序扩增试 剂组成；
[0018] 所述RT-PCR扩增试剂A为2 X Reaction Mix溶液；
[0019] 所述RT-PCR扩增试剂B由上述成套引物中的引物1、上述成套引物中的引物2、 dUTP 和 Dnase/Rnase-free ddH20 组成；
[0020] 所述RT-PCR扩增试剂 C 由 Superscript'、III RT/Platinum Taq Mix 和 Antarctic Thermolabile UDG 组成；
[0021] 所述测序扩增试剂由测序扩增试剂I、测序扩增试剂2、测序扩增试剂3、测序扩增 试剂4、测序扩增试剂5和测序扩增试剂6组成；
[0022] 所述测序扩增试剂 1 是由 2.5xBigDyeK Terminator v3. IReady Reaction Mix、 缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物3组成；
[0023] 所述测序扩增试剂 2 是由2.5xBigDyel< Terminator v3. IReady Reaction Mix、 缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物4组成；
[0024] 所述测序扩增试剂 3 是由 SJxBigDye1' Terminator v3. IReady Reaction Mix、 缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物5组成；
[0025] 所述测序扩增试剂 4 是由 2.5xBigDyeK Terminator v3. IReady Reaction Mix、 缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物6组成；
[0026] 所述测序扩增试剂 5 是由 2.5xBigDyeK Terminator v3. IReady Reaction Mix、 缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物7组成；
[0027] 所述测序扩增试剂 6 是由 2.5xBigDyeK Terminator v3. IReady Reaction Mix、 缓冲液、纯化水和上述成套引物中的引物8组成。
[0028] 上述试剂盒中，所述引物1和所述引物2的物质的量相同；所述引物3、所述引物 4、所述引物5、所述引物6、所述引物7和所述引物8的物质的量相同；
[0029] 所述引物1或所述引物2与所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述 引物7或所述引物8的物质的量的比为5:3. 2。
[0030] 上述试剂盒还包括PCR扩增试剂D、PCR产物纯化试剂、测序产物纯化试剂1、测序 产物纯化试剂2、阳性对照品和阴性对照品；
[0031] 所述PCR扩增试剂D由上述成套引物中的引物3、上述成套引物中的引物8和 Dnase/Rnase-free ddH20 组成；
[0032] 所述PCR产物纯化试剂由热敏磷酸酶（Antarctic Phosphatase)、外切核酸酶 I (Exonuclease I)、热敏磷酸酶缓冲液和纯化水组成；
[0033] 所述测序产物纯化试剂1由醋酸铵和纯化水组成；
[0034] 所述测序产物纯化试剂2由纯化水组成；
[0035] 所述阳性对照品为含有Pol基因的cRNA ;所述cRNA的核苷酸序列为序列12 ;
[0036] 所述阴性对照品为 DNase/RNase-free (IdH2O0
[0037] 上述试剂盒中，所述PCR扩增试剂D中的引物3和引物8的物质的量相同。
[0038] 上述试剂盒中，所述基因型为CRF01_A