葡萄球菌的检测的制作方法

专利名称：葡萄球菌的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及葡萄球菌的检测方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(“S.aureus”)是一种致病菌，能引起大范围的感染，这些感染包括诸如小的皮肤脓疡和伤口感染这样的表面病变；诸如心内膜炎，肺炎和败血症这样能危害整个身体和生命的疾病，此外，它还能产生引起食物中毒的毒素(toxinose)。
根据临床微生物手册(ASM出版社，华盛顿哥伦比亚特区，1995)288-289页，凝固血浆的能力依然是广为使用，并被普遍接受的鉴定与急性传染病相关的致病性葡萄球菌的标准，如人和动物中的金黄色葡萄球菌，以及动物中的中间葡萄球菌(S.intermedius)和猪葡萄球菌(S.hyicus)。至少已经描述了两种不同的凝固酶试验检测游离凝固酶的试管试验和检测结合凝固酶和凝集因子的玻片试验。尽管试管试验是决定性的，但可以把玻片试验当作一种快速筛选检测技术来鉴定金黄色葡萄球菌。尽管每次试验可以使用不同类型的血浆，但含有乙二胺四乙酸的脱水的兔血浆可通过商业途径获得。
试管凝固酶试验操作如下将0.1ml脑心浸液的过夜培养物和0.5ml的重构血浆混合，在37℃水浴或加热块中培养该混合物4小时，缓慢滴定，观察试管中凝块的形成。此外，也可以将一个在非抑制性琼脂上长大且分离好的克隆转移到0.5ml的重构血浆中，按照上述的方法培养。任何凝结程度都构成阳性测试。然而，一种絮凝状的，或纤维状的沉淀并不是真的凝块，应该记录成阴性的结果。建议对金黄色葡萄球菌测试培养过夜，因为少量菌株形成凝块可能需要超过4个小时的时间。对于这些要求较长凝块时间的金黄色葡萄球菌菌株，还必须测试别的特征来确认其身份。
凝固酶的玻片试验的操作如下在去离子水中混合重的均一的生长悬液，搅拌这种混合物成为均一的组合物，这样就不会将凝块和自动凝结混淆，加入一滴血浆，观察在10秒钟中形成凝块。和试管测试相比，玻片试验快，而且节省血浆。然而，有10-15％的金黄色葡萄球菌菌株会产生阴性结果，这样就必须对分离的菌株进行试管测试重新检查。必须快速辨认玻片试验结果，因为反应时间超过10秒钟就会出现假阳性结果。别的玻片试验包括商业上检测凝集因子的红血球凝集玻片试验以及检测凝集因子和蛋白A的胶乳凝集试验。此外，能检测凝集因子，蛋白A以及金黄色葡萄球菌血清型5和8的夹膜多糖的胶乳凝集试验也可以利用。当怀疑被试的微生物是金黄色葡萄球菌时，建议通过试管凝固酶试验对阴性的玻片试验进行确证。
The Journal of Biologial Chemistry(1998，273(21)13177-13181，5月22日发行)介绍了5种不同的来自金黄色葡萄球菌的纤维蛋白原结合蛋白。纯化了这些纤维蛋白原结合蛋白中的三种。这些蛋白中有一种是凝固酶，是一种也能结合凝血酶原的蛋白。第三个蛋白叫胞外纤维蛋白原结合蛋白(Efb)，在被试的金黄色葡萄球菌中是100％的存在，尽管水平不一。该论文进一步报道认为，存在Ca2+或Zn2+能促进蛋白从Efb和纤维蛋白原等摩尔混合物中沉淀。
Analylica Chimica Acta(1998，369139-145)描述根据其中生长有金黄色葡萄球菌的牛奶的凝集程度，利用串联压电石英晶体(SPQC)生物传感器来确定这种细菌的数目。和早期的带薄膜的PQC方法相比，这种方法具有如下优点没必要稀释培养基，而且在整个试验中都可避免振动停止。而且，这种方法快速，而且很容易确定响应曲线定量检测的转折点时间(TT)，在该时间点频率在下降之后开始恢复，以及在金黄色葡萄球菌浓度介于2.4×102-2.4×105个细胞/ml范围内时，TT和金黄色葡萄球菌起始浓度的对数呈良好的关系。
尽管本领域介绍过很多检测金黄色葡萄球菌的方法，但对检测方法进行改进仍然有好处。
发明概述描述检测金黄色葡萄球菌的方法。
在一个实施方案中，该方法包括提供测试样品，提供金黄色葡萄球菌反应物，将金黄色葡萄球菌反应物和测试样品混合，产生至少一种物理性质的变化，然后用水平剪切表面声波生物传感器检测这种变化。
在另外一个实施方案中，该方法包括提供测试样品，提供纤维蛋白原，混合测试样品和纤维蛋白原，其中包括金黄色葡萄球菌的测试样品中产生至少一种物理性质的变化，然后用声机械生物传感器检测这种变化。
对于描述的所有实施方案而言，测试样品可以包含相对低浓度的金黄色葡萄球菌，如大约5×104cfu/ml，大约5×103cfu/ml，大约1000cfu/ml，大约500cfu/ml以及任何介于这些浓度之间的浓度。进一步说，检测时间相对较短，如大约150，大约100，大约60，大约30分钟以及任何介于这些时间之间的检测时间。
对于所有介绍的实施方案，至少一种物理性质的变化优选的是导致波相位或波速变化的粘性的变化以及/或结合质量的变化。测试样品的体积小，介于大约0.5ml到大约1.5ml。声机械生物传感器优选包含诸如聚酰亚胺和聚苯乙烯这样的波导。
对于所有介绍的实施方案，测试样品和金黄色葡萄球菌反应物可以通过多种合适的方式组合。一方面，金黄色葡萄球菌反应物和测试样品可以作为单独的部分提供到声机械生物传感器上，顺序可以随意。在某些实施方案中，将测试样品和金黄色葡萄球菌反应物组合会产生固体。该方法进一步还包括分离固体。
附图简述

图1所示的是交叉指型换能器之间传感器表面的平面示意图。
图2所示的是声机械生物传感器注入水后的感应图(Sensogram)。
图3a-3c所示的是含有聚酰亚胺波导的声机械生物传感器在分别注入浓度为500cfu/ml，5000cfu/ml和50000cfu/ml金黄色葡萄球菌后的感应图。
图4a-4c所示的是含有聚苯乙烯波导的声机械生物传感器在分别注入浓度为500cfu/ml，5000cfu/ml和50000cfu/ml金黄色葡萄球菌后的感应图。
图5是图表，描述的是作为金黄色葡萄球菌浓度的函数的相移。
图6是图表，描述的是用聚酰亚胺作波导时，作为金黄色葡萄球菌浓度的函数的传播速度的变化。
优选实施方案的详细描述与试管和玻片凝固酶试验这样经典的临床分析不同，本发明采用的是一种声机械生物传感器，它能检测至少一种物理性质变化，并且对监测到的变化作出响应，产生信号。响应于变化的信号可以记录在像纸这样的有形输出上。例如，就声机械生物传感器而言，水平剪切表面声波的波相位和/或波速和/或频率响应可以记录在感应图(sensogram)上，这样就提供了定量信号。为了操作方便，声机械生物传感器优选的是能将定量输出转变成阈值信号。声机械生物传感器装置包括显示屏(如液晶显示屏)，显示屏能显示阳性或阴性的测试结果。
在本发明中，采用声机械装置的生物传感器用于检测是优选的。更优选的是，本发明采用的声机械生物传感器是表面声波(SAW)生物传感器。在这些装置中，声波交叉指型换能器(IDT)在压电基板上产生的声波既可以是表面声波，也可以是体声波。第二个IDT可以将声波变回电信号用于检测。这称作延迟线。此外，这个装置也可当作共振器使用。两个IDT之间的间隔可以靠涂层调节，涂层包括用作化学或生物感应的的活性分子。
参考图1，在某些实施方案中，在两个IDTs之间的声机械生物传感器表面100优选的是两条延迟线。第一个通道，就是“作用”通道20是用作接收测试样品。第二个通道，也就是“参比”通道30时用作基线或对照的。因此，在作用通道和参比通道之间的物理性质变化是不同的。
驱动和监测声机械传感器(如延迟线装置，共振器等)的技术和装置的例子，例如那些可以和本发明一块使用的，可以在诸如美国专利Nos.5076094(Frey等人)，5117146(Martin等人)；5235235(Martin等人)；5151110(Bein等人)；5763283(Cermosek等人)；5814525(Renschler等人)；5836203(Martin等人)以及6232139(Casalnuovo等人)等中找到。其它的例子可能在诸如Branch等人的“在36YXLiTaO3上利用洛夫波(love-wave)低水平地检测炭疽芽孢杆菌模拟物”生物传感器和生物电子学(2003年8月22日接受)以及2003年12月30日申请的美国专利申请系列号No60/533177，以及和本发明同一天申请的，PCT申请号是——，标题是“通过表面声波传感器估测传播速度”(专利律师档案号58927NO003)的专利中作了介绍。
压电式SAW生物传感器通常是根据他们检测质量或粘性微小变化的能力来操作的。如美国专利No5814525中介绍的那样，根据检测质量变化的模式，压电式声机械生物传感器能进一步分成表面声波(SAW)，声盘模式(APM)，或石英晶体微天平(QCM)装置。
在一些实施方案中，声机械生物传感器包括反应物(如抗体)，这种反应物能将目的金黄色葡萄球菌生物分子黏附到压电式声机械生物传感器表面上。在另外一些实施方案中，声机械生物传感器检测液体(如含水溶液)中诸如粘性这样的物理变化。表面波的传播速度是灵敏的探测器，能检测诸如质量，弹性，粘弹性，导电性以及介电常数的变化。因此，这些性质的任何变化可以导致可检测的表面声波。也就是说，当物质连接到，吸收到或别的方式黏附到SAW装置表面涂层上时，能产生相应的响应。APM也能通过与液体接触的装置操作。相似的是，在QCM(通常是AT-切割的石英)装置的两个相反的电极上加上可变电压会导致厚度剪切波模式，它的共振频率变化和涂层质量的变化成比例。
通过晶体切割压电材料来确定声波传播的方向(如平行于波导平面，或垂直于波导平面)，这种压电材料是用来制作声机械生物传感器。SAW生物传感器通常不用在液体感应中，这是因为和表面接触的液体中的声阻尼太多了，这种生物传感器大部分声波是在平面内和外部传播的(瑞利波，绝大部分兰姆波)。
对于液体样品介质，优选用压电材料构造水平剪切表面声波传感器(SH-SAW)，这种材料通过晶体切割和定向使波传播时旋转成水平切割模式，即在生物传感器波导的平面内，从而使与生物传感器表面接触的液体的声阻尼损失降低。水平剪切声波包括厚度剪切模式(TSM)，声板模式(APM)，薄覆盖层体波(SSBW)，洛夫波，纵漏表面声波(LSAW)以及bleustein gulyaev(BG)波。
具体而言，洛夫波传感器由基板组成，这种基板能支持诸如ST石英的SSBW或36°YXLiTaO3的泄漏波这样的SH波。应用薄的声导层或波导时，这些模式可以转变成洛夫波模式。这些波是频率依赖式的，如果波导层的剪切波速度比压电基板的速度低，这些波就能产生。SiO2被用作石英上的声波导层。也可以采用别的热塑和交联的聚合物波导材料，如聚甲基丙烯酸甲酯，酚醛树脂(商标名是“Novalac”)，聚酰亚胺和聚苯乙烯。
此外，QCM装置也可以用于液体样品介质。
采用这种生物传感器声机械装置和组件的生物传感器是已知的。参看美国专利Nos.5076094；5117146；5235235；5151110；5763283；5814525；5836203；6232139。可以从不同的制造商，如Sandia国家试验室，Albequerque，NM等处购买到SH-SAW装置。某些SH-SAW生物传感器在“使用36°YXLiTaO3的洛夫波生物传感器低水平检测炭疽杆菌刺激物”这篇文章中有介绍，这篇文章于2003年8月22日被生物传感器和生物电子学(Biosensors and Bioelectronics)杂志接受。SAW生物传感器以及检测生物试剂的方法在美国临时专利申请序列号No60/533169中也有介绍，这项专利是2003年12月30日提出申请，题目是“生物试剂的声机械检测系统和方法”。
在一些实施方案中，声机械生物传感器仅包括波导层，因此，这样的生物传感器基本上没有金黄色葡萄球菌反应物(如抗体)。在这个实施方案中，生物传感器通常检测粘性的变化。在别的实施方案中，生物传感器表面包括金黄色葡萄球菌反应物(如抗体)。在这个实施方案中，生物传感器通常检测到粘性变化以及/或金黄色葡萄球菌反应物结合的质量的变化。对于这个实施方案，生物传感器优选的包括固定层和连接层。
提供固定层的目的是将金黄色葡萄球菌反应物(如抗体)结合到表面。可作为例证的固定层包括N-酰基糖精三氯硅烷。可用于本发明的方法和系统的一些固定化技术在诸如2003年11月14日申请的美国专利序列号10/713174，2004年11月12日申请的10/987522，2003年12月30日申请的60/533162；2003年12月30日申请的60/533178；2004年7月22日申请的10/896392；2003年11月14日申请的10/714053，2004年11月12日申请的10/987075，和本发明在同一天申请的，题为“作为胺捕捉试剂的可溶性聚合物及方法”(专利律师档案号59995US002)；和本发明在同一天申请的，题为“多功能的胺捕捉试剂”(专利律师档案号59996US002)；以及和本发明在同一天申请的，PCT申请No，题为“声传感器及方法”(专利律师档案号60209WO003)中作了介绍。
如果固定化层不能直接应用在波导层上，可以在波导层和固定化层之间放置连接层。和N-(11二氯甲硅烷基十一烷酰)糖精连接层组合使用的连接层的例子包括仿钻玻璃层，如国际专利申请WO01/66820A1中介绍的那样。仿钻玻璃是一种无定形物质，其包含碳，硅以及选自氢，氧，氟，硫，钛或铜中一或多种元素。一些仿钻玻璃是通过等离子方法，由四亚甲基硅烷前体形成的。能制造出疏水的材料，其被进一步在氧等离子体中处理，控制表面的硅烷醇浓度。也可以使用诸如金这样的连接层。
仿钻玻璃可以作为薄膜，或者基板另一层或材料上的涂层的形式存在。在某些应用中，仿钻玻璃形成的薄膜至少含有30％重量的碳，25％重量的硅以及多达45％重量的氧。这种薄膜具有柔韧性，而且是透明的。在一些多层的基板中，仿钻玻璃是由仿钻碳沉淀而成。在某些实施方案中，仿钻碳的功能是作为第二个连接层，或作为多层基板中，聚合物层和仿钻玻璃层之间的底层。例如，利用等离子体发生器，可以从乙炔中制备出仿钻碳膜。别的制备这种膜的方法在美国专利Nos5888594和5948166以及M..David等人发表在AlChE杂志上的文章(37(3)，367-376，1991年3月)中有介绍，其中这两个专利引作本发明的参考。
本发明的方法包括提供测试样品和金黄色葡萄球菌反应物，将测试样品和金黄色葡萄球菌反应物组合，其中含有金黄色葡萄球菌(即分析物)的测试样品产生至少一种物理变化，然后用生物传感器(即诸如SH-SAW传感器这样的声机械传感器)检测这种物理变化。
“金黄色葡萄球菌反应物”指的是能和测试样品中的金黄色葡萄球菌相互作用的成分。因此，金黄色葡萄球菌反应物是一类“检测结合试剂”，即能特异性地识别分析物(目的检测物)，并与之作用或结合的试剂，其中这种试剂具有结合后便能被检测的性质。“特异性地相互作用”意思是指结合试剂和希望检测出来的分析物发生物理相互作用，基本上排除了样品中存在的其他分析物。本发明中使用的可检测的结合试剂的结合是稳定的，这样就能对这种结合进行检测。可检测的结合试剂具有允许被直接检测，或者被可检测到的部分所标记本质特性。“能被检测到的部分”指的是能黏附到结合试剂上的基团，从而通过一种或许多特定的方法对结合试剂进行检测的试剂。可检测的部分包括，但不限于放射标记(如32P，35S，125I等)，酶(如碱性磷酸酶，过氧化物酶等)，萤光团(如萤光素，氨基香豆素乙酸，四甲基罗丹明异硫氰酸酯，德州红，Cy3.0，Cy5.0，绿色荧光蛋白等)以及胶体金属微粒。
本发明装置的涂布方法包括美国专利申请系列No10/607698中的方法，这些申请是2003年6月27日提出申请的，和本申请共同未决。
这种相互作用产生至少一种物理性质(就SH-SAW传感器而言，这种变化如结合的质量以及/或粘性)的变化，这种变化可以通过传感器检测到。优选的金黄色葡萄球菌反应物包括金黄色葡萄球菌(如特异的)抗体，纤维蛋白原及其组合等。
测试样品和金黄色葡萄球菌反应物可以通过不同的合适方法进行组合。一方面，向声机械生物传感器提供金黄色葡萄球菌反应物(如含纤维蛋白原的溶液)，而向单独部分的生物传感器的提供测试样品(如液体)，但顺序可以变化。另一反面，将测试样品(如液体)和金黄色葡萄球菌反应物(如含纤维蛋白原的溶液)组合成混合物，向声机械生物传感器中提供这种混合物。在别的实施方案中，将金黄色葡萄球菌掺入到声机械生物传感器表面，通过这种方式整合到生物传感装置上。例如，可以在波导表面涂布含纤维蛋白原的溶液，也可选择将其干燥。另外，在声机械生物传感器表面也可以有金黄色葡萄球菌抗体，可以利用固定层将这一抗体固定。尽管可以在诸如接近注射测试样品的时候或之前将声机械生物传感器表面涂布金黄色葡萄球菌反应物，但从操作的速度考虑，优选的还是在制造生物传感器或其组件的时候，将金黄色葡萄球菌反应物涂布和/或整合进去。
有利的方面是，本发明方法对灵敏度进行了改进。本发明的发明人可以检测到低水平的金黄色葡萄球菌。正如下面的实施例中要进一步介绍的那样，当金黄色葡萄球菌的浓度是5×104菌落形成单位(cfu)/ml，5×103cfu/ml，5×102cfu/ml时也能检测到。猜测最小的检测水平能达到100cfu/ml。因此，本发明的任何一个普通的技术人员都会意识到，本发明的方法能被用来检测浓度介于大约100cfu/ml到大约5×102cfu/ml之间任意浓度的金黄色葡萄球菌(如在上述的浓度之间每次增幅10cfu/ml的任何特定浓度)。高浓度的金黄色葡萄球菌也能检测到，浓度高达5×107cfu/ml。
可选择的，或另外的，本发明的方法对检测速度也进行了改进，这也是有利的。本发明使用的声机械生物传感器能在相对短的时间内检测金黄色葡萄球菌。例如，能用不超过300分钟(如250分钟，200分钟，150分钟，100分钟)的时间检测前面提到的任何浓度的金黄色葡萄球菌。正如下面将要介绍的实施例中描述的那样，可以用大约30分钟或更少的时间检测金黄色葡萄球菌。
任何合适的测试样品都可以注入声机械生物传感器的样品舱门(port)里。本发明使用的“测试样品”指的是可能含有金黄色葡萄球菌的样品。该样品优选液体或气体，更优选是液体。测试样品可以有不同的来源，如生理流体，如血液，唾液，目镜液，滑液，脑脊液，脓，汗液，渗出物，尿，黏液，痤，粪，泌乳等。进一步说，测试样品还可以来自身体部位，如伤口，皮肤，鼻孔，头皮，指甲等。
本领域介绍了不同的患者采样技术，用来检测金黄色葡萄球菌。这些采样技术也适合本发明的方法。通常是通过擦患者鼻孔获得样品。特别优选的采样技术包括用灭菌的人造纤拭子擦拭被试者(如病人)的鼻前孔。一个拭子被用来对每个被试者进行采样，即一个拭子对应两个鼻孔。采样可以这么进行，将干的或预先用合适的溶液沾湿的人造纤拭子从Puritan，East Grinstrad，UK以商品名“Pure-Swabs”购买到插入被试者鼻孔的前端，并将拭子沿着鼻粘膜表面旋转完整的两圈。然后将拭子直接培养，或用合适的溶液提取，所述溶液通常包括选择性地和缓冲液以及至少一种表面活性剂组合的水。
除了生理流体，别的测试样品还包括别的流体以及溶解在液体介质中的固体。目的样品包括生产线，水，土壤，植物或别的植被，空气，(如，污染的)表面等。测试样品(如液体)可以进行前处理，如粘稠液体的稀释。测试样品(如液体)可以在被注入样品腔之前用别的方法进行处理，如浓缩，过滤，蒸馏，透析等；稀释，过滤，天然成分的失活，添加试剂，化学处理等。标题是“增强细胞成分检测信号的方法”美国专利No—，和本发明是同一天提出申请(专利律师档案号.59467US002)，介绍了通过裂解处理测试样品的方法的使用，这种方法和本发明结合使用。
在某些实施方案中，金黄色葡萄球菌抗体被用作金黄色葡萄球菌反应物。“金黄色葡萄球菌抗体”指的是具有特异结合假定抗原的能力的免疫球蛋白，其包括抗原结合部分。术语“抗体”意思是包括任何亚型的抗体(IgG，IgA，IgM，IgE等)以及其片段，这些片段也能和脊椎动物(如哺乳动物)蛋白特异的反应。可以用常规的方法将抗体片段化，筛选与完整的抗体以相同方式作用的片段。因此，该术语包括抗体分子通过蛋白酶剪切的片段或重组制备的部分，他们能选择性地和某种蛋白反应。这些通过蛋白酶剪切或重组片非限制性的例子段包括F(ab’)，F(ab)2，Fv以及含有通过肽接头连接的VL和/或VH结构域的单链抗体(scFv)。scFv可以通过共价或非共价连接形成具有两或多个结合位点的抗体。可以用任何本领域技术人员所知的可检测的部分(moiety)标记抗体。在一些方面，结合到人们想检测的分析物上的抗体(一抗)是不标记的，但它可通过和标记的二抗进行结合被检测到，二抗能特异性地和一抗结合。
不同的金黄色葡萄球菌抗体是本领域已知的。例如，金黄色葡萄球菌抗体可以通过商业途径从Sigma和Accurate Chemical公司获得。进一步说，金黄色葡萄球菌抗体在美国专利No4902616中被介绍了。采用的抗体浓度至少是2ng/ml。通常抗体浓度至少是100ng/ml。例如，可以采用50μg/ml的浓度。通常是不采用超过500μg/ml的浓度。如前面所介绍的那样，优选的是将金黄色葡萄球菌抗体固定在声机械生物传感器表面。
在别的实施方案中，纤维蛋白原被用作金黄色葡萄球菌反应物。不想受限于理论，据信由金黄色葡萄球菌表达的纤维蛋白原结合蛋白能和纤维蛋白原反应，形成叫作纤维蛋白的纤维网络。这种聚合反应通常称作“结块”，其产生可被SH-SAW生物传感器检测的粘性和/或结合质量的物理改变。
产生这种反应的纤维蛋白原的浓度通常至少是0.0001wt％，而一般不超过5wt％。纤维蛋白原和金黄色葡萄球菌的反应能被用来改变液体的粘性，然而可以通过例如SH-SAW生物传感器进行检测。此外，纤维蛋白原反应也可被用来选择和/或浓缩通过前述样品制备技术得到的金黄色葡萄球菌。
人血浆和动物(如兔)血浆是合适的含纤维蛋白原的介质。商业上获得的血浆产品一般包括诸如EDTA，柠檬酸盐，肝磷脂等抗凝剂。人纤维蛋白原可以通过商业途径从St.Louis，MO的Sigma Aldrich公司获得，商品号是“F4129”。
一般来说，优选的是选用相对体积小的测试样品。尽管也利用高达1-2ml的测试样品体积，但较有利的测试样品50μl通常就足够了。测试样品和含纤维蛋白原的介质的比率是可以变化的。然而，含纤维蛋白原介质(如溶液)和测试样品体积的比率通常是在10-1这个数量级上。
粘性增加的速率(如，金黄色葡萄球菌表达的纤维蛋白原结合蛋白与纤维蛋白原反应的速率)可以被不同的反应条件所影响，这些条件中的一些已经在本领域中介绍过。为了获得最快的检测速度，优选的是对反应条件进行优化。
为了增加纤维蛋白原结合的速率，优选的是在测试样品和/或含有纤维蛋白原的介质中加入钙离子。为了操作容易，典型优选的是将钙离子加入含纤维蛋白原的溶液中。通常是，钙离子是以诸如CaCl2·2H2O这样的水合盐的形式加入。钙离子浓度通常至少是0.1wt％(如0.2，0.3，0.4)，更优选的是至少0.5wt％。钙离子浓度通常是少于2wt％。根据文献，锌离子对反应速率有相似的作用。
另一个影响纤维蛋白原结合反应速率的因素是温度。优选测试样品和金黄色葡萄球菌结合的温度小于37度。进一步说，温度优选的是大于5度。尽管声机械生物传感器可以在室温(即20-25℃)操作，但纤维蛋白原的结合最佳温度是大约15℃-大约25℃。
根据若干本发明者所预知的具体的实施方案来介绍本发明，对这些实施方案而言可实现的描述(enabling description)是可获得的。可以对本发明做没预测的修改这样的非实质性修改，包括目前尚未预见的修改也可以构成本发明的等同物。因此，本发明的范围不应该仅限于本发明中介绍的细节和结构，而是只限于下面的权利要求，及其等同物。
SH-SAW生物传感器1-3在实施例中使用了三种不同的声机械生物传感器。所有这三种生物传感器都是在YXLiTaO3上采用泄漏表面声波，旋转角大约是36°。
首先分别用丙酮，甲醇，异丙醇和18MΩcm的水涮洗单面刨光的36°YXLiTaO3(Sawyer Research Product公司，Eastlake OH)晶片，然后用N2干燥。采用脱膜技术来确定叉指换能器的每条延迟线。为了加速黏附，用电子束蒸发器(CVC产品公司)将100埃的钛(Ti)结合层蒸发到LiTaO3晶片上。然后通过电阻蒸镀法将800埃的金层沉积在Ti薄膜上。
为了在切割过程中保护IDT模式，在晶片上涂上AZ4110光阻蚀剂，并在90℃烤90秒钟。在切割之前，将晶片打磨较好的一面安放在蓝色的中等大小的大头针上(Semiconduetor Equipment Corp.，Mesa，AZ)。然后用1.8mm宽的车轮切割晶片，进给速率是0.2mm/s，而主轴转速是12000rpm。
将切开的两个叉指电极排列在LiTaO3晶片建模。作两个这种模型，获得有作用传感器和参考延迟线。延迟线之间的距离是130λ。IDTs由56个孔径为38λ的手指对组成，金属化速率n＝0.5。IDT中心对中心的间隔是220λ。这些设备都支持SH波，中心频率是103MHz，而插入损耗是-8dB。
SH-SAW生物传感器1采用的波导是具有0.5微米厚的聚酰亚胺层，聚酰亚胺层按如下方法制备用N-甲基-2-吡啶烷酮清洗传感器，暴露在高强度的紫外灯下，旋转涂上聚酰亚胺溶液，该溶液可以从HD微系统公司，Santa，Clara，CA购买到，商品号是“聚酰亚胺2613”，然后在325℃老化涂层大约4小时。然后从传感器的衬垫上去掉聚酰亚胺，这样只有延迟线被波导材料覆盖。
SH-SAW生物传感器2采用和SH-SAW生物传感器1相同的方法制备，除了从Aldrich(目录号是18242-7)公司购买的聚苯乙烯的10％固体甲苯溶液被旋转涂布成1.4微米的厚度。
SH-SAW生物传感器3包括一个连接层，它置于0.5微米厚的聚酰亚胺波导层上，固定层置于连接层上，而金黄色葡萄球菌反应物(如抗体)则置于固定层上。这些层按如下方法构建利用乙炔等离子体，通过商品号是“2480型”的平行板电容耦合反应离子刻蚀机(从Plasma Therm，St.Petersburg，FL获得)，将仿钻涂层(DLC)沉积在聚酰亚胺薄膜上，然后利用四甲基硅烷等离子体将仿钻玻璃(DLG)沉积在仿钻涂层(DLC)上。
利用3M公司(St.Paul.MN)的3M811胶带将大约20cm×30cm大小的聚酰亚胺薄膜样品(商品名是”KAPTON”，购自E.I.Du Pont deNemours§公司，Wilmington，DE)粘贴到通电的离子刻蚀机电极上。关闭离子刻蚀机腔，然后用0.67Pa(0.005Torr)的压力抽吸离子刻蚀机腔。然后以500标准cm3/分钟的流速将氧气导入离子刻蚀机腔，使腔内压力保持在6.7Pa(0.050Torr)。点燃等离子体，使功率保持在2000W保持15秒。然后终止氧气流，将腔内抽吸到0.67Pa(0.005Torr)。然后往腔内引入乙炔，流速是200标准cm3/min，使腔内内保持在2Pa(0.015Torr)。点燃等离子体，使功率保持在1600W维持10秒。然后终止乙炔流，将腔内抽吸到0.67Pa(0.005Torr)。
再次往腔内导入氧气，流速是500标准cm3/min，使腔内内保持在20Pa(0.15Torr)。点燃，使功率保持在300W保持10秒。氧气流速保持在500标准cm3/min，然后以150标准cm3/min的流速导入四甲基硅烷。腔压保持在20pa(0.15Torr)。点燃等离子体，使功率保持在300W维持12秒。终止四甲基硅烷气流。1分钟以后，在保持氧气流和20pa(0.15Torr)腔压的同时，点燃等离子体，使功率保持在300W维持20秒。然后终止氧气流，将腔内抽吸到0.67Pa(0.005Torr)。然后打开样品腔与大气连通，从电极上取下聚酰亚胺薄膜，转过来使DLG涂层面对电极，然后再次黏附在电极上。重复等离子体处理的顺序，这样得到的聚酰亚胺薄膜两面分别涂上了DLC和DLG涂层。
将DLC/DLG涂布的传感器在含1mM二氯甲烷的5mlN-酰基糖精溶液中浸泡15分钟。取出传感器，用更多的二氯甲烷冲洗，在试验室的氮气中干燥，形成固定层。
本发明和不同的材料，方法，系统，装置等组合使用，这些在下面确定的不同的美国专利申请中都有介绍，这些专利，并且所有这些专利以其全文作为本申请的参考。这些专利包括2003年12月30日提出申请的美国专利序列号.60/533162，2003年12月30日提出申请的60/533178；2004年7月22日提出申请的10/896392；2003年11月14日提出申请的10/713174，2004年11月12日提出申请的10/987522，2003年11月14日提出申请的10/714053，2004年11月12日提出申请的10/987075，2003年12月30日提出申请的60/533171，2004年10月7日提出申请的10/960491，2003年12月30日提出申请的60/533177，2003年12月30日提出申请的60/533176；和本发明同天申请的，题为“增强细胞的细胞壁成分信号检测的方法”(AttorneyDocketNo.59467US002)；和本发明在同一天申请的，题为“作为胺捕捉试剂的可溶性多聚体及其方法”(专利律师档案号59995US002)；和本发明在同一天申请的，题为“多功能的胺基捕捉试剂”(专利律师档案号59996US002)；和本发明在同一天申请的，PCT申请No，题为“利用表面声波传感器估计传播速度”(专利律师档案号58927WO003)；和本发明在同一天申请的，PCT申请No，题为“表面声波传感器组件”(专利律师档案号58928WO003)；和本发明在同一天申请的，PCT申请No，题为“检测夹，检测模式，检测系统和检测方法”(专利律师档案号60342WO003)；以及和本发明在同一天申请的，PCT申请No，题为“声传感器及其方法”(专利律师档案号60209WO003)中作了介绍。
实施例1-7对声机械生物传感器检测金黄色葡萄球菌进行了例证。纤维蛋白原用作金黄色葡萄球菌反应物。实施例1-3利用SH-SAW生物传感器1，它具有聚酰亚胺波导，而实施例4-6利用的SH-SAW生物传感器2则具有聚苯乙烯波导。实施例7利用的是SH-SAW生物传感器3。在实施例1-7中，生物传感器放置在28℃培养箱中，防止因温度差异导致的波动和迁移。
实施例1金黄色葡萄球菌从位于Rockville，MD的美国典型培养物收藏中心(ATCC)获得，商品号是“ATCC25923”。该细菌用肉汤培养基(5ml胰蛋白胨大豆肉汤，Hardy Diagnostics，Santa Maria，CA)37℃培养18小时。通过离心(8000rpm，15分钟)清洗培养物，然后重悬在磷酸缓冲液中(“PBS缓冲液”)。
用CaCl2·2H2O配置1％的钙离子溶液。
将人纤维蛋白原(购自Sigma，Aldrich公司，商品号是“F4129”)用pH7.35的咪唑缓冲液(购自Sigma，Aldrich公司，商品号是“I2900”)稀释成0.5％的溶液。
在空气中平衡生物传感器，确保生物传感器的量级大于-15db，并且稳定。在空气中平衡后，将329μl的0.5％的纤维蛋白原溶液和121μl的1％的钙离子溶液混合，加入到生物传感器的舱(pod)中，平衡30分钟。作为对照，在上述壳中加入50μl的水。反应30分钟，记录的结果如图2的感应谱所示。X轴上的0点表示的是注入水的点。没检测到相或速度的变化。
倒空生物传感器的壳，然后把450μl的纤维蛋白原和钙离子混合物加入生物传感器的壳中，平衡30分钟。平衡后，加入50μl浓度为500cfu/ml的金黄色葡萄球菌溶液，并且监测信号30分钟。由生物传感器记录得到的感应谱如表3a所示。
实施例2重复实施例1中所介绍的方法，所用的金黄色葡萄球菌的浓度是5000cfu/ml。由生物传感器记录的感应谱如表3b所示。
实施例3重复实施例1中所介绍的程序，所用的金黄色葡萄球菌的浓度是50000cfu/ml。由生物传感器记录的感应谱如表3c所示。
实施例4重复实施例1中所介绍的程序(即金黄色葡萄球菌的浓度是500cfu/ml)，但采用的是聚苯乙烯波导，而不是聚酰亚胺波导。由生物传感器记录的感应谱如表4a所示。
实施例5重复实施例2中所介绍的程序(即金黄色葡萄球菌的浓度是5000cfu/ml)，但采用的是聚苯乙烯波导，而不是聚酰亚胺波导。由生物传感器记录的感应谱如表4b所示。
实施例6重复实施例3中所介绍的程序(即金黄色葡萄球菌的浓度是50000cfu/ml)，但采用的是聚苯乙烯波导，而不是聚酰亚胺波导。由生物传感器记录的感应谱如表4c所示。
和图2比较，图3a-3c和图4a-4c的每一个感应图描述的是注入金黄色葡萄球菌后的下坡相移结果。通过用起点的相值(即0)减去30分钟终点时的相值，可以计算出相移的量级。不同浓度金黄色葡萄球菌在30分钟时的相移在图5中描述了。
图6表示的是金黄色葡萄球菌浓度和利用聚酰亚胺波导时传播速度变化的线性关系。传播速度的计算根据和本申请共同未决的申请专利律师档案号.58927中所介绍的进行，该申请题为“通过表面声波传感器估算传播速度”，其和本发明同一天提出申请。
实施例7实施例7证明了利用纤维蛋白原结合已经结合在生物传感器表面的金黄色葡萄球菌，能放大检测信号。
用100mM缓冲盐溶液(购自Sigma公司，商标号是“CHES”，pH＝9)将兔金黄色葡萄球菌抗体(购自Accurate chemical and Scientific公司，Westbury，NY，商品号是“Axell”YVS6881，H6161)稀释成50μg/ml，制备金黄色葡萄球菌反应物层。将这种溶液的15μl等分放在传感器作用侧。用相似的方式将鸡IgY抗体(购自Jackson Immunoresearch公司，West Grove，PA，商品号是“ChromPur protein IgY”)稀释，将其放置在参比侧。将抗体和固定层反应30分钟。首先，用含0.1％(V/V)聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯(购自Sigma公司，商品号是“Tween 20”)的PBS缓冲液清洗传感器，然后只用PBS缓冲液清洗。将传感器贮存在PBS缓冲液中。
对于SH-SAW生物传感器3，流水线上包括一个6个孔的阀门，微量进样器与之相连，将缓冲液传递到传感器中，同时将废液吸回。在这六个孔的阀门上连上另一个环，用来注入细菌。而另一个连接在六孔阀门上的环是用来注入纤维蛋白原的。开关控制注射环。
在每次试验开始，将传感器放置的传感器舱内，传感器舱和电子板相连。微量进样器以5ml/min的速度将缓冲液注入，冲走任何气泡。然后将速度调到0.03ml/min。在每次试验开始的时候，上样含细菌的样品，直到手动开关时，在环上还残留有样品。到第45个数据点时，用缓冲液平衡该系统，每个数据点30秒钟。在这个数据点时，用手动开关将含1000cfu/ml金黄色葡萄球菌的样品注入。当样品继续流的时候，将纤维蛋白原从六孔阀门的另一个环上上样，并保留在环上，直到手动开关。细菌堵上后，用缓冲液再次平衡系统，流速是0.03ml/min，一直到第70个数据点时，这时候采用手动开关使纤维蛋白原流过传感器。根据注入的体积可以改变环的大小。流过传感器的注入体积可以是250μl(花费8分钟)，350μl(花费14分钟)或500μl(花费20分钟)。纤维蛋白原的浓度可以在0.1-0.5％之间变化，而注入环的变化和细菌环的变化类似。收集整个试验的相和量级的数据，按如下方法进行处理。
相移被计算成纤维蛋白原注射点相位和纤维蛋白原注射8分钟内样品数(注射点+30个数据点)的相位之间的差异。对于20分钟的阻塞，相移计算的是注射点相位和样品数(注入点+54个数据点)相位的差异。研究发现，仅仅相移显示与金黄色葡萄球菌浓度在统计学上的对应关系差。
通过对随机挑取的19个试验数据进行检查，发现在相移和纤维蛋白原注入之前相位的移动相关，其中挑取的19个试验数据中，6个没有注入细菌，13个注入了细菌。为了对这种效果进行定量，利用基波回归对整个相响应进行建模。计算出纤维蛋白原注入时间的相导，用来对注入前的相位移动进行定量。然后利用回归对相位移动和细菌浓度的关系以及注入时相导进行定量。
从回归中发现，注入前最初的相导对相位移动具有统计学上的意义。这种作用足够显著，以至于很难将注射纤维蛋白原引发的相响应从整个相响应中分出来。
根据这个分析，开发了一种算法，并且用来对校正注入前最初相位的移动的修改的相移进行定义。这种算法被开发成软件，可以通过商业途径从Math Works获得，商品号是”MATLAB”。这种算法包括过滤数据集，去掉离群值。
通过如下方式计算传感器相位移动利用合适的非线性模型把波相数据响应作为时间的函数建模。
计算初次注入纤维蛋白原时(即注入点)相移的一阶导数；并且计算从纤维蛋白原第一次注入的点到全部纤维蛋白原通过感应面的点的整个相移；和从回归方程计算由于传感器漂移(如线性)导致的估算的相移，该回归方程能定量相移和传感器漂移之间的关系；和通过从整个相移中减去由于传感器漂移导致的估算的相移，而计算修改的相移。
对相响应建模的非线性的合适模型有基板回归模型，神经网络模型，多元适应性模型，回归样条模型等。
计算所有19个试验的修改的相移。比较不含金黄色葡萄球菌样品和含1000cfu/ml金黄色葡萄球菌样品的修改的相移。
通过对差异进行分析，可以确定E0(不含金黄色葡萄球菌)和E3(含有1000cfu/ml的金黄色葡萄球菌)差异的95％的置信区间是[-3.58，-0.92]，均值是-2.25。换句话说，注入E3产生的修改的相移比注入E0产生的修改的相移高2.25，这种差异具有统计学意义。因此，利用修改的相移可以将金黄色葡萄球菌的E3注入和空白的E0注入区别开来。
这些实施例表明可以检测低水平的金黄色葡萄球菌(如500cfu/ml0。这些实施例也表明和经典的试管和玻片试验相比，本发明可以在少于30分钟这样相对短的时间内检测到金黄色葡萄球菌。在大约25℃-大约15℃时，检测的灵敏度和时间可以增大和改进。可以增加纤维蛋白原的浓度来提高反应速率。
此处引用的专利，专利申请以及出版物公开的完整内容一并引作参考，如他们单个引作参考一样。很显然本领域的技术人员可以对本发明作不同的修改和改动，而不偏离本发明的范围和精神。应该理解，本发明提出来用作例证的实施方案和实施例不是想对本发明做不适当的限制，提出这些实施例和实施方案只是为了举例，本发明的范围仅是靠下面提出的权利要求来限制。
权利要求
1.检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的方法，包括下列步骤提供测试样品；提供金黄色葡萄球菌反应物；组合测试样品和金黄色葡萄球菌反应物，其中含有金黄色葡萄球菌的测试样品产生至少一种物理性质的变化；和用水平剪切表面声波生物传感器检测这些变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中测试样品包含的金黄色葡萄球菌的浓度少于大约5×104cfu/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其中测试样品包含的金黄色葡萄球菌的浓度少于大约5×103cfu/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其中测试样品包含的金黄色葡萄球菌的浓度少于大约1000cfu/ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其中测试样品包含的金黄色葡萄球菌的浓度大约是500cfu/ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其中检测时间小于大约150分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其中检测时间小于大约100分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其中检测时间小于大约60分钟。
9.根据权利要求1所述的方法，其中检测时间大约是30分钟。
10.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种物理性质的变化是粘性的变化。
11.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种物理性质的变化是结合质量的变化。
12.根据权利要求1所述的方法，其中检测包括波相的变化。
13.根据权利要求1所述的方法，其中检测包括波速的变化。
14.根据权利要求1所述的方法，其中测试样品的体积从大约0.5ml到大约1.5ml。
15.根据权利要求1所述的方法，其中将测试样品和培养基温度结合的步骤是在大约5℃-大约37℃的温度下进行的。
16.根据权利要求1所述的方法，其中将测试样品和培养基温度结合的步骤是在大约15℃-大约25℃的温度下进行的。
17.根据权利要求1所述的方法，其中测试样品进一步包括的钙离子的浓度是大约0.1wt％-大约2wt％。
18.根据权利要求1所述的方法，其中生物传感器包括聚合物波导。
19.根据权利要求18所述的方法，其中生物传感器包括的波导选自聚酰亚胺和聚苯乙烯。
20.根据权利要求1所述的方法，其中金黄色葡萄球菌反应物包括纤维蛋白原。
21.根据权利要求20所述的方法，其中纤维蛋白原的浓度是0.0001wt％-5wt％。
22.根据权利要求1所述的方法，其中金黄色葡萄球菌反应物包括血浆。
23.根据权利要求22所述的方法，其中血浆选自人血浆和动物血浆。
24.根据权利要求1所述的方法，其中金黄色葡萄球菌反应物包括纤维蛋白原溶液。
25.根据权利要求1所述的方法，其中金黄色葡萄球菌反应物是以液体形式提供的。
26.根据权利要求1所述的方法，其中往生物传感器中提供金黄色葡萄球菌反应物后，接着提供测试样品。
27.根据权利要求1所述的方法，其中往生物传感器中提供测试样品后，接着提供金黄色葡萄球菌反应物。
28.根据权利要求1所述的方法，其中将测试样品和金黄色葡萄球菌反应物组合的步骤导致形成固体。
29.检测金黄色葡萄球菌的方法，包括下列步骤提供测试样品；提供纤维蛋白原；组合测试样品和纤维蛋白原，其中含有金黄色葡萄球菌的测试样品产生至少一种物理变化；和用声机械生物传感器检测这些变化。
30.根据权利要求29所述的方法，其中生物传感器包括含有与固定层反应的金黄色葡萄球菌抗体的感应面。
31.根据权利要求30所述的方法，其中纤维蛋白原放大结合到感应面的金黄色葡萄球菌的检测。
32.根据权利要求31所述的方法，其中的检测包括波相移动。
33.根据权利要求32所述的方法，其中从传感器响应中分出传感器漂移，计算出修改的波相移。
34.根据权利要求33所述的方法，其中修改的波相移动的算法包括过滤波相数据，去掉离群值；通过如下方式计算传感器漂移利用合适的非线性模型把波相数据响应作为时间函数建模；计算第一次提供纤维蛋白原点处相移的一阶导数；和计算从纤维蛋白原第一次提供的点到全部纤维蛋白原通过感应面的点的整个相移；和从回归方程计算由于传感器漂移导致的估算的相移，该回归方程能定量相移和传感器漂移之间的关系；和通过从整个相移中减去由于传感器漂移导致的估算的相移，而计算修改的相移。
全文摘要
本发明涉及葡萄球菌的检测方法。
文档编号G01N33/567GK1922489SQ200480042206
公开日2007年2月28日 申请日期2004年12月17日 优先权日2003年12月30日
发明者布林达·B·拉克希米, 帕特里克·A·马赫, 达萨拉塔·V·斯里达尔, 安哥拉·K·迪洛, 本托·M·弗里, 约翰·S·赫伊津哈 申请人:3M创新有限公司