一种温和气单胞菌特异性引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用
【专利摘要】本发明涉及一种温和气单胞菌特异性引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用。本发明所提供的温和气单胞菌特异性引物由上游引物F：GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA和下游引物R：TACGTACAGATCCCCAGCCC构成。本发明设计的温和气单胞菌特异性引物，能有效从各常见致病菌株中区分出温和气单胞菌，表现出很强的特异性和灵敏性。本发明所提供的在大菱鲆养殖过程中温和气单胞菌的PCR检测方法，使得养殖过程中温和气单胞菌的检测更为简便，为今后大菱鲆养殖过程中高发致病菌的检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系为促进我国养殖产业的规模化健康发展奠定了基础。
【专利说明】
一种温和气单胞菌特异性引物及其在大菱鲆养殖过程中的 应用
技术领域
[0001] 本发明属于病原微生物检测领域，具体涉及一种大菱鲆养殖过程中常见的致病 菌:温和气单胞菌(Aeromonas sobria)的PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 有"多宝鱼"之称的大菱鲆已被引进我国长达10年之久，凭借其优良的苗种，先进 的创新模式和工业化养殖的潮流，逐渐成为全国引人注目的重要养鱼工业。这一全新产业 的发展，对我国的水产经济拉动均有很大作用，并为我国北方沿海城市工业化养鱼的纵向 发展奠定了雄厚的理论和实践基础。然而随着养殖规模的快速增长，养殖密度的增加，以及 水体环境的恶化，一系列的疾病也随之而来。近年来在大菱鲆养殖过程中细菌性疾病的急 剧爆发严重影响并制约了我国大菱鲆养殖产业的健康发展，给养殖户带来了巨大的经济损 失。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种对温和气单胞菌具有特异性强且灵敏性高的特异性引 物。
[0004] 本发明的另一目的是提供一种在大菱鲆养殖过程中，可快速鉴定致病源，为养殖 户挽回经济损失的大菱鲆养殖过程中温和气单胞菌的PCR检测方法。
[0005] 本发明采用的技术方案是：一种温和气单胞菌特异性引物，所述的温和气单胞菌 特异性引物由上游引物F和下游引物R构成；
[0006] 所述的上游引物F的序列为:GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA;
[0007] 所述的下游引物R的序列为:TACGTACAGATCCCCAGCCC
[0008] 优选的，上述的一种温和气单胞菌特异性引物，所述的温和气单胞菌为Aeromonas sobria〇
[0009] -种大菱鲆养殖过程中温和气单胞菌的PCR检测方法，方法如下：
[0010] 1)提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA;
[0011] 2)以所提取的DNA为模板，采用上述的温和气单胞菌特异性引物，进行PCR扩增；
[0012] 3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断大菱鲆是否被温和气单胞菌感 染;如果琼脂糖凝胶呈现结果有486bp条带产生，则大菱鲆被温和气单胞菌感染，否则没有 被感染风险。
[0013] 上述的一种大菱鲆养殖过程中温和气单胞菌的PCR检测方法：
[0015] PCR反应条件:第一阶段:94°Clmin;
[0016] 第二阶段：94°C 30s，60 °C lmin，72 °C 30s; 30 循环；
[0017] 第三阶段:72°C2min;
[0018] 第四阶段:4°C保存。
[0019] 本发明的有益效果是：
[0020] 1.本发明，设计的温和气单胞菌特异性引物，能有效从各常见致病菌株中区分出 温和气单胞菌，表现出很强的特异性。
[0021] 2.本发明，设计的温和气单胞菌特异性引物，灵敏性高，可有效检出养殖过程中的 温和气单胞菌，其最低检测浓度可达到l〇_4ng/ul。
[0022] 3.本发明，所提供的在大菱鲆养殖过程中温和气单胞菌的PCR检测方法，使得养殖 过程中温和气单胞菌的检测更为简便。在大菱鲆养殖过程中，一旦有被温和气单胞菌感染 的风险，即能够做到快速鉴定致病源，为养殖户挽回大量损失。本发明的检测方法可有效检 出大菱鲆养殖过程中的高危致病菌温和气单胞菌，经验证此检测方法特异性强，灵敏度高。 该检测方法的确立为今后大菱鲆养殖过程中高发致病菌的检测和分析提供了必要的理论 依据和完善的方法体系，不仅为今后大菱鲆养殖产业的健康发展做出了贡献，同时为促进 我国养殖产业的规模化健康发展奠定了基础。
【附图说明】
[0023] 图1是温和气单胞菌特异性引物S的PCR反应条件优化；
[0024] 其中，M:Marker DL2000，l-6:退火温度分别为55,56,57,58,59,6(TC。
[0025] 图2是温和气单胞菌特异性引物S的特异性验证；
[0026] 其中，1 · Aeromonas bi val vium；2.Aeromonas caviae；3-4.Aeromonas hydrophila；
[0027] 5.Aeromonas jandaei；6.Aeromonas salmonicida；7.Aeromonas schubertii；
[0028] 8.Aeromonas sobria；9.Aeromonas veronii；10.Pseudomonas aeruginosa；
[0029] 11.Pseudomonas fragi；12.Pseudomonas gessardii；
[0030] 13.Pseudomonas helmanticensis；14.Pseudomonas kilonensis；
[0031 ] 15. Pseudomonas marginalis；16.Vibrio alginolyticus；17.Vibrio cyclitrophicus；
[0032] 18.Vibrio gigantis；M:Marker DL2000〇
[0033] 图3是温和气单胞菌特异性引物S的PCR反应灵敏性验证。
[0034] 其中，M:Marker DL2000，l-5:模板浓度分别为 10°，10-SlO-2，10-3，10-4ng/ul。
【具体实施方式】
[0035] 下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
[0036] 实施例1 一种温和气单胞菌特异性引物 [0037](一)温和气单胞菌特异性引物的设计
[0038] 本实施例针对菌种温和气单胞菌(Aeromonas sobria)的dnaj基因，利用MEGA6软 件，设计出对温和气单胞菌(Aeromonas sobria)具有特异性强且灵敏性高的一对特异性引 物S，该温和气单胞菌特异性引物的具体信息如表1所示。
[0039] 表 1
[0040]
[0041 ](二)温和气单胞菌特异性引物最佳PCR反应条件的探索 [0042] 1、待试菌株DNA的提取
[0043] 使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒（细菌），提取温和气单胞菌（Aeromonas sobria)菌种的DNA，具体步骤如下：
[0044] 1.1)取lml过夜培养的含有菌种温和气单胞菌(Aeromonas sobria)的菌液，加入 1.5ml离心管中，室温8000rmp离心lmin，弃上清，收集菌体，加入180ul Buffer Digestion， 再加入20ul Proteinase K溶液，震荡混匀。56°C水浴lh至细胞完全裂解。水浴过程中，每10 分钟颠倒混匀一次，促进细胞裂解。
[0045] 1.2)加入200ul Buffer BD，充分颠倒混匀。加入Buffer BD后，如有沉淀产生，可 70 °C水浴10分钟。
[0046] 1.3)加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能产生半透明纤维 状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。
[0047] 1.4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤1.3)获得的溶液和半透明纤维状悬 浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温离心lmin，倒掉收集管中的废液。
[0048] 1.5)将吸附柱放回收集管，加入500ul PW Solution，10000rmp离心30s，倒掉滤 液。
[0049] 1.6)将吸附柱放回收集管，加入500ul Wash Solution，10000rmp离心30s，倒掉滤 液。
[0050] 1.7)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室温离心2min，弃去残留的Wash Solution。将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的Wash Solution，Wash Solution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。
[0051 ] 1.8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50-100ul CE Buffer静置 3min，12000rmp室温离心2min，收集DNA溶液，即为温和气单胞菌（Aeromonas sobria)的 DNA。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20 °C保存。
[0052] 2、温和气单胞菌特异性引物最佳退火温度的探索
[0053]以温和气单胞菌的DNA为模板做PCR扩增，并将目的引物的退火温度范围分别设置 为55-60°C，PCR扩增产物在2%琼脂糖lXTAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系 统观察并摄影记录，根据PCR后的凝胶电泳结果确定各引物最佳退火温度。具体PCR反应条 件和体系如表2所示，结果如图1。
[0054]表2目的引物最佳PCR反应探索条件 [0055]
[0056]由图1可见，在温度为55-5%~时，虽然特异性引物S与目的菌株有特异性目的条带 产生，但同时也有不明显非特异性条带产生，但将温度提升至60°C时，非特异性条带消失， 故确定最佳退火温度为60 °C。
[0057](三)温和气单胞菌特异性引物的特异性探索 [0058] 1、待试菌株DNA的提取
[0059]使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒（细菌），分别提取如表3所示的不同菌种的 DNA，具体步骤如上述(二）中步骤1。
[0060] 2、特异性探索
[0061 ]分别以表3中，不同菌种的DNA为模板做PCR扩增，具体PCR反应条件和体系如表4所 示，PCR后的凝胶电泳结果如图2所示。
[0062] 表3待试菌株如下：
[0064] 表4目的引物最佳PCR反应条件
[0065]
[0066] 由图2可见，该特异性引物在气单胞菌属内，以及假单胞菌和弧菌属内均表现出很 强的特异性，只能和目的菌株温和气单胞菌(Aeromonas sobria)产生特异性扩增，而未和 非目的菌株产生特异性扩增。故可见其表现出很强的特异性。
[0067] (四)温和气单胞菌特异性引物的灵敏性的探索 [0068] 1、待试菌株DNA的提取
[0069] 使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒（细菌），提取温和气单胞菌（Aeromonas sobria)菌种的DNA，具体步骤如上述(二）中步骤1。
[0070] 2、灵敏性的探索
[0071] 将温和气单胞菌的DNA浓度调至10ng/ul，并且依次稀释为10°、10-1、10-2、10- 3、10- 4ng/ul，分别取2ul DNA作为PCR反应模板，具体PCR反应条件和体系如表5所示，PCR后的凝 胶电泳结果如图3所示。
[0072]表5目的引物最佳PCR反应探索条件
[0073]
[0074]由图3可见，该引物在温和气单胞菌DNA浓度为10Q、10-\10-2、10- 3、10-4ng/ul时均 可产生特异性扩增，其最低检测浓度可达到l(T4ng/Ul。
[0075] 实施例2-种大菱鲆养殖过程中温和气单胞菌的PCR检测方法
[0076] 方法如下：
[0077] 1、提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA;
[0078]将其病灶处组织用lml无菌水反复冲洗，至少三次，然后收集液体，使用Ezup柱氏 基因组DNA抽提试剂盒(细菌），提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA，具体步骤如上述实例1中 (二)的步骤1。
[0079] 2、以DNA为模板，采用实施例1所述的温和气单胞菌特异性引物，利用PCR方法扩 增，得到PCR产物；
[0080]上游引物F: GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA [0081 ]下游引物R: TACGTACAGATCCCCAGCCC
[0083] PCR反应条件:第一阶段:94°Clmin;
[0084] 第二阶段：94°C 30s，60 °C lmin，72 °C 30s; 30 循环；
[0085] 第三阶段：72°C2min;
[0086] 第四阶段:4°C保存。
[0087] 3、PCR扩增产物在2%琼脂糖1 X TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系 统观察并摄影记录。
[0088] 4、判断标准:根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断大菱鲆是否被温和气 单胞菌感染;如果琼脂糖凝胶呈现结果有486bp条带产生，则大菱鲆被温和气单胞菌感染， 否则没有被感染。
[0089]验证:制作感染温和气单胞菌的大菱鲆模型，然后对该特异性引物进行多次测试， 测试结果表明使用该引物进行温和气单胞菌结果准确性高;其中感染温和气单胞菌的18尾 大菱鲆检测率为100%，未感染温和气单胞就的12尾大菱鲆的未检出率也为100%，综上所 述，该特异性引物可准确检出温和气单胞菌，检测结果准确率达到100%。
【主权项】
1. 一种温和气单胞菌特异性引物，其特征在于:所述的温和气单胞菌特异性引物由上 游引物F和下游引物R构成； 所述的上游引物F的序列为:GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA; 所述的下游引物R的序列为:TACGTACAGATCCCCAGCCC。2. 根据权利要求1所述的一种温和气单胞菌特异性引物，其特征在于:所述的温和气单 胞菌是Aeromonas sobria。3. 权利要求1或2所述的温和气单胞菌特异性引物在大菱鲆养殖过程中的应用。4. 一种大菱鲆养殖过程中温和气单胞菌的PCR检测方法，其特征在于方法如下： 1) 提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA; 2) 以所提取的DNA为模板，采用权利要求1或2所述的温和气单胞菌特异性引物，进行 PCR扩增； 3) 根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断大菱鲆是否被温和气单胞菌感染;如 果琼脂糖凝胶呈现结果有486bp条带产生，则大菱鲆被温和气单胞菌感染，否则没有被感 染。5. 根据权利要求4所述的一种大菱鲆养殖过程中温和气单胞菌的PCR检测方法，其特征 在 于:PCR反应体系为?： 25μL体系：Estaq 12.5ul 上游引物F Iul 下游引物R Iul 样品DNA 2ul ddH：0 S 5ul； PCR反应条件:第一阶段:94 °C Imin; 第二阶段:94 °C 30s，60 °C Imin，72 °C 30s; 30 循环； 第三阶段:72°C2min; 第四阶段:4°C保存。
【文档编号】C12Q1/04GK105886637SQ201610311622
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】刘宏生, 顾颖, 张新刚, 张力, 赵健
【申请人】辽宁大学