紫薇矮化株型snp分子标记及应用

紫薇矮化株型snp分子标记及应用
【专利摘要】本发明涉及紫薇矮化株型SNP分子标记及应用。本发明利用SLAF?seq技术开发出3个紫薇株型SNP分子标记M16337、M25207和M38412，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1?3所示。将本发明的3个分子标记用于辅助选择育种，可以实现苗期提早选择，减少工作量，从而加快紫薇育种进程。
【专利说明】
紫薇矮化株型SNP分子标记及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及紫薇矮化株型SNP分 子标记及应用。
【背景技术】
[0002] 紫薇(Lagerstroemia indica)是我国的传统木本花丼，有1800多年的栽培历史 (张启翔，1991)，树姿优美、花色艳丽、花期极长，在园林中得到了广泛的应用。紫薇作为一 种优良观赏花木，在应用形式上较为单一，多以乔木状的大花紫薇和灌木状的紫薇品种为 主，迷你型的紫薇盆栽还有待开发。紫薇矮生品种成年植株高度仅30-60cm，因具有株型紧 凑、分枝多、节间短、花期长等优良特性，既可用作观花地被、绿蓠植物，也可用于盆栽观赏 而具有珍贵的科研价值和广阔的市场前景。但目前缺乏可以用于株高性状辅助选择的分子 记 D
[0003] Ye等（2015)利用AFLP和SSR分子标记技术对矮化性状进行定位，得到一个与矮化 基因遗传距离为23.33cM的AFLP标记，重组率超过10%，难以用于紫薇矮化分子标记辅助选 择育种。由于紫薇缺乏基因组信息，使用传统技术开发分子标记费时费力，定位的成功率 低。
[0004] SLAF_seq(Specific Length Amplified Fragment Sequencing)为分子标记的开 发提供了一条新思路，当与高通量测序技术相结合时，优势更为突出。鉴于其测序的准确 性，该技术在基因挖掘及高密度遗传图谱的构建中得到了广泛应用。本发明利用SLAF-seq 技术开发了一批特异性强、稳定性高的紫薇株型的SNP标记，为克隆矮化基因及进行分子标 记辅助选择育种提供重要基础。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供紫薇矮化株型SNP分子标记及应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明是以屋久岛紫薇为母本，紫薇品种'Pocomoke'为父 本杂交获得的142株分离群体为试材，构建株型正常/矮化基因池，开展紫薇矮化株型性状 分子标记的开发及标记辅助选择育种体系的建立。
[0007] 本发明提供的紫薇矮化株型SNP分子标记，包括3个SNP分子标记M16337、M25207和 M38412，它们的核苷酸序列分别如SEQIDN0:l-3所示。
[0008] 本发明还提供用于扩增所述分子标记的特异性PCR引物。
[0009] 标记M16337引物序列为：
[0010] 正向引物 W -CCGTGATAATAATGGTAG-3'
[0011] 反向引物：5' -ATGTGAGTCATTGTGGAT-3'
[0012] 标记M25207引物序列为：
[0013] 正向引物：5' -GTAGACAGACGTATACAGC-3'
[0014] 反向引物：57 -CGTTGACATTGCCAC-3'
[0015] 标记M38412引物序列为：
[0016] 正向引物：5' -GATGCCACCTGAAGTTATT-3'
[0017] 反向引物：5' -GATTTTCCGGCGACTC-3'
[0018] 本发明还提供所述分子标记在鉴定紫薇矮化株型中的应用，包括以下步骤：
[0019] 1)提取待测植株的基因组DNA;
[0020] 2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增所述分子标记的引物，进行PCR扩增 反应；
[0021] 3)检测PCR扩增产物。扩增产物进行Sanger测序，如果扩增产物相应SNP位点表现 杂合，则待测植株为紫薇正常株型，如果相应SNP位点表现纯合，则待测植株为矮化株型;其 中，对应于标记M16337的SNP位点，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位碱基，该处碱基为A 或G，对应于标记M25207的SNP位点，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位碱基，该处碱基为 T或C，对应于标记M38412的SNP位点，位于SEQ ID N0:3所示序列的第375位碱基，该处碱基 为C或T。
[0022] 步骤2)中PCR扩增体系为：100ngyL-1模板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix 12·5μ L，1 Ομπιο 1 L-1正、反向引物各0 · 6yL，ddH20 10 · 3yL; PCR反应程序为：94 °C预变性5min; 94 °C 变性30s，45°C-60°C (依引物而定)退火lmin，72°C延伸3〇8,35个循环;72°(：终延伸1〇11^11。
[0023] 本发明还提供用于AS-PCR扩增所述分子标记的ASP引物。
[0036]本发明还提供一种筛选或鉴定紫薇矮化株型的方法，所述方法包括以下步骤： [0037] 1)提取待测植株的基因组DNA;
[0038] 2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增所述分子标记的ASP引物，进行AS- PCR扩增反应；
[0039] 3)检测扩增产物。如果扩增产物相应SNP位点表现杂合，则待测植株为紫薇正常株 型，如果相应SNP位点表现纯合，则待测植株为矮化株型；其中，对应于标记M16337的SNP位 点，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位碱基，该处碱基为A或G，对应于标记M25207的SNP 位点，位于SEQ ID N0: 2所示序列的第412位碱基，该处碱基为T或C，对应于标记M38412的 SNP位点，位于SEQ ID N0:3所示序列的第375位碱基，该处碱基为C或T。
[0040]步骤2)中AS-PCR扩增体系为：lOOngyL-1模板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix 12.5yL，10ymol L-1 正向引物0.6yL，10ymol L-1 反向引物 1 或2 0.6yL，ddH20 10.3yL;PCR反 应程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，45°C_60°C (依引物而定）退火lmin，72°C延伸 30s，35个循环；72°C终延伸lOmin。
[0041] 本发明还提供含有所述特异性PCR和/或所述ASP引物的用于筛选或鉴定紫薇矮化 株型的检测试剂盒。
[0042] 本发明进一步提供所述分子标记在紫薇分子标记辅助育种中的应用。
[0043]本发明具有以下优点：
[0044](一）本发明利用SLAF-seq技术开发紫薇株型分子标记，其周期短、成本低、效率 高，可为在其他无参考基因组物种中开发特异性分子标记提供重要参考，也为分子育种、遗 传多样性、分子标记辅助选择育种提供了重要的开发途径。
[0045] (二)本发明获得的SNP分子标记在不同样本和不同群体中表现重复性好、扩增稳 定，不受环境条件的影响。
[0046] (三)本发明提供的ASP引物用于AS-PCR扩增反应，操作简单，能够克服紫薇不同基 因型鉴定的困难。
[0047] (四）将本发明筛选出的3个分子标记用于辅助选择育种，可以实现苗期提早选择， 减少工作量，从而加快紫薇育种进程。
【附图说明】
[0048]图1为本发明实施例4中标记則6337在？1群体中AS-PCR的扩增结果；其中，M: MarkerDL2000; 1-8:矮生个体;9-16:正常个体。
[0049]图2为本发明实施例4中标记1125207在？1群体中AS-PCR的扩增结果；其中，M: MarkerDL2000; 1-8:矮生个体;9-16:正常个体。
[0050]图3为本发明实施例4中标记138412在？!群体中AS-PCR的扩增结果；其中，M: MarkerDL2000; 1-8:矮生个体;9-16:正常个体。
[0051 ] 图4显示本发明实施例4中标记M16337在BC!群体中AS-PCR的扩增稳定性;其中，M: MarkerDL2000; 1 -6:矮生个体;7-12:正常个体。
[0052] 图5显示本发明实施例4中标记M25207在BC!群体中AS-PCR的扩增稳定性;其中，M: MarkerDL2000; 1 -6:矮生个体;7-12:正常个体。
[0053] 图6显示本发明实施例4中标记M38412在BC!群体中AS-PCR的扩增稳定性;其中，M: MarkerDL2000; 1 -6:矮生个体;7-12:正常个体。
[0054]图7显示本发明实施例4中标记在?:群体中辅助选择育种准确性;其中，a:单标记 的准确性;b:双标记组合的准确性。
[0055]图8显示本发明实施例4中标记在队:群体中辅助选择育种准确性;其中，a:单标记 的准确性;b:双标记组合的准确性。
【具体实施方式】
[0056]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0057]实施例1基于SLAF-seq技术开发紫薇株型性状分子标记 [0058] 1、实验材料
[0059] 供试材料包括母本屋久岛紫薇（L. fauriei )、父本紫薇'Pocomoke '（L. indica 'Pocomoke'）及以其为亲本杂交获得的142株?1株型分离群体。亲本在表型性状上差异显 著，母本乔木状，株型直立开展，叶片大，节间长，父本为低矮灌木，株型紧凑，叶片小，节间 短。此外，92株株型分离群体用于分子标记的验证。根据目标性状，于生长季结束（11月 份)后测定各群体后代的株型性状，以正常型实生苗的平均高度为对照，其1/2以下划分为 矮生型。所有材料均定植于国家花卉工程移栽技术研究中心北京小汤山实验基地（北炜 ，东经E115°50/ )。
[0060] 2、基因组DNA的提取
[00611随机选取？:群体中正常和矮生株型的单株各50株，提取DNA后等量混合分别构建 正常型和矮生型基因池。DNA提取按照新型植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限 公司）说明进行，制备1.0%琼脂糖凝胶，吸取3yL DNA混合约2yL加样缓冲液，电压90V，电泳 30min，检测是否有降解、RNA和蛋白质污染等问题。用NANO DR0P2000测定DNA浓度，并分析 其纯度，确保DNA浓度在lOOIOOngyL-1。
[0062] 3、紫薇株型性状分子标记的开发
[0063]利用酶切预测软件SLAF_PrediCt(北京百迈客生物科技有限公司）对紫薇基因组 进行系统分析，主要根据基因组的GC含量、重复序列情况和基因特点等信息，设计标记开发 方案，确定酶切组合、切胶范围及测序量等，以保证其分子标记开发的密度和均匀性，从而 确保达到预期的实验目的。
[0064]分别取亲本、正常型和矮生型基因池4个样品的DNA 500ng，加入限制性内切酶酶 切3h。反应结束后用Quick Spin column(Qiagen)纯化酶切产物，并用33yL EB回收。以回收 的酶切产物为模板进行PCR反应，反应体系为25yL，包括模板DNA 100ng，10 X PCR反应缓冲 液2.5yL，2.5mmolL-MNTP 的Taq DNA合成酶（NEB)0.3yL，10ymol I^Msel 引物2μ L，ddH20加至25yL。PCR产物经纯化后，加入Mse I、T4DNA连接酶、ATP及So 1 exa接头，37 °C反应 5h。纯化产物后2%琼脂糖电泳，用Gel Extraction Kit(Qiagen)回收电泳中300_500bp的 条带，并以其为模板，在含Phusion Master Mix(NEB)和Solexa引物混合物中进行PCR扩增， 扩增产物经纯化后用Illumina GAIIx(11 lumina，San Diego，CA，USA)测序。完成4个样品的 DNA测序，保证获得不低于50000个SLAF标签，标签整体平均深度达到120 X。利用软件SLAF-Poly.pl.(北京百迈客生物科技有限公司）对测序得到的reads数据进行评估和低质量过 滤，再利用比对软件BLAT将各样品有效数据进行相似度聚类，并通过深度识别，基因型纠错 后，得到有效的SLAF片段。
[0065] 利用SLAF-seq技术完成对样品的测序，共获得样品的有效reads为32.15M条，SLAF 标签79863个，整体平均深度197.9X，达到简化基因组的预期目标(表1)。
[0066]表1样品数据量统计
[0067]
[0068] 对筛选得到的Marker采用SNP-index关联方法进行检验分析，获得显著性差异标 记。Maa表示aa群体来源于Μ的深度;Paa表示aa群体来源于P的深度;Mab表示ab群体来源于Μ 的深度;Pab表示ab群体来源于Ρ的深度；
[0069] SNP-index(aa) =Maa/(Paa+Maa)
[0070] SNP-index(ab) =Mab/(Pab+Mab)
[0071 ] Delta(SNP-index)=SNP-index(ab)-SNP_index(aa)
[0072] 根据遗传连锁可以推测，如果该Marker与目标性状相关，则两个群体中的SNP-index都会显著偏离0.5(隐池中的SNP-index会接近于1)，〇6]^&(3即-;[11(161)会显著偏离0。 该Marker与目标性状相关性越高，Delta(SNP-index)偏离0的程度越大，即更接近1。选择 Delta(SNP-index)>0· 3的Marker为差异标记，即更可能与性状相关。
[0073] 实施例2根据紫薇株型差异性标记设计引物
[0074]利用SLAF-seq技术共获得紫薇矮化株型性状特异标签38个。根据测序结果，选择3 个Marker(M16337、M25207、M38412)利用Primer Premier5.0设计引物，引物序列见表2〇 [0075]表2用于Sanger测序的3对引物信息
[0076]
[0077] 随机挑选30株极端个体进行PCR扩增。PCR扩增体系25yL，含lOOngyL-1模板DNA 1μ L，2XTaq PCR Master Mix(艾德莱）12.5yL，10ymol L-1正向和反向引物（上海生工）各0·6μ L，ddH2〇 10·3μΙ^ΡΟ?程序为:94°C 预变性 5min;94°C 变性 30s，45°C-60°C (依引物而定)退火 lmin，72°C延伸3〇8,35个循环；72°(：终延伸1〇1^11。？0?产物纯化后直接进行3&1^64则序（北 京睿博兴科生物技术有限公司），将子代与亲本的结果进行对照，确定该标记含有真实的 SNP，且标记与目的性状的紧密关联。
[0078] 实施例3基于SLAF标记建立AS-PCR方法进行基因分型
[0079] 利用Sanger测序获得SLAF片段全长后（即标记M16337、M25207和M38412,核苷酸序 列分别如SEQ ID N0:1-3所示），对相应的SNP位点设计AS-PCR引物。引物设计时，在等位基 因特异性引物(ASP)的3'末端分别与SNP位点的两个碱基完全匹配，同时在特异性引物3'末 端的倒数第2或第3位置引入1个错配碱基，以此提高PCR的特异性及稳定性。AS-PCR操作过 程中需将两条ASP引物与其公用引物分别组对，在两个PCR管中对同一 DNA模板进行PCR扩 增。若样品中的等位位点与ASP引物的3'末端相匹配，便能进行有效扩增，反之则不能进行 有效扩增。
[0080] AS-PCR反应体系为25yL，含lOOngyL-1 模板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix(艾德 莱）12.5yL，1 Ομπιο 1 L-1正向和反向引物(上海生工)各0.6yL，ddH2〇 10.3yL。反应程序为:94 °(：预变性5!1^11;94°(：变性3〇8,45°(：-60°(：(依引物而定）退火11^11，72°(：延伸3〇8,35个循环 ； 72°C终延伸10min。扩增结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，统计各群体所有单株 的基因型。如果相应SNP位点表现杂合，则标志着样本材料为正常株型，如果相应SNP位点表 现纯合，则标志着样本材料为矮化株型。其中，对应于标记M16337的SNP位点，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位碱基，该处碱基为A或G，对应于标记M25207的SNP位点，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位碱基，该处碱基为T或C，对应于标记M38412的SNP位点，位于SEQ ID NO: 3所示序列的第375位碱基，该处碱基为C或T。
[0081 ]用于AS-PCR扩增的3对标记引物信息见表3。
[0082]表3用于AS-PCR扩增的3对引物信息
[0083]
[0084] 实施例4标记的准确性、稳定性、重复性检测
[0085] 用得到的3个标记組6337、]\125207、]\08412对？1群体142个单株进行43-?0財广增验 证，标记的鉴定结果见图7，发现准确率最高的为M25207，高达80%，其中各标记在矮化个体 中的成功率显著高于正常个体，M25207在矮化个体中准确率高达84%。同时利用标记组合 M16337+M25207进行表型鉴定时，成功率高达90%，且在矮生个体中达93%。由此可见，开发 的SNP标记可以用于紫薇Fi群体矮化株型性状的辅助选择育种中。
[0086] 获得的特异性分子标记是否稳定对其应用也是非常重要的，通过相同引物对不同 的分离群体进行扩增，如果能获得稳定的条带，说明开发的标记是稳定的，可用于紫薇不同 株型的鉴定。以92株群体为材料，验证所开发的SNP标记的稳定性及准确率。以M38412为 例，其在正常株型个体扩出两条带，为CT杂合，在矮化株型个体中扩出一条带，为CC纯合，说 明3个标记在群体中也能较好的鉴定不同的表型，具有很好的稳定性。3个标记在队:群体 中表型鉴定准确率略微下降，单标记M25207准确率为77%，双标记组合准确率为84% (图 8)。其中，图1-图3分别为标记組6337、]\125207和]\08412在?1群体中45-?0?的扩增结果。图4-图6分别显示标记M16337、M25207和M38412在BCi群体中AS-PCR的扩增稳定性。
[0087] 本发明建立的分子标记辅助选择育种可以实现苗期提早选择、减少工作量，大大 提高了紫薇株型的选择效率，从而加快育种进程。
[0088] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 [0089] 参考文献
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【主权项】
1. 紫薇矮化株型SNP分子标记，其特征在于，包括3个SNP分子标记M16337、M25207和 M38412,它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 1-3所示。2. 用于扩增权利要求1所述分子标记的特异性PCR引物，其特征在于， 标记M16337引物序列为： 正向引物:5' -CCGTGATAATAATGGTAG-3' 反向引物：5' -ATGTGAGTCATTGTGGAT-3' 标记M25207引物序列为： 正向引物：5' -GTAGACAGACGTATACAGC-3' 反向引物：5' -CGTTGACATTGCCAC-3' 标记M38412引物序列为： 正向引物：5' -GATGCCACCTGAAGTTATT-3' 反向引物：5' -GAITTTCCGGCGACTC-3'。3. 权利要求1所述分子标记在鉴定紫薇矮化株型中的应用，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 提取待测植株的基因组DNA; 2) 以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增所述分子标记的引物，进行PCR扩增反应； 其中，用于扩增所述分子标记的引物序列同权利要求2所述； 3) 检测PCR扩增产物，如果扩增产物相应SNP位点表现杂合，则待测植株为紫薇正常株 型，如果相应SNP位点表现纯合，则待测植株为矮化株型；其中，对应于标记M16337的SNP位 点，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位碱基，该处碱基为A或G，对应于标记M25207的SNP 位点，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位碱基，该处碱基为T或C，对应于标记M38412的 SNP位点，位于SEQ ID NO: 3所示序列的第375位碱基，该处碱基为C或T。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR扩增体系为=IOOngyI/1模板 DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix 12.5yL，10ymol L-1 正、反向引物各0.6yL，ddH20 10·3μ L;PCR 反应程序为:94°C 预变性 5min;94°C 变性 30s，45°C-60°C 退火 lmin，72°C 延伸 30s，35 个 循环;72 °C终延伸I Omin。5. 用于AS-PCR扩增权利要求1所述分子标记的ASP引物，其特征在于， 标记M16337引物序列为： 正向引物：5' -TCCCGTGGCTCTAACCTCT-3' 反向引物1:5' -TCTTGAACCATTTTTTTCCCT-3' 反向引物2:5' -TCTTGAACCATTTTTTTCCCC-3' 标记M25207引物序列为： 正向引物:5' -TAGAACAAGACTCGGAAAA-3, 反向引物1:5' -CGCACATCGTACGTAAAA-3' 反向引物2:5' -CGCACATCGTACGTAAAG-3' 标记M38412引物序列为： 正向引物:5' -CCAACGAGCAGCATCCAAAG-3' 反向引物1:5' -GGCGACTCGAACTTCTCCG-3' 反向引物2:5' -GGCGACTCGAACTTCTCCA-3'。6. -种筛选或鉴定紫薇矮化株型的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取待测植株的基因组DNA; 2) 以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增权利要求1所述分子标记的ASP引物，进行 AS-PCR扩增反应； 其中，用于扩增所述分子标记的ASP引物序列同权利要求5所述； 3) 检测扩增产物，如果扩增产物相应SNP位点表现杂合，则待测植株为紫薇正常株型， 如果相应SNP位点表现纯合，则待测植株为矮化株型；其中，对应于标记M16337的SNP位点， 位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位碱基，该处碱基为A或G，对应于标记M25207的SNP位 点，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位碱基，该处碱基为T或C，对应于标记M38412的SNP 位点，位于SEQ ID NO: 3所示序列的第375位碱基，该处碱基为C或T。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中AS-PCR扩增体系为：IOOngyI/1模 板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mixl2.5yL，10ymol L-1 正向引物0.6yL，10ymol L-1 反向引 物 1 或2 0.6yL，ddH20 10.3yL;PCR反应程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，45°C-60°C 退火lmin，72°C延伸3〇8,35个循环;72°(：终延伸1〇11^11。8. 含有权利要求2和/或权利要求5所述引物的用于筛选或鉴定紫薇矮化株型的检测试 剂盒。9. 权利要求1所述分子标记在紫薇分子标记辅助育种中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK105886640SQ201610326992
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】潘会堂, 叶远俊, 张启翔, 蔡明 , 程堂仁, 王佳, 鞠易倩, 焦垚, 冯露
【申请人】北京林业大学