水稻抗稻瘟病基因Pi35内特异SNP共显性分子标记引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻抗稻瘟病基因Pi35内特异SNP共显性分子标记引物，属于植物分子育种领域。本标记引物其序列分别为：Pi35?PF：GCGTACAGCGTTCGCTCTATA；Pi35?PR：CTTCAAAAGCTCACAACCA；Pi35?NR：CTGCAAAACAAAGGAAACGTG；Pi35?NF：CCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATAAGG。本发明利用该引物对水稻DNA进行PCR扩增，可快速判断待测水稻Pi35的基因型，方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pi35基因型鉴定。
【专利说明】
水稻抗稻痘病基因 Pi 35内特异SNP共显性分子标巧引物
技术领域
[0001] 本发明属于植物分子育种领域，设及一种水稻抗稻攝病基因Pi35内特异SNP共显 性分子标记引物，适用于在水稻育种中对Pi35基因型的大量筛选W及从水稻种质资源中筛 选新的Pi35基因型抗性亲本。
【背景技术】
[0002] 水稻是我国重要的粮食作物，稻攝病是我国稻作区最严重的的病害之一，严重影 响稻谷产量和质量。利用抗病基因培育抗病水稻品种是控制水稻稻攝病最经济和有效的方 式。由于稻攝病生理小种变异很快，含有单一抗性基因的抗性品种长期使用便会因为稻攝 病菌新的优势种群的出现而抗性渐失；因此，利用分子标记辅助选择组装、聚合具有不同抗 谱的抗性基因，培育广谱、持久抗性水稻品种成为解决问题的最佳途径。
[0003] Pi35位于水稻1号染色体，供体亲本来源于日本梗稻品种化kkai 188(Nguyen等， 2006)，携带Pi35基因的化化ai 188(北海188)和化kei 138(藤系138)是日本水稻育种的骨 干抗源，抗叶攝水平高且稳定，因此Pi35对于培育具有稻攝抗性的水稻品种具有巨大的利 用价值。
[0004] 分子标记是一种快速、简便、成本低廉并可在水稻生长早期进行无损检测的一种 技术，利用分子标记辅助选择培育具有稻攝抗性的水稻品种是抵抗水稻稻攝病的有效方 法;但目前还没有对Pi35基因内特异性共显性分子标记的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种水稻抗稻攝病基因Pi35内特异SNP共显性分子标记引 物；引物特异性好，扩增效率高，可用于水稻抗稻攝病基因Pi35的基因型鉴定。
[0006] 本发明的另一个目的是提供水稻抗稻攝病基因 Pi35特异SNP共显性分子标记引物 的应用；利用该引物可W有效对抗稻攝病基因 Pi35进行基因型选择，既可W用于水稻资源 的筛选鉴定，又可W用于水稻抗稻攝病基因 Pi35的分子育种。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用W下技术方案 通过对Pi35来源材料的Pi35编码区的等位基因进行了 PCR扩增、等位基因重测序，最终 在Pi35基因编码区3780T位点获得一个Pi35特异性SNP位点，Pi35等位基因型为T碱基，其余 基因型均为G碱基，在两对交叉引物PCR(PCR with confronting two-pair primersJCR- CTPP)方法的基础上加W改进创新，通过在内引物倒数第=位引入错配碱基，开发出鉴定该 SNP位点不同碱基类型的共显性标记，如图1所示;通过设计4条引物(PF ^3、^、^)并利用 待测品种基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增条带类型鉴定Pi35基因型，纯合Pi35基因型扩 增出535bp和317bp条带，其余等位基因类型扩增条带为53化P和266bp条带，杂合型的扩增 条带为53化p、317bp和266bp条带。因此该方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记 辅助选择育种或者水稻种质资源Pi35基因型鉴定。
[000引一、引物 对Pi35来源材料的Pi35编码区的等位基因进行了 PCR扩增、等位基因重测序，将获得序 列首先与包含感病等位基因的材料日本晴及9311的对应序列进行比对，对于具有差异序列 的位点再利用包含其余3个等位基因的材料进行测序比对确认，最终在Pi35基因3780T处获 得一个Pi35特异性SNP位点，Pi35等位基因型为T碱基，其余基因型均为G碱基；因此，通过设 计特异性引物对该SNP位点特异性扩增即可实现Pi35等位基因的鉴定。
[0009]引物设计原理如下（图1): 在设计T型等位基因鉴定引物时，根据PCR-CTPP方法原理，首先在该SNP位点上游设计 正向引物PF(表1)，W该SNP位点的T碱基的互补碱基A作为3'端在该位点设计反向引物PR, PR的3'端的A碱基与T型等位基因材料正常结合扩增而与G型材料形成A/G错配无法扩增；同 理，按照上述思路开发出扩增G型等位基因材料的NF与NR，实验结果表明NF与NR在T型材料 中也有较微弱的扩增，因此为增强该引物特异性我们在NF的倒数第S位引入了一个错配碱 基A增强其特异性，结果表明该引物只有与G型等位基因材料扩增时有一条266bp条带，与T 型材料没有条带扩增;4条引物名称、序列及扩增片段长度见表1所示。
[0010]水稻抗稻攝病基因Pi35基因内特异SNP共显性分子标记引物，其序列分别为： Pi35-PF：GCGTACAGCGTTCGCTCTATA； P i 3 5-PR：CTTCAAAAGCTCACAACCA； P i 3 5-NR：CTGCAAAACAAAGGAAACGTG； P i 3 5-NF:CCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATAAGG。 二、鉴定 对水稻DNA进行PCR扩增； 纯合Pi35基因型扩增出53加P和317bp条带，其余等位基因类型扩增条带为53化P和 266bp条带，杂合型的扩增条带为53化P、31化P和26化P条带。
[001" S、应用 1、在水稻抗稻攝病基因分子育种中的应用。
[0012] 2、在水稻资源的筛选鉴定中的应用。
[0013] 水稻抗稻攝病基因Pi35基因内特异SNP共显性分子标记引物的应用，包括利用常 规方式对水稻DNA进行PCR扩增，通过对扩增条带进行判断，用于水稻资源的筛选鉴定或水 稻抗稻攝病基因Pi35的分子育种。
[0014] W上所述的方案中，优选的，引物PF、PR、NF与NR按1:1:1:1混合扩增，退火溫度为 55 °C。
[0015] W上所述的方案中，扩增条带的判断方式为：SNP位点为T碱基的Pi35型等位基因 材料扩增出53加P和317bp 2条条带，SNP位点为G碱基的其他型等位基因材料扩增出53加P 和26化P 2条条带，TG杂合型则扩增出53化p、31化P和26化P的3条条带。
[0016] 表1引物序列
与现有技术相比，本发明具有W下优点： ① 本引物对Pi35来源材料的Pi35编码区的等位基因进行了 PCR扩增、等位基因重测序， 最终在Pi35基因3780T处获得一个Pi35特异性SNP位点，Pi35等位基因型为T碱基，其余基 因型均为G碱基； ② 与传统的利用接种不同的稻攝病生理小种鉴定稻攝病抗性等位基因不同，本发明在 PCR-CTPP方法的基础上加W改进，利用目标基因内SNP位点开发出仅利用PCR电泳技术即可 鉴定亲本及F2子代Pi35基因型的特异共显性分子标记； ③ 与其它标记相比，本发明提供的Pi35基因内特异性共显性SNP分子标记可W直接通 过鉴定PCR产物判定目标材料的基因型，无需酶切，检测准确率100%，不仅可W判断目标材 料是否含有Pi35基因，还可W检测出目标材料的基因型是杂合还是纯合； ④ 在利用Pi35基因对水稻稻攝病抗性进行改良时，分子标记辅助选择(MAS)在回交过 程中成为一种最直接、有效的筛选工具，利用本发明的方法可准确实现子代基因型检测，筛 选携带目的基因的个体连续回交后自交纯合从而完成品种改良；因此，该方法具有简单、准 确、成本低并可W在水稻生长早期进行非破坏性检测等一系列优点，适于在育种中对Pi35 基因型的大量筛选W及对于水稻种质资源中Pi35等位基因型鉴定。
[0017]总之，本发明利用该引物对水稻DNA进行PCR扩增，可快速判断待测水稻Pi35的基 因型，方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源 Pi35基因型鉴定。
【附图说明】
[001引图1是利用两对交叉引物PCR扩增(PCR-CTPP)方法对水稻Pi35基因内特异SNP位点 扩增示意图。
[0019] 图2是利用本发明设计的引物对巧帕i35基因型DNA模板扩增的电泳图， M:DL2000 DNA marker,其中： 泳道1为SNP位点为纯合T碱基，含有Pi 35基因的亲本材料化ke i 138 (藤系138 ); 泳道2为SNP位点为TG杂合型碱基，由化kei 138(藤系138)与9311杂交获得的Fi代材 料； 泳道3为SNP位点为纯合G碱基，含有Pi35的感病等位基因亲本材料9311。
[0020] 图3是利用本发明设计的引物检测生产上常用的水稻骨干亲本的电泳图， M:DL2000 DNA marker,其中： 泳道I为含有Pi35基因的亲本材料化kei 138(藤系138); 泳道2为化kei 138(藤系138)与9311杂交获得的Fi代材料； 泳道3为含有Pi35的感病等位基因亲本材料9311; 泳道4-16分别为生产上常用骨干亲本:培矮64S、广占63S、皿9802S、明恢63、中国香稻、 日本晴、桂朝2号、黄华占、Lemont、HPl 21、超级己斯玛蒂、盐稻4号、Rl 128。
【具体实施方式】
[0021] 本实施例中未特别说明的实验方法即为分子生物学常规方法。本研究所用 Taq酶及dNTP产自北京全式金生物技术有限公司，其余均为常规生化试剂。
[0022] 1、实施例1: 利用本发明设计的引物对巧中Pi35基因型DNA模板扩增 1)生物材料 TT型材料为含有Pi35基因的亲本材料化kei 138(藤系138);GG型材料为含有感病等位 基因的亲本材料9311 ;TG型材料为化kei 138(藤系138)与9311杂交获得的Fi代材料。
[0023] 2)水稻DNA提取及引物合成 CTAB方法提取上述材料的DNA，合成表1所示的引物序列，具体为： Pi35-PF：GCGTACAGCGTTCGCTCTATA； P i 3 5-PR：CTTCAAAAGCTCACAACCA； Pi35-NF：CCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATAAGG； P i 3 5-NR：CTGCAAAACAAAGGAAACGTG； 3)PCR PCR反应体系为 15化，含 1.5化 lOXBuffera.OyL dNTPsQO mmol/L), 4条引物PF、 PR、NF与NR各为0.1 yM; Taq酶0 . (抓/yL)，1.0 yL模板DNA( 50ng/yL)，其余用d地2〇补齐； PCR反应程序:94°C预变性5min; 94 °C变性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸40s，共35个循环;72 °C延伸5min，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
[0024] 4、结果分析 1泳道为SNP位点为纯合T碱基的Pi35型材料，利用本发明标记扩增结果显示有53化P和 317bp 2条条带，3泳道为SNP位点为纯合G碱基的材料扩增出53加P和266bp 2条条带，2泳 道为SNP位点为TG杂合型的材料则扩增出53化p、317bp和266bp 3条条带。该结果表明，我们 设计的标记对不同基因型材料扩增时条带清晰（图2)。
[0025] 2、实施例2 利用本发明设计的引物检测生产上常用的水稻骨干亲本。
[0026] 1)生物材料 亲本对照为含有Pi35基因的亲本材料化kei 138(藤系138);含有感病等位基因的亲本 材料9311;Fukei 138(藤系138)与9311杂交获得的Fl代材料。骨干亲本材料：培矮64S、广 占63S、HD9802S、明恢63、中国香稻、日本晴、桂朝2号、黄华占、Lemont、册121、超级己斯玛 蒂、盐稻4号、R1128等13个，CTAB方法提取上述材料的DNA。
[0027] 2)PCR PCR反应体系为 15化，含 1.5化 IOXBuffera.OyL dNTPsQO mmol/L), 4条引物PF、 PR、NF与NR各为O. IyM; hq酶O . ^U5U/yL)，1.0 yL模板DNA巧Ong/yL)，其余用ddH20补齐； PCR反应程序:94°C预变性5min; 94 °C变性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸40s，共35个循环;72 °C延伸5min，扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。
[0028] 3)结果分析 利用本发明的Pi35基因内特异共显性标记鉴定含有不同等位基因的材料表明，Pi35纯 合子类型材料具有53化P和317bp 2条条带，含有纯合感病基因的材料扩增出53化P和266bp 2条条带，Pi35杂合型的材料则扩增出53加p、317bp和266bp 3条条带，因此该标记可W将 Pi35抗性基因和其余常用亲本的感病等位基因区分开。如图3所示，泳道1为含有Pi35基因 的亲本材料化kei 138(藤系138);泳道3为含有感病等位基因的亲本材料9311;泳道2为 Fuke i 138 (藤系138 )与9311杂交获得的Fi代材料。泳道4-16对应亲本材料依次分别为:培 矮64S、广占63S、皿9802S、明恢63、中国香稻、日本晴、桂朝2号、黄华占、Lemont、HP121、超级 己斯玛蒂、盐稻4号、R1128。图3结果表明，泳道4-16所鉴定的水稻其SNP位点的基因型均为G 型，判断其为感病等位基因型，均与实际相符。
[0029] 本实施例中的应用过程，可用于有效的对抗稻攝病基因 Pi35进行基因型选择，既 可W用于水稻资源的筛选鉴定，又可W用于水稻抗稻攝病基因 Pi35的分子育种。
[0030] 序列表 <110〉湖北省农业科学院粮食作物研究所 <120〉水稻抗稻攝病基因Pi35内特异SNP共显性分子标记引物 <140〉 <141〉 <160〉 4 <210〉 1 <211〉 21 <212〉DNA-引物序列 <400〉 Pi35-PF:GCGTACAGCGTTCGCTCTATA; <210〉 2 <211〉 19 <212〉DNA-引物序列 <400〉Pi35-PR:CTTCAAAAGCTCACAACCA; <210〉 3 <211〉 30 <212〉DNA-引物序列 <400> Pi35-NF：CCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATAAGG； <210〉 4 <211〉 21 <212〉DNA-引物序列 <400〉 Pi35-NR:CTGCAAAACAAAGGAAACGTG。
【主权项】
1. 一种水稻抗稻瘟病基因 Pi35内特异SNP共显性分子标记引物，其特征在于其序列包 括： Pi35-PF：GCGTACAGCGTTCGCTCTATA； Pi 35-PR：CTTCAAAAGCTCACAACCA； Pi 35-NR：CTGCAAAACAAAGGAAACGTG； Pi 35-NF:CCGTCCTCCCTCCAGCATATATGTATAAGG。2. 利用权利要求1所述标记引物的序列对水稻抗稻瘟病基因 Pi35的鉴定方法，其特征 在于： 对水稻DNA进行PCR扩增； 纯合Pi35基因型扩增出535bp和317bp条带，其余等位基因类型扩增条带为535bp和 266bp条带，杂合型的扩增条带为535bp、317bp和266bp条带。3. 按权利要求1所述的引物在水稻抗稻瘟病基因分子育种中的应用。4. 按权利要求1所述的引物在水稻资源的筛选鉴定中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105925575SQ201610519850
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】徐华山, 游艾青, 周雷, 刘凯, 闸雯俊, 李三和, 杨国才, 陈志军, 李培德, 蒋医蔚, 方国成
【申请人】湖北省农业科学院粮食作物研究所