本发明涉及一种猪骨活性肽的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术：
猪骨中，骨蛋白这一优质营养源的利用一直很落后，并且对骨中的蛋白及其它营养成分没有充分开发利用。目前，由于动物骨头价格低廉，不易储存，所以往往被加工成附加值比较低的产品或被制成饲料，导致骨的利用率大大降低。这样不仅会造成极大的浪费，还会因骨头极易腐败变质而导致一定的环境污染。
骨综合利用的形式主要有两种，一种是全骨利用，也就是整个骨头的利用，该方法能够比较全面的利用骨中的营养成分，其主要产品是骨粉、骨泥等，可以作为食品添加剂或者是肉类食品的替代物；另一种是骨提取物的利用，该方法是提取骨中的各类营养物质并加以利用，其主要产品是骨油、骨胶、骨素等。
在猪骨蛋白质的长链中，存在着比蛋白质和氨基酸抗氧化性更强的抗氧化肽。蛋白酶的水解产物中存在多种抗氧化肽，它们具有较强抑制生物大分子过氧化和清除体内自由基的功效。抗氧化肽以其分子量小、易吸收、活性强等特点受到重视，并在医药、化妆品、保健品和食品及饲料添加剂等方面具有广阔的前景。
技术实现要素：
本发明提供了一种猪骨活性肽的制备方法。
所述方法主要包括以下步骤：
(1)将新鲜猪骨剔净轧成1cm3左右的块状，用60℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的柠檬酸溶液中浸泡5～6h；猪骨与柠檬酸溶液的用量比例为1kg：(2～3)L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入到质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6～8h得到酶解底物；猪骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：(2～4)L；
(3)按质量比1％加入酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解2～3h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到猪骨多肽粉。
在本发明的一种实施方式中，所述酸性蛋白酶是20万U/g的酶制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述方法主要包括以下步骤：
(1)将新鲜猪骨剔净轧成1cm3左右的块状，用60℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的柠檬酸溶液中浸泡5h；猪骨与柠檬酸溶液的用量比例为1kg：2L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入到质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；猪骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在50℃条件下酶解2h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到猪骨多肽粉。
在本发明的一种实施方式中，所述方法主要包括以下步骤：
(1)将新鲜猪骨剔净轧成1cm3左右的块状，用60℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的柠檬酸溶液中浸泡5h；猪骨与柠檬酸溶液的用量比例为1kg：2L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6h得到酶解底物；猪骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解3h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到猪骨多肽粉。
本发明通过柠檬酸溶液浸泡、维生素C溶液的浸泡对猪骨进行前处理，并酶进行酶解，显著提高了猪骨蛋白的水解度以及抗氧化的能力。水解液水解度为50％左右，对羟自由基清除率达到39％，凝胶色谱测定水解液中多肽的分子量在5kD以内的占85％以上。
具体实施方式
猪骨总蛋白质的测定采用微量扩散法：取酶解底物5ml，加入1g消化催化剂和10ml浓硫酸，在高温下消化至黄绿色后，取出冷却至室温，加水定容。然后取5ml加入到扩散皿的外室，并在扩散皿的内室加入2ml的硼酸溶液，向外室中加入4ml浓NaOH溶液，并迅速盖上盖片。在自然环境下放置24h左右后，用标准的盐酸溶液滴定硼酸溶液至紫罗兰色即可。总蛋白质(％)＝(V2-V1)×N×稀释倍数×0.014×6.25÷样品重量×100％。V1为空白所需盐溶液体积(ml)，V2为滴定待测液耗用标准酸体积(ml)，N为标准酸当量浓度，稀释倍数＝制备液体积(容量瓶ml)吸取体积(ml)，0.014为1ml当量氮的克数。
水解度DH采用TCA可溶性氮测定：10ml步骤(5)水解液中加入10ml 20％的TCA溶液，混合振荡，在4000r/min离心15min。取上清液，猪骨总氮含量与TCA可溶性氮采用微量扩散法。DH(％)＝(N3-N1)÷(N2-N1)×100％。N1为发酵底物TCA可溶性氮含量，N2为发酵底物总氮含量，N3为步骤(5)水解液TCA可溶性氮含量。
清除羟自由基能力的测定：取0.75mmol/L邻二氮菲1mL装于试管中，依次加入PBS(0.02mol/L pH 7.4)2mL，蒸馏水1mL，完全混匀后，加入0.75mmol/L的硫酸亚铁1mL，质量分数为0.12％的过氧化氢1mL，于37℃水浴反应90min，于536nm处测其吸光度，为Ap；用1mL蒸馏水代替1mL过氧化氢，为Ab；用步骤(5)水解液取代1mL蒸馏水，为As。羟自由基清除率按样品对羟自由基清除率＝(As-Ap)/(Ab-Ap)×100％计算。
除非特别说明，下述实施例涉及的实验方法为本领域常规使用的方法。
实施例1
(1)将新鲜猪骨剔净轧成1cm3左右的块状，用60℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的柠檬酸溶液中浸泡5h；猪骨与柠檬酸溶液的用量比例为1kg：2L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；猪骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在50℃条件下酶解2h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到猪骨多肽粉。
测得步骤(5)水解液水解度为49％，对羟自由基清除率为39％，凝胶色谱测定步骤(5)水解液中多肽的分子量在5kD以内的占85％以上。
实施例2
(1)将新鲜猪骨剔净轧成1cm3左右的块状，用60℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的柠檬酸溶液中浸泡5h；猪骨与柠檬酸溶液的用量比例为1kg：2L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6h得到酶解底物；猪骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解3h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到猪骨多肽粉。
测得步骤(5)水解液水解度为52％，对羟自由基清除率为36％。
对照例1
(1)将新鲜猪骨剔净轧成1cm3左右的块状，用60℃的热水冲洗去油脂后置于质量分数为1％的柠檬酸溶液中浸泡5h；猪骨与柠檬酸溶液的用量比例为1kg：2L；
(2)捞出沥干后粉碎并磨成骨泥，以水浸泡6h，得到酶解底物；猪骨与水的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解2～3h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到猪骨多肽粉。
测得步骤(5)水解液水解度为24％，对羟自由基清除率为23％。
对照例2
(1)将新鲜猪骨剔净轧成1cm3左右的块状，用60℃的热水冲洗去油脂；
(2)沥干后粉碎并磨成骨泥，加入质量分数2％的维生素C水溶液中，浸泡6h，得到酶解底物；猪骨与维生素C水溶液的用量比例为1kg：2L；
(3)按质量比1％加入20万U/g的酸性蛋白酶在45～50℃条件下酶解2～3h；
(4)灭酶：酶解结束后，升温灭酶；
(5)过滤：加入珍珠岩、硅藻土等助滤剂，板框过滤得到水解液；
(6)浓缩：将水解液采用刮板浓缩器浓缩得到质量分数30％的提取液；
(7)干燥：将所得提取液喷雾干燥得到猪骨多肽粉。
测得步骤(5)水解液水解度为21，对羟自由基清除率为26％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。