用于检测AEDs引起的SJS/TEN的引物、试剂盒及方法与流程

本发明涉及基因工程
技术领域：
，具体涉及用于检测AEDs引起的SJS/TEN的引物、试剂盒及方法。
背景技术：
：芳香族抗癫痫药物(aromaticantiepilepticdrugs，AEDs)是引起皮肤型不良反应(cutaneousadversedrugreactions，cADRs)的常见因素之一。cADRs包括轻度的斑丘疹(maculopapularexanthema，MPE)，以及严重危及生命的皮肤反应(severecutaneousreaction，SCR)，如Stevens-Johnson综合症(SJS)，中毒性表皮坏死松解症(toxicepidermalnecrolysis，TEN)及药物超敏综合症(drughypersensitivitysyndrome，HSS)。SJS和TEN属于同一疾病谱，可根据黏膜或皮肤脱落的程度不同分类，SJS皮肤脱落面积与皮肤总面积之比<10％，而TEN的>30％。皮肤型不良反应轻者影响药物的治疗效果，重者致死，致死率达到30％以上，其中SJS/TEN的致死率高达40％。超过90％的严重皮肤反应发生在用药后的两个月，无剂量依赖性，无预见性。芳香族抗癫痫药物AEDs，如卡马西平(carbamazepine，CBZ),拉莫三嗪(lamotrigine，LTG)和苯妥英(phenytoin，PHT)，临床常用于治疗癫痫及神经类疾病，三种药物导致的Stevens-Johnson综合症(SJS)发生率约为35.8/10,000，我国南方汉族人群更是高发人群。HLA基因位于人类染色体6p21.3，长约4,000Kb，是人类最复杂的遗传多态系统，在不同的种族或同一种族不同群体中的分布出现明显的种群特性。在南方汉族人群中，HLA-B*1502与卡马西平(CBZ)导致的SJS/TEN存在强相关性，美国FDA推荐亚裔在服用CBZ之前，进行HLA-B*15:02的检测，以避免SJS/TEN的发生。LTG、PHT导致的SJS/TEN的HLA相关基因尚未明确。此外，南方汉族人群HLA-B*15:02阴性SJS患者比例高达30.4％，因此，除HLA-B*15:02之外，可能存在其它风险因子，如能在用药前，开展风险因子的检测，为有效降低药物的高风险性提供了可能。技术实现要素：本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，采用病例-对照研究方法，对服用AEDs引起的SJS/TEN和AEDs耐受样本进行HLA-A位点和HLA-B位点Sanger测序分型，在此基础上设计了用于特异性扩增HLA-A*24:02基因和HLA-B*15:02基因的引物，并由此设计了对AEDs引起的SJS/TEN进行检测的方法。本发明的方法快速、简便、准确、灵敏、直观，且实验成本低。为此，本发明一方面提供了一种用于检测AEDs引起的SJS/TEN的引物组合，其由序列1-4所示的引物组成，用于特异性扩增HLA-A*24:02基因和HLA-B*15:02基因。在本发明优选的实施方案中，该引物组合进一步由2组引物组成，第1组由序列1和2所示的引物组成，用于特异性扩增HLA-A*24:02基因，第2组由序列3和4所示的引物组成，用于特异性扩增HLA-B*15:02基因。在本发明进一步优选的实施方案中，每条引物的浓度均为10pmol/l。本发明另一方面提供了一种用于检测AEDs引起的SJS/TEN的试剂盒，其包含本发明所述的引物组合，用于特异性扩增HLA-A*24:02基因和HLA-B*15:02基因。在本发明优选的实施方案中，试剂盒中每条引物的浓度均为10pmol/l。本发明另一方面提供了本发明所述的引物组合在制备检测AEDs引起的SJS/TEN的试剂盒中的应用，该引物组合用于特异性扩增HLA-A*24:02基因和HLA-B*15:02基因。本发明再一方面提供了本发明所述的引物组合，或者本发明所述的试剂盒在检测AEDs引起的SJS/TEN中的应用，该引物组合和试剂盒用于特异性扩增HLA-A*24:02基因和HLA-B*15:02基因。本发明最后一方面提供了一种检测AEDs引起的SJS/TEN的方法，其包含以下步骤：1、获取待测样品DNA。2、采用本发明所述的引物组合，或采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行PCR扩增。3、对PCR扩增产物进行Sanger测序。4、得到测序峰图后，进行结果判读，判断待测样品中HLA-A*24:02基因和HLA-B*15:02基因的阳性率。在本发明优选的实施方案中，步骤2中每条引物的浓度均为10pmol/l。在本发明进一步优选的实施方案中，步骤3中还包括测序反应后进行纯化以及进行变性处理的步骤。由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。1、本发明采用病例-对照研究，对服用AEDs导致的SJS/TEN和AEDs耐受样本进行HLA-A位点和HLA-B位点进行Sanger测序分型，发现HLA-A*24:02在CBZ、LTG及PHT导致的SJS/TEN的阳性率明显高于耐受组，为三种药物的通用风险因子。本发明进一步发现HLA-A*24:02和HLA-B*15:02基因型为AEDs引起的SJS/TEN的单独风险因子，并且两个基因型具有叠加效应。2、本发明根据HLA-A*24:02和HLA-B*15:02的基因序列，设计了能够高效特异性地扩增这两种基因的引物，具有高度的特异性。并且在此基础上，设计了可以对AEDs引起的SJS/TEN进行检测的试剂盒和方法。3、本发明的检测方法联合检测HLA-A*24:02和HLA-B*15:02基因，可以分别提高CBZ导致的SJS/TEN及CBZ/LTG/PHT三种药物导致的敏感性至82.1％和70.6％，特异性为70.6％和69％。同时，本发明的检测方法通过联合检测HLA-A*24:02和HLA-B*15:02基因，以预测AEDs导致的SJS/TEN,可以降低南方汉族人群SJS/TEN的发生率，从35.8/100000降低至13.0/100000。附图说明图1：PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。图2：A2F测序峰形图。图3：A2R测序峰形图。图4：A3F测序峰形图。图5：A3R测序峰形图。图6：A4F测序峰形图。图7：B2F测序峰形图。图8：B2R测序峰形图。图9：B3F测序峰形图。图10：B3R测序峰形图。图11：B4F测序峰形图。具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。实施例1：样本采集采集8周内首次服用抗芳香族癫痫药物出现SJS/TEN不良反应的患者91例(即病例组)及服用抗癫痫药物3个月未出现皮肤不良反应的个体322例(即抗癫痫药物耐受对照组)的外周血，用EDTA抗凝管采取4ml，-80℃冰箱保存。病例组和对照组人群均为中国南方汉族人群，且所有人的祖父母、外祖父母的籍贯均为中国南方地区。实施例2：实验技术流程1、DNA提取使用QuickgeneDNA抽提试剂盒及配套的Quickgene-610LDNA提取机提取人外周血白细胞DNA，步骤按操作说明进行。具体步骤如下：A、向15ml离心管加入300μl蛋白酶(EDB)、2ml人外周血标本、2.5mL裂解缓冲液(LysisBuffer,LDB)；B、上下颠倒混匀10-15次；C、漩涡混合器2500rpm/分×15秒；D、56℃水浴5分钟；E、加入无水乙醇2.5mL；F、上下颠倒混匀10-15次；G、漩涡混合器2500rpm/分×15秒；H、将混合物倒入Quickgene20ml纯化柱管；I、第一次运行“DNAWHOLEBLOOD”模式，第二次运行“ISOLATEA”模式，可得两管所需的人外周血白细胞DNA；J、充分混匀后采用分光光度计测定DNA的浓度和OD值；所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，DNA浓度不少于50ng/ul，总量不少于10μg。K、置于-20℃冰箱保存。2、引物设计、PCR扩增反应及纯化根据GenBank公布的基因序列，利用PrimerPremier5.0引物设计软件设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。为减少测序峰图底峰，最大限度地保障了测序引物的纯度，通过引物反应条件的优化和比较，筛选出特异性强的引物。具体的引物序列参见表1。表1：HLA-A和HLA-B基因的扩增引物序列表于96孔反应板中，分别按照表2配制各基因组DNA样本的PCR反应体系，并进行PCR反应。表2PCR扩增体系PCR反应程序如下：96℃预变性5min；98℃变性10s、65℃退火30s、72℃延伸60s，5个循环；96℃变性20s、60℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。4℃保存。扩增产物电泳图谱参见附图1。扩增后的产物利用SAP进行纯化。3、Sanger测序及分型Sanger测序以ABI公司BigDyeTerminatorV3.1为主要试剂(含有dNTP、ddNTP和荧光素)，用前PCR反应纯化后的产物为模板，加入特异性引物进行循环扩增。HLA-A、HLA-B的测序引物分别为A-2F/R、A-3F/R、A-4F，B-2F/R、B-3F/R、B-4F。具体的测序引物序列参见表3。表3测序反应扩增引物序列表测序引物位点序列A2FCCTCTGYGGGGAGAAGCAA2RTCTCGGACCCGGAGACTGA3FCATTTTCAGTTTAGGCCAAAAATA3RCCAATTGTCTCCCCTCCTTGA4FGGGTGTCCTGTCCATTCTCAB2FAGGAGCGAGGGGACCGCAB2RGATCTCGGACCCGGAGACTB3FGGGGCCAGGGTCTCACAB3RTGGGAGGCCATCCCCGGCB4FGGTCACATGGGTGGTCCTAG测序扩增的反应条件如下：96℃2min；96℃10s，50℃20s，60℃2min(25个循环)；15℃∞。测序扩增的反应体系为5ul，其组成如表4所示，其中2.5×Bigdye和5×Buffer均购自美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems，ABI)。表4测序反应体系测序扩增产物经过乙醇—EDTA-Na2沉淀纯化处理后，用去离子甲酰胺溶解变性，ABI3730xl全自动DNA测序仪(美国)毛细管电泳并自动对结果进行分析处理，获得所需片段碱基序列，并以4色峰图形式呈现。采用VectorNTI6.0(美国)软件对HLA-A、HLA-B的序列按照http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla网上公布的序列进行比对并获得结果。4、统计分析与结果采用SPSS16.0统计分析软件进行统计分析。将病例组与对照组的HLA-A*24:02和HLA-B*15:02的阳性率用χ2检验或精确概率法进行比较，P﹤0.05为差异有统计学意义，显示HLA-A*24:02为CBZ、LTG及PHT的风险基因，同时也为三种药物的通用风险基因；HLA-B*15:02为CBZ的风险基因，同时也为三种药物的通用风险基因(具体数据参见表5)。表5：CBZ，LTG，和PHT导致的SJS/TEN风险因子采用Logtistic回归模型分析两个等位基因在AEDs导致的SJS/TEN的交互作用，进入方程的标准α＝0.05，剔除方程标准α＝0.10，P<0.05为差异具有统计学意义，保留在Logistic回归模型中的因素确定为有意义危险因素，发现两个基因为单独风险基因，且具有累加效益(具体数据参见表6)。表6：HLA-B*15:02和HLA-A*24:02对AED导致的SJS/TEN累积效应按照三种药物导致的SJS发生率为10万分之35.8，检测HLA-A*24:02及HLA-B*15:02基因型，HLA-A*24:02基因阳性或HLA-B*15:02阳性患者避免服用这三种AEDS，可以降低SJS发生率至10万分之13。当前第1页1 2 3