专利名称：一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明公开一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的试剂盒，利用环介导等温扩增 (LAMP)技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌，属于生物检测技术领域。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(St即hylococcus aureus, S. aureus)简称金葡菌，球形，直径
0. 811m，在显微镜下排列成葡萄串状，无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金葡 菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可以找到，是引起细菌性 食物中毒的主要病原菌，而且在国家鲜乳标准中列为不得检出的项目。目前国标法仍采用 传统的培养方法，但步骤繁琐、耗时长、成本高、灵敏性差等缺点。虽然近几年出现了一些简 便快速的技术，但是，直接应用于牛奶中的金葡菌检测，仍然不可行，因为，牛奶中的蛋白质 和脂肪等物质给检测带来了很大的影响，因此，开发一种快速检测牛奶中金葡菌的技术已 成为主要的发展趋势。
发明内容
本发明公开了一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的试剂盒，建立了一种快速、
灵敏的用于牛奶中的金黄色葡萄球菌检测的方法，适用于牛奶中金葡菌的定性检测。 本发明还进一步提供了该试剂盒的制备方法，适用于工业化生产。 本发明的快速检测牛奶样品中金黄色葡萄球菌的试剂盒，具体构成如下 1)免疫微球联接金黄色葡萄球菌抗体的羧基微球。
2)两对引物为 外引物F3 :GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT ;
B3 :GATGCTTTGTTTCAGGTGTA ;
内引物FIP :CTGTTGGATCTTCAGAACCACTT-GCTCAGCAAATGCATCAC ;BIP :GAACCTGCGACTTTAATTAAAGCGA-TCTGAATGTCATTGGTTGAC ; 3)LAMP反应液由0. 6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/L氯化钾、10mmo1/
L硫酸铵、8mmol/L硫酸镁、0. 1 % TritonX-100、 1. Omol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各
1. 6 ii mol/L、外引物各0. 2 ii mol/L。 4)阳性对照液金黄色葡萄球菌基因组DNA。
5)阴性质控标准品无菌双蒸水。
本发明试剂盒的制备方法，包括以下步骤
1、免疫微球 1)金黄色葡萄球菌多克隆抗体的制备A :将经鉴定的金黄色葡萄球菌接种到LB培养液中，37t:、200r/min摇床过夜培养，计数，用0. 3%甲醛溶液37t:灭活24h，涂平板检验无活菌后用生理盐水洗涤两次，最后 用200iiL生理盐水重悬，并调整其浓度为1Xl(fCFU/ml，与200iiL弗氏完全佐剂充分乳 化，作为免疫原。 B :取两只体重lkg左右雄性健康新西兰大白兔，取以上免疫原皮下多点注射。首 次免疫后间隔两周加强免疫，免疫剂量1 X 1(TCFU/ml ， 200 ii L菌液与200 y L弗氏不完全佐 剂充分乳化，皮下多点注射，每隔两周进行一次，第三次免疫一周后耳静脉采血测效价。当 效价达到1 : 1000时加强免疫一次一周后心脏放血分离血清，经HiTr即Protein A HP纯 化柱纯化后，置于-2(TC保存。
2)免疫微球的制备 A :取微球原液超声波震荡30s，然后用去离子水洗涤一次。 B :加入羧基微球表面活化剂，室温震荡20min，离心洗涤一次，重悬于100 y L PBS中。 C :加入多克隆抗体，漩涡震荡混匀，室温震荡2h，洗涤离心两次，重悬于含1% BSA 的100 ii L PBS中，室温震荡4h，4t:过夜以阻断微球表面未结合位点。
D :用洗涤液洗涤微球2次，重悬于100ii LPBS中，4。C备用。
2、两对引物 根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(皿c)基因(Genbank登录号V01281)，利用 Primer ExplorerV4设计弓l物如下
外引物F3 :GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT ;
B3 :GATGCTTTGTTTCAGGTGTA ;
内引物FIP :CTGTTGGATCTTCAGAACCACTT-GCTCAGCAAATGCATCAC ;BIP :GAACCTGCGACTTTAATTAAAGCGA-TCTGAATGTCATTGGTTGAC ; 3、LAMP反应液由0. 6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、 1Ommol/L氯化钾、10mmo1/
L硫酸铵、8mmol/L硫酸镁、0. 1 % TritonX-100、 1. 0mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各
1. 6 ii mol/L、外引物各0. 2 ii mol/L。 4、阳性对照液采用AxyPr印细菌基因组DNA小量试剂盒提取金黄色葡萄球菌基 因组DNA作为阳性对照。 5、阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。
本发明的使用方法包括以下步骤
1)牛奶样品前处理取lmL牛奶样品于2mL离心管中，加入100 y L微球，在室温下轻轻震荡30min，离 心，弃上清，用100iiL无菌水重悬沉淀，煮沸10min，离心，取上清。
2)LAMP反应 取1 ii L上清加入到LAMP反应液的反应体系中，进行LAMP检领"反应条件为
65 °C 50min。 3)结果判定 取8 ii LLAMP产物，以2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶图像分析仪上观察扩增结果。
以下实验表明本试剂盒可以快速检测牛奶样品中金黄色葡萄球菌
1、牛奶样品前处理取lmL牛奶样品于2mL离心管中，加入100 y L微球，在室温下轻轻震荡30min，离 心，弃上清，用100iiL无菌水重悬沉淀，煮沸10min，离心，取上清。
2、试剂盒检测 取1 ii L上清加入到LAMP反应液的反应体系中，进行LAMP检领U，同时做阴性和阳 性对照，置于65t:水浴锅反应50min。
3、结果分析 取8ii LLAMP产物，以2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶图像分析仪上观察扩 增结果。(见图l)。 图中，1是DL2000标准分子量；2是金黄色葡萄球菌基因组阳性对照；3是无菌双 蒸水阴性对照；4是牛奶样品的检测结果。
结论 反复重复实验3次，所得检测结果都相同，说明不同批次之间的检测结果具有可 比性和良好的重复性。 本发明与现有技术相比其积极效果在于 利用免疫微球富集牛奶中的金黄色葡萄球菌，简单快速，并消除了牛奶中其他物 质的影响。LAMP检测方法实用性强，快速、灵敏，装配成试剂盒使用安全，特异性好，使用步 骤简单，可重复性好，可以对牛奶样品中的金黄色葡萄球菌进行定性检测，可以替代传统的 牛奶中金黄色葡萄球菌检测方法。
图1牛奶样品检测结果图；
图2试剂盒特异性鉴定图。
图3试剂盒敏感性鉴定图
具体实施例方式
实验材料羧基微球购自美国SIGMA公司；MgCl2购自上海生工生物工程有限公 司；Bst DNA聚合酶购自New England Biolabs公司；dNTP、rTaq酶购自Takara公司；HiTr即 Protein A HP购自GE公司；金黄色葡萄球菌标准株(ATCC25923)购自中国药品生物制品 鉴定所；鼠伤寒沙门氏菌(CVCC541)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型(CVCC263)购 自中国兽药监察所；大肠杆菌0157:H7 (912981)由日本友人赠送；小肠结肠炎耶尔森菌 (ATCC9610)、痢疾志贺氏菌由沈阳出入境检验检疫局赠送。
实施例1试剂盒的组成与配制
1、免疫微球 1)金黄色葡萄球菌多克隆抗体的制备 A :将经鉴定的金黄色葡萄球菌接种到LB培养液中，37t:、200r/min摇床过夜培 养，计数，用0. 3%甲醛溶液37t:灭活24h，涂平板检验无活菌后用生理盐水洗涤两次，最后用200iiL生理盐水重悬，并调整其浓度为1Xl(fCFU/ml，与200iiL弗氏完全佐剂充分乳 化，作为免疫原。 B :取两只体重lkg左右雄性健康新西兰大白兔，取以上免疫原皮下多点注射。首 次免疫后间隔两周加强免疫，免疫剂量1 X 1(TCFU/ml ， 200 ii L菌液与200 y L弗氏不完全佐 剂充分乳化，皮下多点注射，每隔两周进行一次，第三次免疫一周后耳静脉采血测效价。当 效价达到1 : 1000时加强免疫一次一周后心脏放血分离血清，经HiTr即ProteinAHP纯化 柱纯化后，置于-2(TC保存。
2)免疫微球的制备 A :取微球原液超声波震荡30s，然后用去离子水洗涤一次。 B :加入羧基微球表面活化剂，室温震荡20min，离心洗涤一次，重悬于100 y L PBS中。 C :加入多克隆抗体，漩涡震荡混匀，室温震荡2h，洗涤离心两次，重悬于含1% BSA 的100 ii L PBS中，室温震荡4h，4t:过夜以阻断微球表面未结合位点。
D :用洗涤液洗涤微球2次，重悬于100 ii L PBS中，4。C备用。
2、两对引物 根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(皿c)基因(Genbank登录号V01281)，利用 Primer ExplorerV4设计弓l物如下
外引物F3 :GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT ;
B3 :GATGCTTTGTTTCAGGTGTA ;
内引物FIP :CTGTTGGATCTTCAGAACCACTT-GCTCAGCAAATGCATCAC ;BIP :GAACCTGCGACTTTAATTAAAGCGA-TCTGAATGTCATTGGTTGAC ; 3、LAMP反应液由0. 6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、 1Ommol/L氯化钾、10mmo1/
L硫酸铵、8mmol/L硫酸镁、0. 1 % TritonX-100、 1. 0mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各
1. 6 ii mol/L、外引物各0. 2 ii mol/L。 4、阳性对照液采用AxyPr印细菌基因组DNA小量试剂盒提取金黄色葡萄球菌基 因组DNA作为阳性对照。 5、阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。
实施例2试剂盒的特异性实验 1、分别取经过DNA有效性验证的鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、猪传染性胸膜 肺炎放线杆菌血清5型、大肠杆菌0157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌的菌液 20ii L于离心管中，95。C加热10min进行热裂解。12000rpm离心lmin，取上清。
2、分别取各种菌液上清1 ii L加入到LAMP反应液的反应体系中，进行LAMP检领" 同时做阴性和阳性对照，置于65t:水浴锅反应50min。 3、取8 ii LLAMP产物，以2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶图像分析仪上观察 扩增结果。 结果只有金黄色葡萄球菌扩增出来，而鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、猪传染性 胸膜肺炎放线杆菌血清5型、大肠杆菌0157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌和阴性对照无条带
7(见图2)。图中，1是DL2000标准分子量；2是鼠伤寒沙门氏菌；3是痢疾志贺氏菌；4是猪 传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型；5是大肠杆菌0157 :H7 ;6是小肠结肠炎耶尔森菌；7是 无菌双蒸水阴性对照；8是金黄色葡萄球菌。
上述结果说明试剂盒具有良好的特异性。
实施例3试剂盒的敏感性实验 1、取lmL过夜培养的金葡菌培养液做10倍倍比稀释，稀释至10—9。每个稀释度分 别取20iU置于PCR管中，95。C加热10min进行热裂解。12000rpm离心lmin，取上清。
2、取各个稀释度上清1 ii L加入到LAMP反应液的反应体系中，进行LAMP检测，同 时做阴性和阳性对照，置于65t:水浴锅反应50min。 3、取8 ii LLAMP产物，以2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，在凝胶图像分析仪上观察 扩增结果。 通过实验结果可以看出当菌液稀释至10—8时仍可以扩增出，最低检测限为50CFU/ ml (见图3)。图中，1是DL2000标准分子量；2是金黄色葡萄球菌基因组阳性对照；3是 无菌双蒸水阴性对照；4-11分别是细菌浓度分别为5. 0 X 107CFU/ml 、5. 0 X 106CFU/ml 、 5. OX 105CFU/ml、5. 0 X 104CFU/ml 、5. 0 X 103CFU/ml 、5. 0 X 102CFU/ml 、 5. OX 1(^CFU/ml、 5. 0X100CFU/ml。 上述结果说明试剂盒具有良好的敏感性。 序列表 〈110>吉林大学 〈120〉 一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的试剂盒
〈210>1
〈211>966
〈212>DNA 〈213>金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)
〈220〉
〈221>gene
〈222〉 (1) (966)
〈223〉
〈400〉 1 tgtctcgata tgatagtctg
gctaaatata taagttctga
ttttattate attattaaat
teacgtttea tetteaaatt
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〈212>DNA 〈213>人工合成 <220> 〈221〉引物(primer) 〈222>(1). . (45) 〈223〉 〈400>5 gaacctgcga ctttaattaa agcgatctga atgtcattgg ttgac 45
10
权利要求
一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的试剂盒，具体构成如下1)免疫微球联接金黄色葡萄球菌抗体的羧基微球；2)两对引物为外引物F3GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT；B3GATGCTTTGTTTCAGGTGTA；内引物FIPCTGTTGGATCTTCAGAACCACTT-GCTCAGCAAATGCATCAC；BIPGAACCTGCGACTTTAATTAAAGCGA-TCTGAATGTCATTGGTTGAC；3)LAMP反应液由0.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/L氯化钾、10mmol/L硫酸铵、8mmol/L硫酸镁、0.1％TritonX-100、1.0mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6μmol/L、外引物F3/B3各0.2μmol/L；4)阳性对照液金黄色葡萄球菌基因组DNA；5)阴性质控标准品无菌双蒸水。
2. 权利要求1所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤1) 免疫微球A :金黄色葡萄球菌多克隆抗体的制备将经鉴定的金黄色葡萄球菌接种到LB培养液中，37t:、200r/min摇床过夜培养，计数， 用0. 3%甲醛溶液37t:灭活24h，涂平板检验无活菌后用生理盐水洗涤两次，最后用200 y L 生理盐水重悬，并调整其浓度为1 X 109CFU/ml，与200 P L弗氏完全佐剂充分乳化，作为免疫 原；取两只体重1kg左右雄性兔，取以上免疫原皮下多点注射；首次免疫后间隔两周加强 免疫，免疫剂量1Xl(TCFU/ml，200ii L菌液与200 y L弗氏不完全佐剂充分乳化，皮下多点 注射，每隔两周进行一次，第三次免疫一周后耳静脉采血测效价；当效价达到l : IOOO时加 强免疫一次一周后心脏放血分离血清，经HiTr即ProteinA HP纯化柱纯化后，置于-2(TC保 存；B :免疫微球的制备取微球原液超声波震荡30s，然后用去离子水洗涤一次；加入羧基微球表面活化剂，室温震荡20min，离心洗涤一次，重悬于100 ii L PBS中； 加入上述制备的多克隆抗体，漩涡震荡混匀，室温震荡2h，洗涤离心两次，重悬于含 1% BSA的100 ii L PBS中，室温震荡4h，4。C过夜以阻断微球表面未结合位点； 用洗涤液洗涤微球2次，重悬于100 L PBS中，4t:备用；2) 两对引物根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(皿c)基因(Genbank登录号V01281)，利用Primer ExplorerV4设计引物如下 外引物F3 :GCTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGT ; B3 :GATGCTTTGTTTCAGGTGTA ; 内引物FIP :CTGTTGGATCTTCAGAACCACTT-GCTCAGCAAATGCATCAC ; BIP :GAACCTGCGACTTTAATTAAAGCGA-TCTGAATGTCATTGGTTGAC ;3) LAMP反应液由0. 6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/L氯化钾、10mmol/L硫 酸铵、8mmol/L硫酸镁、0. 1% TritonX-lOO、 1. Omol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各1. 6 ii mol/ L、外引物各0. 2iimol/L ;4) 阳性对照液采用AxyPr印细菌基因组DNA小量试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组 DNA作为阳性对照；5) 阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测牛奶中金黄色葡萄球菌的方法，属于生物检测技术领域，适用于金黄色葡萄球菌的定性检测。本发明由免疫微球、两对引物、DNA聚合酶、LAMP反应液、显色液和阳性对照液组成。本发明检测速度快，特异性好，灵敏度高，操作步骤简单，可重复性好，可以替代传统的牛奶中金黄色葡萄球菌检测方法。
文档编号C12Q1/68GK101701252SQ20091021788
公开日2010年5月5日 申请日期2009年11月20日 优先权日2009年11月20日
发明者冯新, 孙长江, 杜崇涛, 许会会, 谢芳, 雷连成, 韩文瑜 申请人:吉林大学