Pik3ca基因突变检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种PIK3CA基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中PIK3CA基因Exon9和20两个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1?4；（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对PIK3CA基因Exon9和20两个外显子进行测序分析，引物序列分别是SEQ ID Nos：5?6；（3）2个装有PIK3CA野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管。本试剂盒可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中PIK3CA基因主要突变位点型别。
【专利说明】
PIK3CA基因突变检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因 PIK3CA基因突变检测试剂 盒。
【背景技术】
[0002] PIK3CA基因是逆转录病毒v_p3k癌基因在细胞内的同系物，编码的I类磷脂酰-3- 激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3Ks)是由一个pi 10催化亚单位和一个p85调节 亚单位组成的异元二聚体，由生长因子受体酪氨酸激酶如表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR)、胰岛素受体等激活。PI3Ks活化后催化磷脂酰肌醇4磷酸 (PI-4-P)和磷脂酰肌醇4,5_二磷酸(PI-4,5-P2)磷酸化成磷脂酰肌醇3,4二磷酸(PI-3,4- P2)和磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸（PI-3,4,5-P3，Ptd InsP3)。从而活化一系列蛋白，包括 调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等，涉及mT0R(target of repamycin)、BAD、Caspace9、 Tuberin、GSK30和FH(Fork head)转录因子家族亚群等众多的革El分子。其中比较重要的 是苏-丝氨酸激酶AKLAKT与Ptd Ins P3结合后被定位到质膜，然后被磷酸肌醇依赖性蛋 白激酶1和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶2活化，从而抑制细胞凋亡，促进细胞存活。当PIK3CA基 因以基因扩增或点突变等形式激活时，其转录与翻译水平升高，通过PI3K-AKT途径，使AKT 过度激活，无限制的促进细胞生长和繁殖，并抑制细胞凋亡，最终导致肿瘤发生。
[0003] 对PI3K家族全部16个成员的激酶结构域外显子编码区进行序列分析显示， PIK3CA是唯一被发现由体细胞突变引起致癌的基因。多个研究均提出PIK3CA基因的突变 80 % -90 %聚集在该基因的螺旋区（exon9)和激酶区（exon20)这两个热点区域。目前已报道 的 PIK3CA 突变位点主要有以下几个:E542K/L、E545K/G、D549E、H1047L/R/Y、R38H、G106V、 C420R、E543Q、Q546K、M1043I，其中高频突变位点为E542K、E545K、H1047R。用体外细胞培养 的方法对这两个热点突变区的研究发现其突变不仅可以减少细胞的凋亡还可以促进肿瘤 的浸润、提高其下游激酶P13Ks的活性。关于PIK3CA突变这两个热点区的研究发现，激 酶区和螺旋区的突变可能通过不同的机制引起酶功能性的改变。不同区域的突变，分别通 过与P13Ks的调节亚单位p85和RAS-GTP相互作用的不同机制导致P13Ks的活化。螺 旋区突变诱导获得性的功能改变时不依赖与P85的结合，但却需要与RAS-GTP的相互作 用;相反的，激酶区的突变在缺少RAS-GTP时是有效的但却高度依赖p85。可见，激酶区和 螺旋区的突变是通过两个不同的且独立的机制发挥作用的，在同一个分子中这两种机制的 突变是相互协同的。
[0004] 研究表明，约30%的人类实体肿瘤中存在癌基因 PIK3CA的突变，且在多种肿瘤中 出现扩增或者过表达。据报道PIK3CA基因在结肠癌、卵巢癌和乳腺癌、胃癌和肝癌等多 种肿瘤中发生高频体细胞突变。其中该基因在乳腺癌组织中的突变频率在8 %-40 %。最近 研究证实PI3K通路的激活，无论是通过抑癌基因 PTEN的失活还是癌基因 PIK3CA的激活，都 可引起乳腺癌患者对革G向药物Herceptin的耐药。赫赛汀（Herceptin)是一种抗HER2 单克隆抗体，可选择性作用于人类表皮生长因子受体2(HER2)，从而干扰癌细胞的生物学 进程，抑制癌细胞的增生，赫赛汀用于治疗转移性乳腺癌，以及手术后的HER2阳性乳腺癌患 者。研究发现赫赛汀对PIK3CA基因突变人群的疗效欠佳。PIK3CA基因突变检测可为乳腺癌 患者的合理使用赫赛汀用药提供参考依据。
[0005] PIK3CA基因在结直肠癌中也是一个高频突变基因，其突变率高达32% Jardena Samuels等采用基因打靶(gene targeting)技术对含有H1047R突变的HCT116和含E545K突 变的DLD1两种人结肠癌细胞株进行了研究，发现含突变的细胞具有对抗肿瘤坏死因子相关 凋亡诱导配体(TRAIL)所诱导凋亡的能力且含上述突变的细胞株穿越多孔膜和侵入基质胶 的能力是野生型细胞株的6~8倍。因此，推测PIK3CA基因突变可能参与结直肠癌的抗凋亡、 侵袭与转移过程中。PIK3CA基因突变结直肠癌患者接受抗EGFR单抗疗效不佳，KRAS与 PIK3CA基因联合检测可更好的预测抗EGFR单抗疗效。以上发现提示，对于肿瘤患者，在治 疗前进行KRAS/BRAF、PI3KCA突变和PTEN表达状况的检测，可能对个体化选择EGFR靶向 治疗以避免不必要的毒性和经济负担有积极的意义 PIK3CA基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、FISH等。其中FISH技术主要适用于 拷贝数变异的检测，同时由于操作过程繁琐，该方法以逐渐显现其局限性;ARMS技术是目前 国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能 实现分型，对样本量要求高;而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测 已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的 金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式 及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种Sanger测序法检测PIK3CA基因的技 术具有重要的临床意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种PIK3CA基因突变检测试剂盒，可直 接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中PIK3CA基因主 要突变位点型别，检测位点包括PIK3CA基因 9和20两个外显子的主要突变位点，包括但不限 于9号外显子上c. 1633G>A，p.E545K突变位点；20号外显子上c. 3140A>G，p.H1047R突变位 点。
[0007] 本发明的PIK3CA基因突变检测试剂盒具体包括： (1) 用于扩增样本中PIK3CA基因 Exon9和20两个外显子的特异性引物，具体序列如下：
(2) 用于测序PCR的测序引物，分别用于对PIK3CA基因 Exon9和20两个外显子进行测序 分析，具体序列如下：
(3)2个装有PIK3CA野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1 个装有PCR反应预混液的试管;其中突变型质粒包括9号外显子上c.1633G>A，P.E545K突变 位点；20号外显子上c. 3140A>G，p. H1047R突变位点;PCR反应预混液由以下组份组成：
其中 10x PCR buffer中含有500 mM KC1，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH4) 2SO4,和 15 mM MgCl2;5x Q solution 中含有 1M Tricine [pH8.7(with KOH)]，8% (v/v) Glycerol和5% (v/v) DMS0;25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和 25mM dGTPs〇
[0008] 本试剂盒主是根据PIK3CA基因的Exon9和20两个外显子的保守序列分别设计 PIK3CA基因四个外显子的特异性引物，分别将Exon9和20两个外显子使用PCR的方法进行扩 增，纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预 混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测 到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括： (1)引物设计:利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从PIK3CA基因 DNA序列中挑选 特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计PIK3CA基因 Exon9和20两个外显子的特异性引 物，用于扩增样本中DNA，引物序列分别是SEQ ID N0s:l-4。。测序引物的设计与用于扩增样 本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ ID NOs：5-60
[0009] (2 )PCR扩增:利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。
[0010] (3)琼脂糖凝胶电泳及胶回收:将扩增得到的目的基因 PIK3CA的Exon9和20两个外 显子片段回收用于测序。
【附图说明】
[0011] 以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。
[0012] 图1为PIK3CA基因的Exon9和20两个外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。 [0013]附图1中各标号的具体表不如下： 1:1号样本;2:2号样本;3:3号样本;P9:PIK3CA基因第9号外显子;P20:PIK3CA基因第20 号外显子;M:DNA maker。
[0014]图2-1为PIK3CA基因的Exon9外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
[0015]图2-2为PIK3CA基因的Exon9外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
[0016]图2-3为PIK3CA基因的Exon20外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
[0017]图2-4为PIK3CA基因的Exon20外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
【具体实施方式】
[0018] 1、引物设计 根据PIK3CA基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引 物设计软件，如Primer Premier 5,从PIK3CA基因 DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱 基互补特点，设计PIK3CA基因 Exon9和20两个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。弓| 物序列分别是SEQ ID Nos: 1-4。
[0019] 测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物 只需要一段即可，引物序列分别是SEQ ID Nos:5-6。
[0020] 2、PCR 扩增 2.1、质控品准备 阳性质控品为PIK3CA野生型和突变型质粒混合物，阴性质控品为无菌水。使用前室温 融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。
[0021] 2.2、试剂配制 提前将试剂取出，室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。
[0022]确定反应数N，N=待检样本数(η) X 4+质控品数+1。计算加到反映混合物中的各个 试剂的量，计算如下：
' 取一个灭菌离心管配制上述反应体系，试剂全部加入后旋涡振荡10秒，瞬时离心。然后^ 将上述混合液按20μ1/管分装至PCR反应管中。
[0023] 2.3、加样 将PIK3CA阳性质控品、阴性质控品和样本DNA分别取2.5 μL加入到PCR反应管中，其中 样本要稀释至20ngAU;然后再将相应的引物加入到对应的PCR反应管中，每个样本需要引 物各加2.5μ1 (引物用之前先稀释1/10至ΙΟμΜ)，同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离心15秒， 将管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离心至气泡完全消除。然后立即进行PCR 扩增反应。
[0024] 2.4、PCR 扩增 配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行反应，PCR反应程序如下：
3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收 由于PCR产物长度较短，配制2%(w/w)的琼脂糖凝胶；电泳条件为120V，20min。电泳完成 后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR产物电泳结 果良好，即可回收目的片段用于测序。本试剂盒不包含核酸回收成分，请采用商品化的琼脂 糖凝胶回收试剂盒。回收得到的产物即可用于测序。
【主权项】
1. 用于检测PIK3CA基因突变的Exon9和20两个外显子的引物，包括特异性引物和测序 引物，特异性引物序列分别是SEQ ID Nos: 1-4,测序引物序列分别是SEQ ID Nos:5-6。 2. PIK3CA基因突变检测试剂盒，包括： (1) 用于扩增样本中PIK3CA基因 Exon9和20两个外显子的特异性引物，引物序列分别是 沈Q ID Nos:1-4; (2) 用于测序PCR的测序引物，分别用于对PIK3CA基因 Exon9和20两个外显子进行测序 分析，引物序列分别是SEQ ID Nos:5-6; (3) 2个装有PIK3CA野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1 个装有PCR反应预混液的试管，其中突变型质粒包括9号外显子上C. 1633G〉A，P.E545K突变 位点；20号外显子上C. 3140A〉G，P.化047R突变位点。3. 权利要求2所述试剂盒，其特征在于，PCR反应预混液由W下表组成：其中lOit PCR buffer中含有500 mM KC1，100 mM Tris-HCl (pH 8.3),100 mM (N也） 2S〇4,和 15 mM MgCl2;5禁 Q solution 中含有IM Tricine [p册.7(with KOH)]，8〇/〇 (v/v) Glycero巧P5% (v/v) DMS0;25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和 25mM dGTPso
【文档编号】C12N15/11GK105838823SQ201610402451
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】葛毅媛, 陈俊飞, 郑焱, 谢龙旭
【申请人】广东凯普生物科技股份有限公司