用于检测egfr基因t790m突变的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测EGFR基因T790M突变的试剂盒，包括检测体系，检测体系包括突变型检测引物和探针(引物T790?FY、引物T790?RY和探针T790?PT)、野生型特异结合的PNA序列(T790M?PNA)，以及内控引物和探针(引物NK?FY、引物NK?RY和探针NK?PT)；探针序列的5’端结合荧光报告基团，3’端结合荧光淬灭基团，且突变型检测探针和内控探针荧光报告基团不同。本发明是为T790M检测特定设计的检测组合，可以高灵敏度、高特异性地对T790M突变进行检测，样本只需外周血DNA，无创伤，可实时监控病情，为肺癌新药Tagrisso对T790M突变患者治疗提供用药指导。
【专利说明】
用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒
技术领域
[00011本发明涉及肿瘤检测技术领域，具体涉及一种用于检测EGFR基因 T790M突变的试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物学的迅速发展，人们对肿瘤的认识达到了分子水平。许多肿瘤相关 基因已被发现，肿瘤药物的靶向治疗也得到了很好的疗效，根据不同药物的疗效与肿瘤基 因类型有相关性，采取检测肿瘤基因类型能帮助临床医生采取精准的治疗方案。美国食品 药品监督管理局于2003年5月批准了美国阿斯利康(Aotrazeneca)公司生产的小分子基因 靶点药物吉非替尼（Gefitinib，也称为易瑞沙/Iressa)用于治疗晚期非小细胞肺癌 (NSCLC)。吉非替尼是一种口服的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，它对EGFR突变 的肺癌患者有很好的治疗敏感性，通过抑制该酶的活性来抑制肿瘤的增长、增殖，却无明显 的化疗副作用。
[0003] 但是据估计，约30-40 %的亚洲NSCLC患者在确诊时携带EGFR突变，高达2/3的患者 在接受当前已上市EGFR-TKI治疗后病情进展产生T790M耐药突变，使得EGFR-TKI失去了治 疗效果，疾病无法控制。而Tagrisso将为这类患者提供一种重要的治疗选择，该药可靶向参 与肿瘤发生的T790M耐药突变的有效治疗。英国制药巨头阿斯利康(AstraZeneca)在研肺癌 新药Tagrisso(omisertinib，AZD9291)获日本监管机构批准，用于对表皮细胞生长因子受 体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗有抵抗的EGFR T790M突变阳性(EGFR基因外显子20 第790位密码子出现C>T转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由苏氨酸转变为甲硫氨酸， 即T790M)、手术无法治愈的或复发性非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗。对EGFR-TIK产出耐药 的，明确检测到T790M突变阳性的患者接受了 &8488〇(〇11^86^丨11讣4209291)治疗后01^为 61 %，中位无进展生存期（PFS)为9.6个月。所以服用EGFR-TKI的肺癌患者需要定期检查 T790M突变，监控EGFR-TKI耐药进展，帮助医生选择最佳治疗方案，避免耽搁治疗有效时机。
[0004] 目前，针对肿瘤基因突变的检测方法主要有直接测序法、荧光定量PCR法和高分辨 率熔解曲线法。这些方法所需要的DNA样本一般来自石蜡包埋的肿瘤组织，每次检测需要手 术取组织或穿刺取样，这种方法对病人身体会有不同程度的伤害，只能检测较晚期的肿瘤， 导致治疗滞后，治愈率低；而且肿瘤组织上的不同区域基因突变情况不同无法做到精确取 样，所以组织样本无法实现肿瘤遗传信息的实时监控，准确掌握肿瘤发生发展的动态过程。 而实时监控，准确掌握疾病发展的动态过程，恰恰是医疗大数据、精准医学和个性化治疗迫 切需求的。
[0005] 近年的研究发现，从肿瘤患者的外周血游离DNA中，可以检测到全身各处原发灶的 多种异常基因，是一种无创性肿瘤诊断的新方法，也为肿瘤早期诊断提供了新的希望。目前 针对ctDNA的检测方法有荧光定量PCR法、数字PCR法和二代测序分析法，但由于游离DNA在 血液中的含量较少，而且游离DNA中的T790M突变DNA就更少，现有的EGFR多位点联合qPCR方 法检测试剂盒的灵敏度（只有1 %的灵敏度)和精密度很难达到要求，而且大多EGFR多位点 检测不能做到T790M位点的单独分型，市场上需要一种单独检测T790M突变的试剂盒。数字 PCR虽然有较高的灵敏度但是它的检测通量小、设备昂贵、操作复杂、易污染，造成临床推广 很困难。二代测序ctDNA分析技术有较好的检测灵敏度和多重基因检测能力，同时也能检测 未知突变，但是一次检测在上万元费用，不利于单个明确的T790M目标基因的检测，给患者 带来巨大的经济负担。
[0006] 肿瘤患者的T790M耐药进展需要定期进行基因检测，现有的检测技术需要手术获 取肿瘤组织样本，然而每次检测都需要做手术取样本的方法在医学上和操作上都非常不可 行，为精准治疗带来很大障碍。比如组织取样只能分布取样，然后肿块的每一个区域的基因 突变情况都有着很大的不同，检测结果具有随机性。而且当发现肿块的时候病情已经有了 很大的进展。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中的上述问题，本发明设计了一种用于检测EGFR基因 T790M突 变的试剂盒，可以从人类外周血中富集提取循环肿瘤游离DNA(ctDNA)为模板进行qPCR基因 突变检测，避免了通过手术或穿刺对患者身体的伤害。该研发该试剂盒的另一个目的是提 高检测灵敏度。本发明的再一目的是提高检测特异性。
[0008] 本发明提供的用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，包括检测体系，所述检测体 系包括突变型检测引物和探针、野生型特异结合的PNA序列，以及内控引物和探针；
[0019] 探针序列的5'端结合荧光报告基团，3'端结合荧光淬灭基团，且突变型检测探针 和内控探针序列两端结合的荧光报告基团不同。
[0020] 上述引物和探针设计，采用了 ARMS、Taqman和PNA联合技术。
[0021 ] 等位基因特异性扩增(Alleles specific amplification，ASA)-又称扩增阻碍突 变系统（Amplification refractory mutation system，ARMS)，利用PCR引物的3'端末位喊 基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格 的条件下，只有在引物3'碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变，该法省 去了探针杂交操作。
[0022] TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3 ' -5 '外切核酸 酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就 代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。 探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5'端标记有荧光报告基 团(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3'端标记有焚光淬灭基团（Quencher，Q)。
[0023] 肽核酸（peptide nucleic acids，PNA)是20世纪90年代初发现的新型DNA/RNA同 类物，是一种人工合成的以电中性的肽链酰胺2-氨乙基甘氨酸组成、多聚酰胺键取代DNA中 的戊糖磷酸二酯键骨架而形成的类似核苷酸的物质。由于特异的T790M野生型PNA与T790M 野生型DNA稳固结合后不被DNA聚合酶3 ' -5 '端酶切功能所切割，阻碍T790M野生型DNA的PCR 扩增，从而实现T790M突变型的筛选。
[0024] 本发明通过ARMS+Taqman+PNA联合技术，以肿瘤患者外周血血浆中提取的游离DNA 为检测模板，检测灵敏度能够达到〇. 1~〇 . 5 %，解决了现有的EGFR多位点联合qPCR方法检 测的灵敏度和特异性很难达到要求，且大多EGFR多位点检测不能做到T790M位点的单独分 型的问题。
[0025] 优选地，上述用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，突变型检测探针结合的荧光 报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1;内控探针序列结合的荧光报告基团为J0E，荧光淬灭 基团为BHQ1。
[0026]优选地，以上所述用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，还包括外控体系，所述 外控体系包括外控qPCR反应引物和探针，核苷酸序列为：
[0030] 探针WK-PT的5'端结合荧光报告基团，3'端结合荧光淬灭基团，且荧光报告基团与 内控探针结合的荧光报告基团不同。
[0031] 外控体系扩增有效DNA片段的反应组，用于对有效DNA量的监控。同一个反应组里 的不同探针需要有信号区分，所以外控体系探针WK-PT的荧光报告基团应不同于内控探针 NK-PT的荧光报告基团。
[0032] 优选地，上述用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，探针WK-PT的5 '端结合的荧 光报告基团为FAM，3'端结合的荧光淬灭基团为BHQ1。
[0033] 优选地，上述用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，还包括无菌水、缓冲液 bufferlOX、dNTPs，以及HS TaqJS Taq是热启动Taq DNA聚合酶。
[0034]优选地，上述用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，其中各成分用量为：
[0035]检测体系：
[0039] 本发明还提供了上述用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒的使用方法，包括以 下步骤：
[0040] (1)提取待检测外周血的DNA作为待检测样品，准备好突变型阳性对照和超纯水阴 性对照；
[0041 ] (2)待检测样品、阳性对照和阴性对照分别加入热启动Taq DNA聚合酶，混匀;混合 后的待检测样品、阳性对照和阴性对照三个样品，分别加入到检测体系和外控体系中，即每 个样品对应一个检测体系和一个外控体系;进行实时荧光定量PCR反应;收集FAM和J0E荧光 信号；
[0042] (3)检测结果判定：
[0043] 外控体系FAM信号Ct值需要满足：12^Ct<22;阳性对照的ACt需要满足:20<Λ Ct<26;阴性对照的Ct值需要满足:Ct>28;
[0044]然后按照以下标准进行结果判定：
[0046]其中，Λ Ct值=检测信号CT值-外控信号CT值，CT值是荧光信号值阈值下的PCR扩 增循环数。
[0047] 优选地，上述用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒的使用方法，荧光定量PCR反 应程序如下：
[0048] 第一阶段：95°C5min;
[0049] 第二阶段:951€2〇8,621€2〇8，15个循环；
[0050] 第三阶段：95°C20s，60°C40s，31个循环；
[00511信号收集:第三阶段60°C时收集FAM和J0E信号。
[0052]与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0053] 本发明从肿瘤患者的外周血游离DNA中，通过ARMS+Taqman+PNA联合技术设计的检 测试剂盒，可以高灵敏度、高准确性地检测到肿瘤组织各处来源的T790M异常基因，提供了 一种无创性肿瘤诊断的新方法，也为肿瘤早期诊断提供了新的希望。现有的EGFR多位点联 合qPCR方法检测试剂盒的灵敏度和精密度很难达到要求，而且大多EGFR多位点检测不能做 到T790M位点的单独分型。本发明是为T790M检测单独设计的检测组合，专为肺癌新药 Tagrisso对T790M突变患者治疗的用药指导。
【附图说明】
[0054]图1:实时荧光定量PCR反应程序示意图；
[0055] 图2:阴性样品实时荧光定量PCR反应结果分析图；
[0056] 图3:阳性样品实时荧光定量PCR反应结果分析图。
【具体实施方式】
[0057] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的 理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0058] 实施例1:临床样本处理
[0059] 本实施例是从非小细胞肺癌患者外周血中提取肿瘤游离DNA，具体详述如下。
[0060] 1、样本处理
[00611 (1)20位肿瘤患者，每位抽取5ml静脉血分别放入EDTA抗凝管中，这些患者是做过 石蜡包埋组织检测的，他们的T790M突变类型已知，做好标记4°C保存。需要在3小时内将外 周血进行离心分离出血浆。
[0062] (2)将抗凝血放于离心机中离心，离心条件为800g，lOmin，用移液器分别将最上层 的血浆层取到新的2ml EP管中，20份血浆做好标记放入-70°C保存。采用武汉海吉力生物科 技出品的ctDNA提取试剂盒提取DNA，提取到的DNA做好标记放-20冰箱°C保存。
[0063] 实施例2:游离DNA提取
[0064] 一、使用前准备：
[0065]需自备的试剂耗材有纯水、无水乙醇、1.5/5ml离心管。试剂中的1.5ml离心管专用 于收集步骤"6"的洗脱液。
[0066] 按照武汉海吉力生物科技出品的ctDNA提取试剂盒(含有Wl、W2、溶液GH，溶液TE， 和蛋白酶K，即Proteinase K)使用说明进行操作。
[0067]每瓶W1在首次使用前加入10ml无水乙醇（自备)并混匀;每瓶溶液W2在首次使用前 加入24ml无水乙醇（自备）并混匀；每管蛋白酶K首次使用前用550μ1纯水（自备）溶解后使 用。
[0068] 洗脱前加热溶液ΤΕ至60°C，有助于提高提取收率。
[0069]全部离心操作均在室温下进行。
[0070] 二、操作步骤
[0071] 1.将20份血浆样本分别吸取500~ΙΟΟΟμΙ，加入与血浆等体积的溶液GH，混匀。加 入 10μ1 Proteinase Κ，游祸混合lSsecJiO温育10min。
[0072] 2.加入与GH等体积的无水乙醇（自备），充分混匀。将混匀液全部移入套有收集管 的mini离心柱中。最高转速(>12000g)离心2min。小心取出离心柱（勿让离心柱碰到溶液）， 弃去收集管中废液，将离心柱放回收集管中。
[0073] 3.加550μ1溶液W1于离心柱中，最高转速(>12000g)离心lmin。取出离心柱然后弃 去离心管中废液，将离心柱放回收集管。
[0074] 4.加550μ1溶液W2于离心柱中，最高转速(>12000g)离心lOsec。取出离心柱然后弃 去离心管中废液，将离心柱放回收集管。
[0075] 5 ·最高转速(>12000g)离心 2min。
[0076] 6.将离心柱取出并放入试剂盒自带的1.5ml离心管中，加入50~100μΙ溶液TE，静 止2~3min，最高转速(>12000g)离心lmin，DNA溶液即被收集在1.5ml离心管中。
[0077] 7.定量:将提取的20份DNA用紫外分光光度计进行定量，调整DNA浓度到1~3ngAi 1〇
[0078]实施例3:实时荧光PCR法扩增临床样本DNA
[0079] 进行实验操作的PCR实验室应具有3个不同分区，分别为试剂准备间、样本提取间 和扩增间。
[0080] 试剂配制如下：
[0081] 1.检测体系：
[0084] 2.外控体系：
[0086] 实验过程如下：
[0087] (1)在试剂准备间取一支超纯水用于试剂检测的阴性对照，试剂按上表配好后分 装于8联PCR反应条中，每个反应孔为35μ1，一个检测孔和一个外控孔为一人份检测组，每条 8联PCR反应条可以检测4个人份。
[0088] (2)在样本制备间取出阳性对照，先解冻再混匀。然后将装好试剂的8联PCR反应 条、热启动Taq DNA聚合酶和阳性对照分别快速离心。
[0089] (3)在样本制备间分别取20份样本的游离DNA各10μ 1与1 μ 1的热启动Taq DNA聚合 酶在涡旋器上混匀。取超纯水阴性对照和阳性对照各1〇μ1，分别加入ΙμL热启动Taq DNA聚 合酶在涡旋器上混匀。
[0090] (4)轻轻揭开8联PCR反应条盖，将混好热启动Taq DNA聚合酶的样品、阴性对照和 阳性对照，加入到8联PCR条中。每个PCR反应孔加 5μ1。
[0091] (5)盖上8联PCR反应条盖，简单离心。
[0092] (6)将8联PCR反应条放入实时定量PCR仪中。
[0093] (7)设置PCR程序(参见图1):
[0094] 第一阶段：95°C5min;
[0095] 第二阶段：95 °C 20s，62 °C 20s，15个循环；
[0096] 第三阶段：95°C20s，60°C40s，31 个循环；
[0097]信号收集:第三阶段60°C时收集FAM和J0E信号。
[0098]经过80分钟后，得到荧光定量PCR的结果。阴性样品和阳性样品的结果分析参见图 2和图3。
[0099] (8)T790M突变检测结果分析
[0100]检测结果，外控体系FAM信号Ct值需要满足：12 < Ct<22;阳性对照的Act需要满 足：20<ACt<26;阴性对照的Ct值需要满足:Ct>28;如果上述这几项条件中有一项不符 合要求，需要重新做实验。
[0101]然后按照以下标准进行结果判定：
[0103] 其中，Λ Ct值=检测信号CT值-外控信号CT值，CT值是荧光信号值阈值下的PCR扩 增循环数。
[0104] 判定结果参见下表1。
[0105]表1结果数据统计
[0106]
[0107]以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范 围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明 的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1. 用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，其特征在于，包括检测体系，所述检测体系 包括突变型检测引物和探针、野生型特异结合的PNA序列，以及内控引物和探针； (1) 突变型检测引物和探针序列如下： 引物 T790-FY: CACCATGCGAAGCCACTCTGAC， 引物 T790-RY: GCCGAAGGGCATGAGCTACA， 探针 T790-PT: atgagctgcacggtggaggtgaggc; (2) 野生型特异结合的PNA序列如下： T790M-PNA：GAGCTGCGTGATGAGC； (3) 内控引物和探针序列如下： 引物 NK-FY: CACCATGCGAAGCCACTCTGAC， 引物 NK-RY: GCGATCATAATTCCTCTGCACATAGG， 探针 NK-PT: ccacctcacagttattgaacatcctctggagg; 探针序列的5'端结合荧光报告基团，3'端结合荧光淬灭基团，且突变型检测探针和内 控探针序列两端结合的荧光报告基团不同。2. 根据权利要求1所述的用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，其特征在于，突变型 检测探针结合的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQl;内控探针序列结合的荧光报告 基团为JOE，荧光淬灭基团为BHQl。3. 根据权利要求1或2所述的用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，其特征在于，还包 括外控体系，所述外控体系包括外控qPCR反应引物和探针，核苷酸序列为： 引物 WK-FY: CTTCCAGTTTGCCAAGGCACGAG， 引物 WK-RY: CCTCTGCACATAGGTAATTTCCAAATTC， 探针 WK-PT: ccacctcacagttattgaacatcctctggagg; 探针WK-PT的5'端结合荧光报告基团，3'端结合荧光淬灭基团，且荧光报告基团与内控 探针结合的荧光报告基团不同。4. 根据权利要求3所述的用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，其特征在于，探针WK-PT的5'端结合的荧光报告基团为FAM，3'端结合的荧光淬灭基团为BHQ1。5. 根据权利要求4所述的用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，其特征在于，还包括 无菌水、缓冲液buffer 10X、dNTPs，以及HS Taq。6. 根据权利要求5所述的用于检测EGFR基因 T790M突变的试剂盒，其特征在于，各成分 用量为： 检测体系： 试齐 IJ_____ 无菌水 一 658μ1 缓冲液 bufferlOX__IOX__280μ1_ dNTPs__2.5mM__105μ1_ 引物 T790-FY__l〇m__28μ1_ 引物 T790-RY__l〇m__28μ1_ 探针 Τ790-ΡΤ__l〇m__14μ1_ PNA序歹}J__l〇m__35μ1_ 引物NK-FY I ΙΟμΜ I 28μ1 引物 NK-RY__l〇m__28μ1_ 探针 NK-PT__l〇m__14μ1_ HSTaq__2 · 5UM__17.5μ1_ 外控体系:___ 试齐 IJ_____ 无囷水 一 742yl 缓冲液 bufferlOX__IOX__280μ1_ dNTPs__2.5mM__105μ1_ 引物 WK-FY__l〇m__28μ1_ 引物 WK-RY__l〇m__28μ1_ 探针 wK-ρτ__iom__?4μL_ HSTaq__2 · 5UM__17.5μ1_7. 权利要求6所述的用于检测EGFR基因 Τ790Μ突变的试剂盒的使用方法，其特征在于， 包括以下步骤： (1) 提取待检测外周血的DNA作为待检测样品，准备好突变型阳性对照和超纯水阴性对 昭. (2) 待检测样品、阳性对照和阴性对照分别加入热启动Taq DNA聚合酶，混匀;混合后的 待检测样品、阳性对照和阴性对照三个样品，分别加入到检测体系和外控体系中，即每个样 品对应一个检测体系和一个外控体系；进行实时荧光定量PCR反应;收集FAM和JOE荧光信 号； (3) 检测结果判定： 外控体系FAM信号Ct值需要满足：12 ^ Ct<22;阳性对照的ACt需要满足:20<ACt< 26;阴性对照的Ct值需要满足:Ct>28; 然后按照以下标准进行结果判定:__ 检测体系FAM信号Ct及ACt I结果判定 (^<29且厶(^<6___ Ct<29 且 6<ACt<10__IIPH_ Ct 2 29且 ACt 2 10或无值___ 其中，Λ Ct值=检测信号CT值-外控信号CT值，CT值是荧光信号值阈值下的PCR扩增循 环数。8. 根据权利要求7所述的用于检测EGFR基因 Τ790Μ突变的试剂盒的使用方法，其特征在 于，荧光定量PCR反应程序如下： 第一阶段:95°C5min; 第二阶段:95 °C 20s，62 °C 20s，15个循环； 第三阶段:951€2〇8,6〇1€4〇8,31个循环； 信号收集:第三阶段60 °C时收集FAM和JOE信号。
【文档编号】C12Q1/68GK105886648SQ201610393487
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】郭骁, 赵珊珊, 赵平锋
【申请人】武汉海吉力生物科技有限公司