快速恒温检测金黄色葡萄球菌的方法、引物及应用与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速恒温检测金黄色葡萄球菌的方法、引物及试剂盒。

背景技术：

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)隶属于葡萄球菌属，菌体球形，是一种革兰氏阳性细菌。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。同时其产生的肠毒素可污染食物而致食物中毒，为人类带来非常严重的公共卫生负担。因此，对于该菌的预防和检测非常重要。

目前，国际上对金黄色葡萄球菌的检测普遍采用传统培养方法，但检测周期较长，操作相对复杂，检测效率较低，难以满足现代社会对于食源性致病菌检测过程高通量、高灵敏度、高特异性、快速、便捷的要求。近年来随着核酸分子检测技术的发展，研究人员陆续开发出了PCR和荧光PCR技术的检测手段，但是这两种方法需要专门的检测仪器，因此，并不适合广泛应用于基层检测部门尤其是企业生产线内部进行的实时实地检测。为确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的金黄色葡萄球菌。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展起来的一种新型恒温核酸扩增方法，该法针对靶序列的6个区域设计4条特异性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游内引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2组成，BIP由B1C和B2组成)，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物-白色焦磷酸镁沉淀(见文献Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。该技术具有不需要PCR仪或荧光定量PCR仪、恒温下即可完成，肉眼即可判断反应结果，以及灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作便捷、成本低等优点。

引物设计是LAMP技术中最为关键的一步，常规做法是将某待检测生物的公认的特异性基因导入LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/e)，设定相关参数生成引物组。也就是说，用户首先必须确保该靶基因为待测物种的特异序列。以发明专利CN 101701252 B和CN 101880711 A为例，它们分别针对文献报道的金黄色葡萄球菌的特异基因——nuc基因和clfA基因，采用LAMP技术进行金黄色葡萄球菌检测。然而，所谓“公认的特异性基因”往往基于滞后的知识，并未基于不断增长的微生物基因组数据进行必要的更新，导致基于该靶基因序列获得的引物在实际应用中不一定能确保其通用性和/或特异性。本发明用表1展示了现有技术中存在的通用性不能确保的问题。也就是说，现有技术方法中所使用的金黄色葡萄球菌检测序列实际上并非金黄色葡萄球菌所共有，即，有可能漏检金黄色葡萄球菌的部分菌株。类似的问题也存在于特异性的确认，即，有可能将非金黄色葡萄球菌错误地认定为金黄色葡萄球菌。因此，行业内亟需一种能够确保特异性和通用性的金黄色葡萄球菌检测方法，同时满足基层检测部门对快速、便捷的需求，能够方便地在企业生产线内部开展实时实地检测。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于克服现有LAMP技术引物设计中存在的引物通用性和特异性不足的缺陷，充分利用目前公共数据资源中丰富的微生物基因组序列信息以及相应的序列分析工具，设计用于特异性识别金黄色葡萄球菌的引物组，并在此基础上形成高灵敏度、高特异性检测试剂盒。本发明基于GenBank数据库中的微生物基因组数据资源(截至2013年8月5日数据)进行金黄色葡萄球菌LAMP引物的设计，提供了一种快速恒温扩增检测金黄色葡萄球菌的方法、引物组及试剂盒。采用本发明的检测方法检测金黄色葡萄球菌，具有高灵敏度和高特异性，检测时间短，结果判定简单，操作便捷，成本低的优点。

本发明提出一种快速检测金黄色葡萄球菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)从待测样品中提取基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，以能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物组为引物，在酶反应体系下，进行恒温扩增反应；

(3)通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在金黄色葡萄球菌。

本发明恒温检测金黄色葡萄球菌菌株的方法，从待测样品中提取基因组DNA，以其为模板，以金黄色葡萄球菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应，然后，通过判断反应结果是否为阳性，确定待测样品中是否存在金黄色葡萄球菌。其中，所述酶反应体系包括但不限于DNA聚合酶反应体系。

本发明中，所述金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列为GI号为148266447的金黄色葡萄球菌的720465～720702bp位序列。

本发明中，所述能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物组为所述基因组(GI号为148266447)的720465～720702bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。其中，所述金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列是指仅为金黄色葡萄球菌基因组所特有的，而其它微生物基因组所不包含的碱基序列。

其中，所述能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异碱基序列的引物组包括但不限于引物组A，或选自与该引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为83％及以上的引物组之任意一组。

引物组A：

上游外引物F3_A：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’-GGACAACTGTTCTCCCTA-3’(SEQ ID NO：2)；

上游内引物FIP_A：5’-CATACCACTTTTGCATCAAGCTTGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’(SEQ ID NO：3)；

下游内引物BIP_A：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’(SEQ ID NO：4)。

本发明中，所述能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异碱基序列的引物组还可以包括与前述各引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为83％及以上的引物组，该引物组包括但不限于以下引物组B：

引物组B：

上游外引物F3_B：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-GATTGGACAACTGTTCTCC-3’(SEQ ID NO：6)(与引物B3_A 5’-GGACAACTGTTCTCCCTA-3’同源性83％)；

上游内引物FIP_B：5’-GGCATACCACTTTTGCATCAATGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游内引物BIP_B：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’(SEQ ID NO：8)。

本发明方法中，在一具体实施方案中，所述恒温扩增的酶反应体系为：1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜碱。例如，1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO₄和酶反应体系中的镁离子Mg²⁺做合并处理。

本发明方法中，所述恒温扩增反应的反应程序为①60～65℃孵育10～90min，优选地为10～60min；②80℃终止反应2～20min。本发明不限制通过其他适宜反应程序来实现本发明检测方法。

本发明方法中，检测方法包括但不限于电泳检测、浊度检测或显色检测等。所述电泳检测，优选为凝胶电泳检测法，可以是琼脂糖凝胶，也可以是聚丙烯酰胺凝胶。电泳检测结果中，如电泳图呈现特征性阶梯状条带，则待测样品呈金黄色葡萄球菌阳性，含有金黄色葡萄球菌；如电泳图不呈现特征性阶梯状条带，则待测样品呈金黄色葡萄球菌阴性。所述浊度检测，是用肉眼观察或浊度仪检测浊度，检测管出现明显混浊，则待测样品呈金黄色葡萄球菌阳性，含有金黄色葡萄球菌；如未见混浊，则待测样品为金黄色葡萄球菌阴性。也可以经离心后肉眼观察反应管底是否有沉淀，若反应管底有沉淀，则待测样品呈金黄色葡萄球菌阳性，含有金黄色葡萄球菌；如反应管底没有沉淀，则待测样品呈金黄色葡萄球菌阴性。

所述显色检测，是在反应管中加入显色剂，包括但不限于钙黄绿素(50μM)或SYBR Green I(30-50×)，或羟基萘酚蓝(即HNB，120-150μM)。当采用钙黄绿素或SYBR Green I作为显色剂时，如反应后颜色为橙色，则待测样品为金黄色葡萄球菌阴性；如反应后颜色为绿色，则待测样品为金黄色葡萄球菌阳性，含有金黄色葡萄球菌。当采用羟基萘酚蓝作为显色剂时，如反应后颜色为紫罗兰色，则待测样品为金黄色葡萄球菌阴性；如反应后颜色为天蓝色，则待测样品为金黄色葡萄球菌阳性。所述显色检测，除了上述通过肉眼观察反应结果外，也可以通过检测仪器进行实时或终点检测反应结果，通过合理的设定阴性反应的阈值，当待测样品反应的结果低于或等于该阈值时，则待测样品为金黄色葡萄球菌阴性；当待测样品反应的结果大于该阈值时，则待测样品为金黄色葡萄球菌阳性。所述检测仪器包括但不限于荧光分光光度计、荧光定量PCR仪、恒温扩增微流控芯片核酸分析仪和Genie II等温扩增荧光检测系统等。

所述显色检测中，若采用钙黄绿素或羟基萘酚蓝作为显色剂，可以在恒温扩增反应之前加入，也可以在恒温扩增反应完成之后加入，优选地为恒温扩增反应之前加入，可以有效的减少反应污染的可能性。若采用SYBR Green I作为显色剂，则在恒温扩增反应完成之后加入。若采用钙黄绿素作为显色剂，则在酶反应体系中加入50μM钙黄绿素的同时，加入0.6-1mM[Mn²⁺]，例如，0.6-1mM的MnCl₂。

本发明还提供了用于恒温检测金黄色葡萄球菌菌株的方法中的引物。所述引物包括能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异碱基序列的引物组，其包括但不限于，所述引物的序列为GI号为148266447的金黄色葡萄球菌基因组的720465～720702bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分。

其中，所述能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物组选自以下各引物组之任意一组，或选自与所述各引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为83％及以上的任一引物组。其中，所述引物组包括但不限于以下引物组A。所述与前述引物组序列或其互补链序列中单条序列同源性为83％及以上的引物组包括但不限于以下引物组B。

引物组A：

上游外引物F3_A：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’；

下游外引物B3_A：5’-GGACAACTGTTCTCCCTA-3’；

上游内引物FIP_A：5’-CATACCACTTTTGCATCAAGCTTGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’；

下游内引物BIP_A：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’。

引物组B：

上游外引物F3_B：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-GATTGGACAACTGTTCTCC-3’(SEQ ID NO：6)(与引物B3_A 5’-GGACAACTGTTCTCCCTA-3’同源性83％)；

上游内引物FIP_B：5’-GGCATACCACTTTTGCATCAATGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游内引物BIP_B：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’(SEQ ID NO：8)。

本发明还提供一种用于上述恒温检测金黄色葡萄球菌菌株方法中的试剂盒，其包括所述能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异碱基序列的引物组。本发明试剂盒中，所述能扩增金黄色葡萄球菌基因组特异性碱基序列的引物组，包括但不限于以基因组(GI号:148266447)的720465～720702bp位的核酸序列的一部分或其互补链的一部分作为所述引物序列；所述引物包括但不限于所述引物组A。还包括但不限于以与前述引物序列或其互补链序列中单条序列同源性为83％及以上的引物组作为引物；包括但不限于引物组B。

本发明试剂盒中，还包括Bst DNA聚合酶缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTP溶液、Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)和甜菜碱中的一种或多种。在一具体实施方案中，本发明试剂盒酶反应体系包含1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L的甜菜碱。例如，1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液可以选用1×Thermopol反应缓冲液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反应缓冲液中的MgSO₄和酶反应体系中的镁离子Mg²⁺做合并处理。

本发明试剂盒中，还包含阳性对照模板。在一具体实施方案中，所述阳性对照模板包括但不限于金黄色葡萄球菌的全基因组DNA、部分基因组DNA，或包含金黄色葡萄球菌全基因组DNA或部分基因组DNA的载体。

本发明试剂盒中，还包含阴性对照模板，所述阴性对照模板包括但不限于双蒸水。

本发明试剂盒中，还包含显色剂，显色剂包括但不限于钙黄绿素，SYBR Green I或羟基萘酚蓝。当显色剂为钙黄绿素时，试剂盒中还包含[Mn²⁺]，例如，MnCl₂。

本发明试剂盒中，还包含双蒸水。

本发明试剂盒中，还包含核酸抽提试剂。

本发明还提出了一种载体，所述载体包含选自引物组A、B之任意一组引物。该载体由于包含了具有金黄色葡萄球菌特异性的DNA序列，因此可应用于微生物分类学、比较基因组学、进化等研究领域，以及微生物检测等应用领域。该载体可以是但不限于质粒载体(如pBR322、pUC18、pUC19、pBluescript M13、Ti质粒等)、病毒载体(如λ噬菌体等)和人造染色体载体(如细菌人造染色体BAC、酵母人造染色体YAC等)。例如，包含引物组A之任意一条引物的载体pBR322-A、包含引物组B之任意一条引物的载体pBR322-B等。包含引物组A之任意一条引物的载体λ噬菌体-A、包含引物组B之任意一条引物的载体λ噬菌体-B等。

本发明还提出了选自引物组A、B之任意一组的引物在恒温检测金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明还提出了所述试剂盒在恒温检测金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明还提出了所述载体在恒温检测金黄色葡萄球菌中的应用。

本发明为食品安全检测技术领域提供了一种简单快速灵敏的检测金黄色葡萄球菌的方法、引物/引物组、检测试剂/试剂盒，对我国的食品安全具有较大意义。本发明有益效果包括：采用本发明金黄色葡萄球菌检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、结果判定简单、操作便捷、成本低等优点。与目前常用检测方法相比，本发明采用的恒温扩增法，可以在恒温条件下进行，只需采用简单的恒温装置，不需要PCR实验中的昂贵仪器，不需要对扩增产物进行电泳检测等步骤，因而，非常适于广泛应用于社会各界包括基层食品安全检测部门推广使用，即使在分子生物学专业知识和技能基础相对不足的环境下也可充分应用。基于本领域常识可将上述各优选条件进行任意组合，均属本发明保护范围。

附图说明

图1表明本发明实施例7金黄色葡萄球菌恒温检测方法的特异性。

图2表明本发明实施例8金黄色葡萄球菌检测方法的灵敏度。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1-6金黄色葡萄球菌恒温反应体系和检测方法

按照以下(1)～(3)步骤进行检测：

(1)基因组DNA的提取

用于检测的金黄色葡萄球菌菌种来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC21600(ATCC27217)。取1mL细菌培养物使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取基因组DNA，DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.8，浓度为50.4ng/μL。

(2)以待测金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，分别采用自配的试剂盒(见表2，表3)，并按照表3中所述条件，配制反应体系，以金黄色葡萄球菌特异性扩增引物组为引物，进行恒温扩增反应。实施例1～6中的引物分别为引物组A，A，A，B，B，B。

(3)按照表3中所述条件，通过电泳检测、浊度检测或显色检测，进行扩增结果确认。

由表3可以看出，本发明检测方法及其所采用的引物组及反应体系能够很好地对金黄色葡萄球菌特异性片段进行扩增并得到检测结果。因此，本发明可以应用于检测样本中是否含有金黄色葡萄球菌。

实施例7金黄色葡萄球菌特异性检测

收集非金黄色葡萄球菌28株(表4和图1中的3～30)，将这些菌株与金黄色葡萄球菌菌株(表4和图1中的1和2)分别进行培养，取1mL菌液，采用试剂盒IA，提取细菌DNA，并参照实施例1的反应体系和条件，分别进行LAMP扩增(引物组为A)和加入显色剂观察。

其检测结果如表4和图1所示，图1中，3～30分别为表皮葡萄球菌、马红球菌、蜡样芽孢杆菌、蕈样芽孢杆菌、单核增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、伊氏李斯特菌、肠沙门氏菌肠亚种、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌(含肉毒梭菌A型基因)、致病性大肠埃希氏菌、致泻大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠产毒性大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌、阪崎克罗诺杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、弗氏弧菌、霍乱弧菌和宋氏志贺氏菌，NTC：阴性对照，1～2分别为金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌金黄亚种。图1中，仅有金黄色葡萄球菌菌株扩增反应后的产物呈现为亮绿色，为阳性结果，如第1～2号管所示。而其他非金黄色葡萄球菌菌株及阴性对照扩增反应后的产物均呈现为橙色，为阴性结果，如第3～30号管以及NTC阴性对照管所示。

由图1和表4结果可以看出，本发明检测试剂盒及检测方法具有良好的金黄色葡萄球菌菌株特异性，即，只有金黄色葡萄球菌菌株扩增阳性，其他非金黄色葡萄球菌菌株为阴性。

配制检测试剂盒，试剂盒中采用的引物为引物组B，按上述特异性检测方法，得到同样的检测结果，即，非金黄色葡萄球菌菌株及阴性对照扩增反应后的产物为阴性结果，金黄色葡萄球菌菌株扩增反应后的产物为阳性结果。

此外，按照表1中所述方法，分别对引物组A～B的特异性进行理论分析，结果发现，在各条引物最多允许三个错配的情况下，各引物组最多有一条引物比对到非金黄色葡萄球菌上，表明各引物组的特异性均较好。

实施例8灵敏度检测

按实施例2的方法提取细菌CICC 21600的DNA，采用试剂盒IIB，并按照500pg、50pg、5pg、500fg、50fg DNA梯度加入反应体系，其他反应条件参照表3实施例2的方法分别进行LAMP扩增(引物组为A)和加入显色剂观察。如图2所示，1-5分别为500pg、50pg、5pg、500fg、50fg，NTC：阴性对照。图2中500pg、50pg、5pg处理的反应产物呈现为亮绿色，为阳性结果，500fg、50fg处理和阴性对照的反应产物呈现为橙色，为阴性结果。检测结果表明，每个反应管中最低含5pg(约相当于1500个细菌)的DNA时可被检出。

按上述检测方法，其他步骤及条件同上，用引物组B，每个反应管中低至5pg～500fg的DNA仍可被检出，检测灵敏度较高。

实施例9通用性检测

按照表1中所述方法，分别对引物组A～B的通用性进行理论分析，结果发现，各引物组的引物区域与数据库中43株金黄色葡萄球菌中的42株完全匹配，与另一株(GI＝514064966)也仅有一个错配，理论上可以用于上述43株金黄色葡萄球菌菌株的检测，表明各引物组的通用性均较好。

表1金黄色葡萄球菌的现有检测方法中引物的通用性和特异性分析

注：a)将专利中引物F3和B3间的序列与金黄色葡萄球菌的43个全基因组进行Bowtie比对，确定检测区域在GI号148266447基因组中的位置。b)将检测区域序列在公共数据库资源中进行Blast比对，引物区域完全匹配为通用性好。本表中仅列出了在三个基因组上进行通用性分析的结果。c)将检测区域序列在公共数据库资源中进行Blast比对，引物区域匹配程度越高，特异性越差；不能同时比对到非金黄色葡萄球菌上，表明特异性好。

表2恒温检测金黄色葡萄球菌的试剂盒种类及主要组成成分

表3实施例1-6本发明恒温检测金黄色葡萄球菌的方法中的反应条件及检测结果

表4试验所用菌株及检测结果

注：a)CGMCC：中国普通微生物菌种保藏中心，CICC：中国工业微生物菌种保藏管理中心，CMCC：中国医学细菌菌种保藏管理中心。b)+：阳性结果，-：阴性结果。