专利名称：水产品中金黄色葡萄球菌的双重pcr-dhplc检测方法
技术领域：
本发明涉及一种金黄色葡萄球菌检测方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌是一类重要的食源性致病菌，广泛存在于空气、土壤、水以及人和动物的体表黏膜等。据美国CDC报告，金葡菌引起的食物中毒仅次于大肠埃希菌，已居第2 位，占细菌性食物中毒的33%，而由金葡菌污染引起的食物中毒事件在我国也是高频多发。 显而易见，金葡菌的污染已成为世界性的公共卫生问题。因而，建立特异灵敏、快速便捷的检测技术已成为有效控制食品中金葡菌污染与传播的关键所在。金葡菌能产生多种毒素，如肠毒素、表皮剥脱毒素、杀白细胞素和毒性休克综合征毒素等，其中肠毒素是引起金葡菌食物中毒的主要原因。该毒素一旦侵入人体，即使无活的金葡菌存在，也会引起人类恶心、呕吐等严重的食物中毒，而且该肠毒素在100°C条件下经过30min热处理仍能保持致病性。金葡菌可产生A、B、C、D、E等多种肠毒素，以A型肠毒素引起的食物中毒事件最多，其毒力也最强。鉴于金葡菌对食品安全的高度危害性，各国对人工养殖及海捕水产品均有严格的限量要求，多规定为不得检出或小于50个/克。然而， 该菌超标问题时常困扰着出口水产加工企业，成为制约企业发展和经济效益提高的一大障碍，也使其成为检验检疫部门重点监控的项目之一。水产品中金葡菌的传统检测方法包括增菌、生化鉴定、血清学鉴定等，不仅检测周期长、操作繁琐，而且不宜做大批量样本的检测，在水产养殖环境监测等其他需大批量检测的方面，传统的检测方法暴露出其种种弊端。随着分子生物学的发展，PCR技术的产生使得食品中金葡菌的快速检测达到了一个新的高度。金葡菌的耐热核酸酶基因已被证实具有非常好的种属特异性，以此作为靶基因进行PCR检测，也可避免检测酶活性时出现的假阳性现象。这类文献可以参考申请号为200910010798. 7的中国发明专利申请公开《食品中金黄色葡萄球菌毒素基因的检测试剂盒及检测方法》(公开号为CN101580873A)，也可以参考申请号为200910041301. 8的中国发明专利申请公开《金黄色葡萄球菌的多重PCR-MIX快速检测试剂盒及检测方法》(公开号为CN101613745A)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种自动化检测的水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法，通过该方法还能同时判断菌株致病性强弱。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法，其特征在于包括如下步骤①金黄色葡萄球菌培养，将待测水产样品与增菌液混合，进行培养；②金葡菌基因组DNA的提取；③引物的设计
根据Genbank中金葡菌的sea和nuc基因序列，利用Primer5. 0软件设计2对特异性引物，如下Sea-F 5，-AGTCTGAATTGCAGGGAAC-3，，sea-R 5' -CACCACCATACATACAAGC-3，；nuc-F 5’ -CTTGCTATGATTGTGGTAGC-3 ’，nuc-R 5' -CTAGCAAGTCCCTTTTCCAC-3，；④以金葡菌基因组DNA为模板，进行双重PCR扩增；⑤PCR产物的DHPLC检测，得到DHPLC峰型图谱，供分析鉴定。作为优选，步骤①中所述的金黄色葡萄球菌培养如下取样品ImL与IOmL 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤混合，于36°C 士 1 °C培养1 Mh，其中，待测样品与增菌液之间体积配比为1 10。作为优选，步骤①中所述的金葡菌基因组DNA的提取，如下取培养后的增菌液lmL，离心，去除上清，得到沉淀用溶葡菌酶进行预处理Ih ’然后按照细菌DNA提取试剂盒的说明书提取金葡菌基因组DNA。作为优选，步骤④双重PCR扩增条件如下双重 PCR 反应体系含 20mM Mg2+ 的 10 X PCR Buffer 5 μ L, IOmM 的 dNTP 2 μ L，两对50 μ M的引物各0. 5 μ L，2u · μ Γ1的Ex Taq酶1 μ L，模板DNA 2 μ L，最后用ddH20将反应总体积补足至50 μ L ；双重PCR反应程序95 "C预变性5min ；95 "C变性45s，60 °C退火lmin，72 "C延伸 Imin，35 个循环，72°C 延伸 IOmin，4°C 保存。作为优选，步骤⑤中DHPLC检测如下PCR产物上样量5 μ L ；色谱柱为PS-DVB C18DNASep色谱柱，并且，该色谱柱满足4. 6mm X 50mm, 3 μ m ；柱温为50°C ；流速为0. 9mL/min ；流动相缓冲溶液A体积分数为50. 2 %，缓冲溶液B体积分数为49. 8%;缓冲液A 为50mL ΤΕΑΑ、250 μ L乙腈，去离子水定容至IOOOmL,缓冲液B为50mL TEAA、250mL乙腈，去离子水定容至IOOOmL ；检测器为荧光检测器，光源150W Xenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽 15. 3nm ；检测灵敏度在波长350nm积分2s ；系统自动按照线性递增的方式将DNASep柱上的DNA分子洗脱下来，在波长^Onm 处读取吸光值，经系统自动处理后，形成DHPLC峰型图谱。与现有技术相比，本发明的优点在于PCR % ^ 1 ^L if 才百 fe if (Denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)方法有机结合，并根据金黄色葡萄球菌中的特异性基因nuc和肠毒素A基因sea的保守区序列设计特异性引物，通过双重PCR体系的建立与优化以及DHPLC 技术的以实现水产品中金黄色葡萄球菌的高通量、自动化检测，而且也可通过对肠毒素基因的分析，方便地判断出该菌株致病性的强弱。整体检测方法简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的，同时避免了 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测时，EB或者Goldview对人体和环境带来的潜在危害；PCR-DHPLC检测方法与传统微生物检验方法以及PCR-凝胶电泳法相比，具有灵敏性高、特异性强、快速准确、结果分析简单，对待样品要求不高，可进行大通量检测等优点。
图1为sea-F/sea-R引物扩增金葡菌标准菌株ATCC 13565的单重PCR-DHPLC结果图谱。图2为nuc-F/nuc-R引物的扩增金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 13565的单重 PCR-DHPLC 图谱。图3为双重PCR-DHPLC检测各参试菌株的图谱。图4为利用本发明进行灵敏性试验的结果图谱。图5为普通凝胶电泳检测金葡菌双重PCR的灵敏性试验的结果示意图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。1.取25g虾仁样品，剪碎后分别与225mL增菌液混合，于36°C 士 1°C培养18h 24h ；2.取上述增菌液lmL，12000rpm离心3min，去除上清，将所得沉淀用溶葡菌酶进行预处理lh，然后按照细菌DNA提取试剂盒的说明书提取金黄色葡萄球菌DNA ；3.引物sea_F :5，-AGTCTGAATTGCAGGGAAC-3，，sea-R 5’ -CACCACCATACATACAAGC-3 ’，nuc-F 5’ -CTTGCTATGATTGTGGTAGC-3 ’，nuc-R 5' -CTAGCAAGTCCCTTTTCCAC-3，；4.扩增反应体系10 X PCR Buffer (含 20mM Mg2+) 5 μ L, dNTP (IOmM) 2 μ L，两对引物(50 μ Μ)各 0· 5 μ L，Ex Taq g| (2u · μ Γ1) 1 μ L，模板 DNA 2 μ L，最后用 ddH20 将反应总体积补足至50 μ L。5.扩增反应程序95°C预变性5min ；95°C变性45s，60°C退火lmin，72°C延伸 Imin，35 个循环，72°C 延伸 IOmin，4°C 保存。6. PCR 产物的 DHPLC 检测PCR产物上样量5 μ L ；色谱柱为PS-DVB C18DNASep色谱柱，并且，该色谱柱满足4. 6mm X 50mm, 3 μ m ；柱温为50°C;流速为0. 9mL/min ；流动相缓冲溶液A体积分数为50. 2 %，缓冲溶液B体积分数为49. 8%;缓冲液A 为50mL ΤΕΑΑ、250 μ L乙腈，去离子水定容至IOOOmL,缓冲液B为50mL TEAA、250mL乙腈，去离子水定容至IOOOmL ；检测器为荧光检测器，光源150W Xenon灯；激发谱带宽15nm;发射谱带宽 15. 3nm ；检测灵敏度在波长350nm积分2s ；
5
系统自动按照线性递增的方式将DNASep柱上的DNA分子洗脱下来，在波长^Onm 处读取吸光值，经系统自动处理后，形成DHPLC峰型图谱。分析所获得的峰型图谱，进行结果判定。如图1所示，sea-F/sea-R引物扩增金葡菌标准菌株ATCC 13565的单重 PCR-DHPLC结果；如图2所示，nuc-F/nuc-R引物的扩增金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC 13565的单重PCR-DHPLC结果。如图3所示，双重PCR-DHPLC检测各参试菌株的结果，1 =ATCC 13565，2 产肠毒素 A的金葡菌分离株STA004，3 不产肠毒素A的金葡菌标准菌株ATCC 6538,4-8分别为产肠毒素大肠杆菌，副溶血弧菌，霍乱弧菌，鼠伤寒沙门氏菌，单核细胞增生性李斯特菌。如图4所示，利用本发明进行灵敏性试验的结果，检测灵敏度为5X101cfu/mL菌液浓度。如图5所示，普通凝胶电泳检测金葡菌双重PCR的灵敏性试验的结果，M =EX 2000 Marker ； 1 :negative control ；2 5X 105cfu/mL ；3 5X 104cfu/mL ；4 5X 103cfu/mL ；5 5X102cfu/mL ；6 :5X 101cfu/mL ；7 :5X 100cfu/mLo
权利要求
1.一种水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法，其特征在于包括如下步骤①金黄色葡萄球菌培养，将待测水产样品与增菌液混合，进行培养；②金葡菌基因组DNA的提取；③引物的设计根据Genbank中金葡菌的sea和nuc基因序列，利用ft~imer5. 0软件设计2对特异性引物，如下sea-F :5’ -AGTCTGAATTGCAGGGAAC-3，， sea-R :5’ -CACCACCATACATACAAGC-3’ ； nuc-F :5’ -CTTGCTATGATTGTGGTAGC-3’， nuc-R :5’ -CTAGCAAGTCCCTTTTCCAC-3，；④以金葡菌基因组DNA为模板，进行双重PCR扩增；⑤PCR产物的DHPLC检测，得到DHPLC峰型图谱，供分析鉴定。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤①中所述的金黄色葡萄球菌培养如下取样品ImL与IOmL 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤混合，于36°C 士 1°C培养18h Μι， 其中，待测样品与增菌液之间体积配比为1 10。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤①中所述的金葡菌基因组DNA的提取，如下取培养后的增菌液lmL，离心，去除上清，得到沉淀用溶葡菌酶进行预处理Ih ；然后按照细菌DNA提取试剂盒的说明书提取金葡菌基因组DNA。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤④双重PCR扩增条件如下 双重 PCR 反应体系含 20mM Mg2+的 10XPCR Buffer 5 μ L，IOmM 的 dNTP 2yL，两对50 μ M的引物各0. 5 μ L，2u · μ Γ1的Ex Taq酶1 μ L，模板DNA 2 μ L，最后用ddH20将反应总体积补足至50 μ L ；双重PCR反应程序95°C预变性5min ；95°C变性45s，60°C退火lmin，72°C延伸lmin，;35 个循环，72°C延伸10min，4°C保存。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤⑤中DHPLC检测如下 PCR产物上样量5 μ L ；色谱柱为PS-DVB C18DNASep色谱柱，并且，该色谱柱满足4. 6mm X 50mm, 3 μ m ； 柱温为50°C ； 流速为 0. 9mL/min ；流动相缓冲溶液A体积分数为50.2%，缓冲溶液B体积分数为49. 8% ；缓冲液A为 50mL ΤΕΑΑ、250 μ L乙腈，去离子水定容至IOOOmL,缓冲液B为50mL TEAA、250mL乙腈，去离子水定容至IOOOmL ；检测器为荧光检测器，光源150W Xenon灯；激发谱带宽15nm ；发射谱带宽15. 3nm ； 检测灵敏度在波长350nm积分Is ；系统自动按照线性递增的方式将DNASep柱上的DNA分子洗脱下来，在波长^Onm处读取吸光值，经系统自动处理后，形成DHPLC峰型图谱。
全文摘要
一种水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法，其特征在于包括如下步骤①金黄色葡萄球菌培养，将待测水产样品与增菌液混合，进行培养；②金葡菌基因组DNA的提取；③引物的设计④以金葡菌基因组DNA为模板，进行双重PCR扩增；⑤PCR产物的DHPLC检测，得到DHPLC峰型图谱，供分析鉴定。整体检测方法简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的。
文档编号G01N30/02GK102399897SQ20111040245
公开日2012年4月4日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者万婧, 周向阳, 张静, 沈飚, 胡兴娟, 邵宏宏, 颜建波 申请人:中华人民共和国舟山出入境检验检疫局