一种酶催化制备n-溴乙酰-7-氨基头孢烷酸的方法
【专利摘要】本发明属于酶催化及生物制药领域，公开了一种酶催化制备N?溴乙酰?7?氨基头孢烷酸的方法，包括如下步骤：将7?氨基头孢烷酸和酰基供体加入缓冲液中混合均匀后，再加入固定化青霉素酰化酶进行反应，反应后经分离得到N?溴乙酰?7?氨基头孢烷酸。本发明方法具有反应条件温和、环境友好、工艺简单，且目标产物产率高等优点。
【专利说明】
一种酶催化制备N-溴乙酰-7-氨基头孢烷酸的方法
技术领域
[0001]本发明属于酶催化及生物制药领域，具体涉及一种青霉素酰化酶催化制备N-溴乙酰-7-氨基头孢烷酸的方法。
【背景技术】
[0002]头孢硫脒是我国首个自主研发成功的半合成头孢菌素。头孢硫脒是一种广谱抗菌剂，对大部分革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌均具有较强的杀灭作用，尤其是对肠球菌杀灭效果超过临床所用同类品种。此外，头孢硫脒还对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林表皮葡萄球菌感染也表现出一定的疗效(中国抗生素杂志，2005,30(2): 107)。临床研究表明，头孢硫脒具有血药浓度高、临床疗效好等特点。近年来，头孢硫脒的市场呈稳步增长的态势。然而，当前工业上头孢硫脒仍采用化学法生产，包括两步:(I)以7-氨基头孢烷酸(7-ACA)为原料，在低温下加入高活性的溴乙酰溴，制备N-溴乙酰-7-ACA; (2)N_溴乙酰-7-ACA与N，N’_二异丙基硫脲缩合得到头孢硫脒(中国医药工业杂志，1978，9(4):1)。或者以氯乙酰氯替代溴乙酰溴，通过类似的化学酰化及缩合工艺制备得到头孢硫脒(中国医药工业杂志，2009，40(12):888;CN 102285999 B；CN 101486718 B)，但氯乙酰基中的氯活性较低，导致第二步缩合反应收率低，故在工业上，头孢硫脒合成的第一步仍采用溴乙酰溴作为酰基供体。另一种合成头孢硫脒的方法则是先合成侧链I，3_二异丙基脒基-2-硫代-乙酸盐酸盐，然后再经VilsmeieH式剂活化后，最后与带有保护基的7-ACA缩合，脱保护后，得到头孢硫脒(中国药物化学杂志，2001，11 (5): 293 ;CN 101704827 B)；虽然该合成途径路线的目标产物收率相对较高(56%)，但其操作繁杂，条件较苛刻，所用硅烷化试剂昂贵，成本较高;并且活化过程需要采用三光气和三苯基氧磷等高毒性活泼试剂，而且还要使用甲苯、二甲苯、氯苯、二氯苯等高毒性试剂。因此，化学法制备头孢硫脒不仅需要使用高活性的酰基供体(酰氯或酰溴)、挥发性有机溶剂及碱，并且需要低温反应，其反应条件苛刻、过程复杂、环境污染严重，不符合当前可持续社会和环境发展的要求。此外，化学法制备头孢硫脒关键中间体——N-溴乙酰-7-ACA的产率通常不理想，最高仅为73% (中国现代应用药学，2010 27⑵:126)。
【发明内容】
[0003]为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种绿色、简单且高效的酶催化制备N-溴乙酰-7-ACA的方法。
[0004]本发明采用如下技术方案:
[0005]—种酶催化制备N-溴乙酰-7-氨基头孢烷酸(头孢硫脒关键中间体)的方法，包括如下步骤:将7-ACA和酰基供体加入缓冲液中混合均匀后，再加入固定化青霉素酰化酶进行反应，反应后经分离得到N-溴乙酰-7-ACA。
[0006]所述酰基供体为溴乙酸烷基酯或溴乙酰胺。
[0007]所述溴乙酸烷基酯的烷基链长为Cl?C6。
[0008]所述溴乙酸烷基酯为溴乙酸甲酯或溴乙酸乙酯。
[0009]所述7-ACA 浓度为 20mM ?70mM。
[0010]所述7-ACA与酰基供体的摩尔比为1:1?1:6。
[0011 ] 反应条件为温度10°C?40°C，反应时间Ih?24h，振荡速度150r/min?300r/min。
[0012]所述固定化青霉素酰化酶的用量为2U/mL?5U/mL。
[0013]所述固定化青霉素酰化酶为青霉素G酰化酶I1、青霉素G酰化酶IV、青霉素酰化酶SIPA-1I1、青霉素酰化酶SIPA-1V、青霉素酰化酶SIPA-V或青霉素酰化酶PGA-750。
[0014]优选地，所述7-ACA与酰基供体的摩尔比为1:2?1:3;所述固定化青霉素酰化酶为青霉素酰化酶PGA-750;酶用量为3U/mL?5U/mL;反应时间为Ih?5h。
[0015]所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，pH为5.0?9.0。
[0016]目标产物分离方法为反应结束后，过滤除酶，滤液中加入盐酸调节pH至0.5?2.0，过滤、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-7-ACA。
[0017]与现有的技术相比，本发明具有如下的优点:
[0018]I)采用高效的生物催化剂——青霉素酰化酶催化制备N-溴乙酰-7-ACA。
[0019]酶作为一种天然的生物催化剂能有效地降低反应活化能，故仅需使用活性中等的溴乙酸烷基酯或溴乙酰胺等作为酰基供体，无需使用高活性的溴乙酰溴或氯乙酰氯，从而极大地提高了反应的安全性。
[0020]2)酶是易生物降解的生物大分子，克服了化学催化剂环境不友好的缺点。
[0021]3)本发明反应过程简单易控，且以廉价易得、且环境友好的水溶液作为反应介质，无需使用有机溶剂。
[0022]4)本发明以固定化青霉素酰化酶作为催化剂，在反应结束后可以通过简单的过滤回收固定化酶，既可实现生物催化剂的重复利用，又易于产物的分离纯化。
[0023]5)本发明反应条件温和，头孢母核7-ACA在反应过程中不易发生分解，故产品品质尚O
【附图说明】
[0024]图1为反应前液相色谱图。
[°°25]图2为反应后液相色谱图。
[0026]图3为N-漠乙醜_7-ACA标准品液相色谱图。
【具体实施方式】
[0027]通过实施例进一步说明本发明。
[0028]实施例1
[0029]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入30U青霉素G酰化酶II(购于石药集团)，于20°C及200r/min下反应。Ilh后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为34%。
[0030]实施例2
[0031]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5),40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入30U青霉素G酰化酶IV(购于石药集团)，于20°C及200r/min下反应。7h后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为32 %。
[0032]实施例3
[0033]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入30U青霉素酰化酶PGA-750(购于浙江顺风海德尔有限公司)，于20°C及200r/min下反应。3h后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为91 %。反应前后液相色谱图分别如附图1及附图2所示，7-ACA和N-溴乙酰-7-ACA的保留时间分别为2.58及4.1Omin。随后，过滤除酶，滤液中加入盐酸调节pH至1.0，过滤、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-740六，收率为88%。
[0034]实施例4
[0035]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5),40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入30U青霉素酰化酶SIPA-1IK购于湖南福来格生物技术有限公司)，于20°C及200r/min下反应。Ilh后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为32%。
[0036]实施例5
[0037]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入30U青霉素酰化酶SIPA-1V(购于湖南福来格生物技术有限公司)，于20°C及200r/min下反应。Ilh后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为52%。
[0038]实施例6
[0039]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入30U青霉素酰化酶SIPA-V(购于湖南福来格生物技术有限公司)，于20°(:及20(^/1^11下反应。2411后，液相色谱分析表明1溴乙酰-7404产率为16%。
[0040]实施例7
[0041 ] 在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5),40mM7_ACA及120mM溴乙酸乙酯，混合均匀，随后加入30U青霉素酰化酶PGA-750，于20°C及200r/min下反应。5h后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为87%。随后，过滤除酶，滤液中加入盐酸调节pH至1.0，过滤、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-7-ACA，收率为85 %。
[0042]实施例8
[0043]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酰胺，混合均匀，随后加入30U青霉素酰化酶PGA-750，于20°C及200r/min下反应。5h后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为84%。随后，过滤除酶，滤液中加入盐酸调节pH至1.0，过滤、水洗、干燥，即得N-漠乙醜-7-ACA，收率为83 %。
[0044]实施例9
[0045]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.5)、40mM7_ACA及40mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入30U青霉素酰化酶PGA-750，于20°C及200r/min下反应。Ih后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为53%。
[0046]实施例10
[0047]在50mL带盖三角瓶中加入1mLTris-HCl缓冲液(10mM,pH 9.0)、40mM 7-ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入30U青霉素酰化酶PGA-750，于20°C及200r/min下反应。2h后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为88%。随后，过滤除酶，滤液中加入盐酸调节pH至1.0，过滤、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-7-ACA，收率为88 %。
[0048]实施例11
[0049]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5)、40mM7_ACA及120mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入30U青霉素酰化酶PGA-750，于40°C及200r/min下反应。Ih后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为73%。
[0050]实施例12
[0051 ] 在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5)、40mM7-ACA&100mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入30U青霉素酰化酶PGA-750，于20°C及200r/min下反应。3h后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为85%。随后，过滤除酶，滤液中加入盐酸调节pH至1.0，过滤、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-7-ACA，收率为83 %。
[0052]实施例13
[0053]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5)、60mM7_ACA及180mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入30U青霉素酰化酶PGA-750，于20°C及200r/min下反应。5h后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为79 %。
[0054]实施例14
[0055]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5)、50mM7_ACA及150mM溴乙酸甲酯，混合均匀，随后加入40U青霉素酰化酶PGA-750，于20°C及200r/min下反应。2h后，液相色谱分析表明N-溴乙酰-7-ACA产率为85%。随后，过滤除酶，滤液中加入盐酸调节pH至1.0，过滤、水洗、干燥，即得N-溴乙酰-7-ACA，收率为82 %。
[0056]对比例
[0057]在50mL带盖三角瓶中加入1mL磷酸盐缓冲液(10mM,pH 7.5)、40mM7-ACA&100mM溴乙酸甲酯，混合均匀，于20 °C &200r/min下反应。24h后，仍未见目标产物N-溴乙酰-7-ACA生成。
【主权项】
1.一种酶催化制备N-溴乙酰-7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤:将7-氨基头孢烷酸和酰基供体加入缓冲液中混合均匀后，再加入固定化青霉素酰化酶进行反应，反应后经分离得到N-溴乙酰-7-氨基头孢烷酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酰基供体为溴乙酸烷基酯或溴乙酰胺。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述溴乙酸烷基酯的烷基链长为Cl?C6。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溴乙酸烷基酯为溴乙酸甲酯或溴乙酸乙酷。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述7-氨基头孢烷酸浓度为20mM?70mM。6.根据权利要求1?5任意一项所述的方法，其特征在于，所述7-氨基头孢烷酸与酰基供体的摩尔比为1:1?1:6。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，反应条件为温度10°C?40°C，反应时间Ih?24h，振荡速度 150r/min ?300r/min。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述固定化青霉素酰化酶的用量为2U/mL?5U/mL;所述固定化青霉素酰化酶为青霉素G酰化酶I1、青霉素G酰化酶IV、青霉素酰化酶SIPA-1I1、青霉素酰化酶SIPA-1V、青霉素酰化酶SIPA-V或青霉素酰化酶PGA-750。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述7-氨基头孢烷酸与酰基供体的摩尔比为1:2?1:3;所述固定化青霉素酰化酶为青霉素酰化酶PGA-750;酶用量为3U/mL?5U/mL;反应时间为Ih?5h。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液，pH为5.0?9.0。
【文档编号】C12P35/04GK105907829SQ201610392858
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】李宁, 张晓利, 宗敏华, 罗春
【申请人】华南理工大学, 广州白云山医药集团股份有限公司白云山化学制药厂