检测毕赤酵母细胞DNA的引物及方法与流程

本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及毕赤酵母(PichiaPastoris)细胞DNA的检测引物及方法。
背景技术：
：在现代，生物重组制品已广泛应用于医药健康领域，发挥着越来越重要的作用。这些生物制品包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗体以及各种细胞因子等。重组生物制品的应用与人类健康事业息息相关，国际上对其的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求。重组生物蛋白绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产，细胞中复杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性。其中残余的生物遗传物质DNA是一个非常重要的污染，因此，对它的检测是重要的质量控制环节。在重组生物蛋白制品中，残余DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细胞多为原核细胞、外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上，存在于生物制品中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。在生产重组生物蛋白的宿主细胞中，毕赤酵母(PichiaPastoris)是重要的一类，其甲醇营养型酵母，能够利用甲醇作为唯一碳源和能源。巴斯德毕赤酵母的生物学特点之一是，甲醇代谢所需的醇氧化酶被分选到过氧化物酶体中，形成区域化。以葡萄糖作碳源时，菌体中只有1个或很少几个小的过氧化物酶体，而以甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80％，AOX增至细胞总蛋白的35％-40％。因此，当在AOX基因前利用同源重组方式插入外源蛋白基因时，可获得大量表达。同时，根据甲醇酵母这种可以形成过氧化物酶体的特性，既可利用该系统表达一些毒性蛋白和易被降解的 酶类，也可用以研究细胞特异区域化的生物发生及其机制和功能，为高等动物类似的研究提供启示。利用毕赤酵母表达外源性蛋白的优点在于：(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；(2)表达效率高，其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90％以上，有利于目的蛋白的分离纯化；(3)在简单合成培养基中可实现高密度培养；(4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；(5)由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源，而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源，可以减少污染。根据相关监管机构对来自毕赤酵母的生物制品，其宿主DNA的限量为10ng/剂。关于生物制品中宿主细胞残余DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相对简单，检测限在10pg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。Taqman探针检测属于实时定量PCR技术，是一种快速的高通量检测方法，它在PCR扩增过程中加入一个特异性的荧光探针，通过荧光信号的变化反映产物的增加情况，从而能够定量分析样本中的初始模板。近年来，由于Taqman探针技术在特异性、灵敏性、准确性方面的独特优势，其在检测基因突变、基因定量等疾病相关检测领域得到广泛的承认及应用。然而，该方法仍然存在样本需要预处理、各实验室引物探针设计不同、没有统一标准物质等等问题，对以上问题仍需要进一步研究、解决。综上所述，本领域急需检测生物制品中毕赤酵母DNA的方法，该方法应具备灵敏性、操作简便、标准统一等优点并且能区分毕赤酵母DNA与其它真核宿主细胞DNA，从而能用于生物制品质量控制。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高灵敏度，并能区分毕赤酵母DNA与其它真核宿主细胞DNA的检测毕赤酵母细胞基因组DNA的引物对，以及包含所述引物对的检测试剂或PCR试剂盒。本发明的另一目的是提供一种利用本发明提供的引物对或检测试剂检测毕赤酵母细胞基因组DNA的方法或PCR方法。在第一方面，本发明提供一种检测毕赤酵母细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于毕赤酵母细胞基因组DNA上SEQIDNO:1所示序列的第84-103位；其中的反向引物结合于SEQIDNO:1所示序列的第151-170位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-90bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。在具体的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示；优选地，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在第二方面，本发明提供一种检测试剂，所述检测试剂包含本发明第一方面所述的引物对。在具体的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示；优选地，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在具体的实施方式中，所述检测试剂还包含探针。在优选的实施方式中，所述探针如SEQIDNO:8或SEQIDNO:4所示。在优选的实施方式中，所述检测试剂的检测灵敏度为1fg/μl。在具体的实施方式中，所述检测试剂包含的引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示；而所述检测试剂包含的探针如SEQIDNO:4所示。在第三方面，本发明提供一种检测毕赤酵母细胞基因组DNA的方法，所述 方法包括：利用本发明第一方面所述的引物对或本发明第二方面所述的检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。在第四方面，本发明提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的本发明第一方面所述的引物对。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。在优选的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示；优选地，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有探针。在优选的实施方式中，所述探针如SEQIDNO:8或SEQIDNO:4所示。在优选的实施方式中，所述引物对中的正向引物如SEQIDNO:2所示，反向引物如SEQIDNO:3所示；而所述探针如SEQIDNO:4所示。在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。在第五方面，本发明提供一种PCR方法，包括步骤：在一PCR检测体系中，利用本发明第一方面所述的引物对扩增目标产物。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。在优选的实施方式中，所述引物对中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示，或者，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示；优选地，所述正向引物如SEQIDNO:2所示， 所述反向引物如SEQIDNO:3所示。在优选的实施方式中，所述PCR检测体系还包括探针。在优选的实施方式中，所述探针如SEQIDNO:8或SEQIDNO:4所示。在优选的实施方式中，所述引物对中的正向引物如SEQIDNO:2所示，反向引物如SEQIDNO:3所示；而所述探针如SEQIDNO:4所示。在第六方面，本发明提供本发明第一方面所述的引物对或第二方面所述的检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在毕赤酵母细胞DNA。在优选的实施方式中，所述待测对象是重组蛋白制品。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了本发明引物对与SEQIDNO:1所示毕赤酵母基因组DNA片段的结合位点。图2显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对为126-84(图1中的引物对9)，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图3显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对为126-94(图1中的引物对10)，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图4显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对为126-101(其中，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示)。图5显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对为126-106(其中，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示)。图6显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对为126-87。图7显示了参考品的标准曲线，其中利用的引物对为126-87。图8显示了参考品的扩增曲线，其中利用的引物对为126-103。图9显示了参考品的标准曲线，其中利用的引物对为126-103。图10显示了以水作为对照的扩增曲线，其中利用的引物对为126-87。图11显示了以水作为对照的标准曲线，其中利用的引物对为126-87。图12显示了CHODNA干扰实验的扩增曲线，其中利用的引物对为126-87。图13显示了CHODNA干扰实验的标准曲线，其中利用的引物对为126-87。图14显示了VeroDNA干扰实验的扩增曲线，其中利用的引物对为126-87。图15显示了VeroDNA干扰实验的标准曲线，其中利用的引物对为126-87。图16显示了人DNA干扰实验的扩增曲线，其中利用的引物对为126-87。图17显示了人DNA干扰实验的标准曲线，其中利用的引物对为126-87。图18显示碎片化程度不同的DNA片段的电泳结果；其中，DNA分子量标准：由上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1为未超声样本，泳道2为10s超声样本；泳道3为1min超声样本；泳道4为5min超声样本；泳道5为10min超声样本；泳道6为30min超声样本；泳道7为DNA标记。图19显示利用引物对126-87获得的碎片化程度不同的DNA片段梯度稀释的qPCR检测结果。具体实施方式经过深入而广泛的研究，本发明人出乎意料地发现针对毕赤酵母细胞基因组DNA的SEQIDNO:1所示序列设计的引物，不仅能够高度灵敏地检测毕赤酵母细胞基因组DNA，还能区分其它真核细胞，例如CHO细胞、Vero细胞，特别是人的干扰性DNA；从而获得兼具灵敏度和特异性的检测毕赤酵母细胞基因组DNA的引物对以及检测方法。本发明方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。在此基础上完成了本发明。本发明的引物对本文所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的毕赤酵母细胞基因组DNA特异性引物不是针对外源基因本身或病毒载体本身设计，而是针对毕赤酵母细胞基因组DNA的SEQIDNO:1所示序列(ACTTATTGAAGCAAAAAGAGAACAGCTTCGTCTACTAATAAAAAGAGATTGCAGCACCTGAGTTTCGCGTATGGTCTCCCACTACACTACTCGGTCAGGCTCTTAGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGACGGGAAACGGTGCTTTCTGCTAGATATGGCCGCAACCGAAAGAAAAGATCTGCAGTGGGTCATATGGTATGAATTATTTTGTTCAAGGACTTGACAATTAACCATGACTTTTGACTCTATAGGAAAGTAGTCTTTTAAGAACCGTAAAAGCTTAGTTCTTGACATTTCAG CATTGGTATGTCATTGCTTTAATGATAAGTTTTCAAGAGAGTAGAATCATCACATAAGTGAACATCTATGTAATCTTTGTCATTTCAAAATTAATAAGTTAAAGAGTACCATCTACTCGAAACTAAATTATGGAATACTGCAATTTTACTAGTATCTATAACAGGTTTTCCA)设计的。换言之，本发明的引物可以特异性结合于毕赤酵母细胞基因组DNA上的SEQIDNO:1所示序列。鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，针对SEQIDNO:1所示序列可以设计多种引物对。因此，本发明的引物对不限于实施例中具体得到的引物对。在具体的实施方式中，本发明的正向引物结合于毕赤酵母细胞基因组DNA上SEQIDNO:1所示序列的第84-103位；其中的反向引物结合于SEQIDNO:1所示序列的第151-170位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为80-90bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为18-22bp；优选20bp。在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为59-61℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。在具体的实施方式中，本发明的引物对为126-101(其中，所述正向引物如SEQIDNO:10所示，所述反向引物如SEQIDNO:11所示)，或126-106(其中，所述正向引物如SEQIDNO:12所示，所述反向引物如SEQIDNO:13所示)，目标序列为GAATAAAAAAAGATTGCAGCACCTGAGTTTCGCGTATGGTCTCCCACTACACTACTCGGTCAGGCTCTTAGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGACGGGAAACGGTGCTTTCTGCTAGATATGGCCGCAACCGGAAGCTTT(SEQIDNO:14)。在优选的实施方式中，本发明的引物对为126-87(其中，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示)，或126-103(其中，所述正向引物如SEQIDNO:6所示，所述反向引物如SEQIDNO:7所示)；在更优选的实施方式中，本发明的引物对是126-87。探针本文所用的术语“探针”具有本领域技术人员常规理解的意义，即，一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。鉴于本发明的教导和本领域的公知常识，本领域技术人员应该理解，在知晓引物对的前提下，本领域技术人员可以根据正向引物和反向引物结合位点之间的模板序列自主设计探针，并检测该探针与引物对的技术效果。在具体的实施方式中，本领域普通技术人员可根据需要具体设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。因此，本发明的探针并不限于实施例中具体公开的探针。本发明的引物对也不限于与实施例中具体公开的探针配对使用。在具体的实施方式中，本发明的探针为TPi-1(AGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGAC；SEQIDNO:8)或TPi-2(TAACTACGGTTGATCGGACGGGAAA；SEQIDNO:4)。本发明的检测试剂本发明还提供一种检测毕赤酵母细胞基因组DNA的检测试剂，所述检测试剂包含本发明的引物对以及探针等实施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、Mg2+等等。在具体的实施方式中，本发明的检测试剂包含的引物对为126-87或126-103，优选地，所述引物对是126-87；包含的探针为TPi-1或TPi-2，优选TPi-2。在具体的实施方式中，本发明检测试剂的检测灵敏度达到1fg/μL。在本发明的引物对或检测试剂的基础上，本发明进一步提供一种检测毕赤酵母细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：利用本发明的引物对或检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。在本发明的引物对的基础上，本发明还提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的上述本发明引物对。在具体的实施方式中，本发明的PCR试剂盒还装有用于实施PCR的其它所需成分，例如探针，以及使用该试剂盒作PCR检测的使用说明书。在优选的实施方式中，所述试剂盒中还装有标准品对照。在本发明的引物对的基础上，本发明提供利用本发明的引物对扩增目标产物的PCR方法。本发明的优点包括:1.本发明的引物对或检测试剂能够高度灵敏地检测毕赤酵母细胞基因组DNA；2.本发明的引物对或检测试剂能够区分真核宿主细胞，例如CHO细胞、Vero细胞，特别是人类干扰性DNA；3.本发明的检测方法操作简便快捷、特异性和灵敏性高。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。材料与方法1.DNA检测体系：2xTaqmanmix：含有Taq酶、dNTP、Mg2+、本发明引物及探针等成分。掺加标准品，阴性质控，DNA稀释液2.检测仪器：ABI7500。3.检测过程准备工作：将购买自中国科学院上海生命科学研究院的毕赤酵母用takara基因提取试剂盒提取，制成毕赤酵母基因组DNA(10ng/μL)做为参考品。用超纯水将毕赤酵母基因组DNA参考品梯度稀释成以下5个浓度梯度，分别为10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL。NTC为无样本阴性质控(超纯水)。检测体系：20μLTaqmanmix+10μL样品＝30μL检测程序：实时荧光定量PCR反应程序优选为：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。实施例1.本发明引物对的设计及其灵敏度检验发明人根据SEQIDNO:1所示序列，设计了以下引物对和探针：正向引物pi-126-87F：ACACTACTCGGTCAGGCTCT(SEQIDNO:2)；反向引物pi-126-87R：TTTCGGTTGCGGCCATATCT(SEQIDNO:3)；探针TPi-2：TAACTACGGTTGATCGGACGGGAAA(SEQIDNO:4)；扩增片段：ACACTACTCGGTCAGGCTCTTAGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGACGGGAAACGGTGCTTTCTGCTAGATATGGCCGCAACCGAAA(SEQIDNO:5)。发明人通过qPCR实验检验了上述引物对的性能，其中，qPCR体系为：18.2μLmix+0.6μL正向引物+0.6μL反向引物+0.6μL探针+10μLPichiaDNA。DNA标准曲线为：10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、NTC。实验结果如图6和图7所示。其中图6是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图7是参考品标准曲线。由图7可知，当参考品浓度为10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.69，相关系数(R2)＝0.998，扩增效率为86.6％。标准曲线线性良好，检测灵敏度可达到1fg/μl。实施例2.本发明引物对的设计及其灵敏度检验发明人根据SEQIDNO:1所示序列，设计了以下引物对和探针：正向引物pi-126-103F：GTTTCGCGTATGGTCTCCCA(SEQIDNO:6)；反向引物pi-126-103R：TTCGGTTGCGGCCATATCTA(SEQIDNO:7)；探针TPi-1：AGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGAC(SEQIDNO:8)；扩增片段：GTTTCGCGTATGGTCTCCCACTACACTACTCGGTCAGGCTCTTAGCAGCTTAACTACGGTTGATCGGACGGGAAACGGTGCTTTCTGCTAGATATGGCCGCAACCGAA(SEQIDNO:9)。发明人通过qPCR实验检验了上述引物对的性能，其中，qPCR体系为：18.2μLmix+0.6μL正向引物+0.6μL反向引物+0.6μL探针+10μLPichiaDNADNA标准曲线为：10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL、NTC。实验结果如图8和图9所示。其中图8是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图9是参考品标准曲线。由图9可知，当参考品浓度为10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.59，相关系数(R2)＝0.996，扩增效率为89.9％。标准曲线线性良好，检测灵敏度可达到1fg/μl。实施例3.本发明引物对的特异性检验抗干扰实验：步骤：用DNA稀释液将毕赤酵母DNA梯度稀释成浓度为20pg/μL、2pg/μL、200fg/μL、20fg/μL、2fg/μL五个浓度梯度；将CHO/vero/人三种干扰DNA稀释成浓度为2ng/μL。(CHODNA来源中国食品药品检定研究院；vero细胞来源中国食品药品检定研究院,用takara基因提取试剂盒提取；人非小细胞肺癌细胞HCC827来源中国科学院上海生命科学研究院,用takara基因提取试剂盒提取)qPCR体系：18.2μLmix+0.6μL正向引物+0.6μL反向引物+0.6μL探针+5μLH2O/CHO/Vero/人DNA+5μL毕赤酵母DNA实验结果如下表所示：DNAR2slopeE毕赤酵母+H2O0.999-3.31100.5％毕赤酵母+CHO0.998-3.25103.1％毕赤酵母+Vero0.998-3.17106.8％毕赤酵母+人0.998-3.3897.6％实验结果如图10～图17所示。从产生的曲线可以看出，CHO/人/毕赤酵母DNA污染对本发明的引物对(126-87)的检测结果明显没有造成影响。该引物对具备优异的特异性。实施例4.超声破碎实验DNA碎片化实验步骤：1.取100ng/μL的毕赤酵母gDNA20μL放入干净的PCR管，共准备6管。1管作为对照，余下5管分别在超声清洗机(SPEC-DW-12028B型超声清洗机1200W)中进行10s、1min、5min、10min、30min不同时长的超声破碎，获得一系列碎片化程度不同的DNA片段。2.取这一系列碎片化程度不同的DNA片段5μL，进行2％琼脂糖凝胶电泳。3.将这一系列碎片化程度不同的DNA片段分别进行梯度稀释，取10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/μL，利用的引物对126-87进行qPCR检测。结果如图18-19所示，证明显示DNA的破碎化不会对检测结果造成负面影响。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 2 3